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चिप seq के प्रयोगों को स्वचालित 10,000 HELA कोशिकाओं पर epigenetic प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए

Published: December 10, 2014 doi: 10.3791/52150
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Diagenode S.A., 2Diagenode Inc.

Introduction

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) प्रौद्योगिकियों व्यापक और अधिक सुलभ हो गए हैं, अब प्रतिलेखन कारक की खोज के लिए सक्षम बनाता है जो NGS का पता लगाने (चिप seq के), द्वारा पीछा immunoprecipitation chromatin है प्रोटीन डीएनए बातचीत के जीनोम चौड़ा मानचित्रण के लिए प्राथमिक विधि हिस्टोन संशोधनों की साइटों या पैटर्न बाध्यकारी। चिप seq के समृद्ध डीएनए टुकड़े की माप के द्वारा प्रोटीन डीएनए बातचीत की मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पूरे जीनोम के उच्च throughput डेटा प्रदान करने में लाभदायक है। हालांकि, इस तरह के एक अनुक्रमण पुस्तकालय बनाने के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने में कठिनाई के रूप में मानक चिप seq के प्रयोगों में कुछ नुकसान कर रहे हैं।

चिप प्रयोगों, सेल और immunocomplexes के sonication द्वारा क्रोमेटिन बाल काटना, 3) के गठन शामिल है, जो 2) नमूना तैयार 1) crosslinking प्रोटीन डीएनए बाध्यकारी क्षेत्रों सहित छह बुनियादी कदम में बांटा जाता हैImmunocomplexes की 4) वर्षा, immunocomplexes की 5) धोने, और qPCR और NGS से समृद्ध सामग्री और विश्लेषण के 6) क्षालन।

अपने आत्मीय प्रतिजन के लिए एंटीबॉडी का एक अच्छा क्रोमेटिन तैयारी, मूल नमूने में प्रतिजन की राशि है, और विशिष्टता और आत्मीयता: एक चिप परख की सफलता के तीन मुख्य कारकों पर निर्भर है। एक प्रमुख सीमा एक अनुक्रमण पुस्तकालय बनाने के लिए पर्याप्त समृद्ध डीएनए को प्राप्त करने के क्रम में सेल नंबर शुरू करने की उच्च मात्रा के लिए आवश्यकता है। ऐसे बायोप्सी नमूने या सेल उप आबादी के रूप में सीमित नमूना मात्रा में है, के साथ काम करने वाले वैज्ञानिकों के लिए, चिप-seq के प्रयोगों बहुत चुनौती दे रहे हैं। कोशिकाओं एक की एक कम राशि, 2 के साथ काम कर रहा है जब हाल के अध्ययनों से चिप seq के assays के प्रदर्शन किया जा सकता है कि पता चला है। Diagenode कोशिकाओं की एक सीमित संख्या के साथ शुरू जब पूरी तरह से चिप seq के प्रयोगों को स्वचालित कर सकते हैं कि एक रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली विकसित की है।

स्वचालन प्रदान करता हैचिप seq के नमूनों की पुस्तिका तैयार करने पर कई फायदे है कि यह मानव त्रुटि घटता है, के रूप में परिवर्तनशीलता को कम कर देता है, और प्रयोगात्मक लागत कम कर देता है। Chromatin immunoprecipitation और पुस्तकालय तैयारी के लिए अर्द्ध स्वचालित प्रोटोकॉल सूचना दी गई है, लेकिन कम सेल नंबर 3, 4, 5, 6 का उपयोग करते समय इन अध्ययनों से कोई डेटा से पता चला है।

इस पत्र में एक पूर्ण स्वचालित कार्यप्रवाह चुंबकीय मनका आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है और कहा कि प्रोटोकॉल अनुकूलन में एकाधिक मापदंडों पता कर सकते हैं कि एक रोबोट तरल हैंडलिंग प्रणाली में chromatin immunoprecipitation और पुस्तकालय तैयारी assays के लिए दोनों में वर्णित है। यहाँ, स्वचालित चिप seq के प्रयोगों को सफलतापूर्वक, सरल बनाने के मानकीकरण, और छोटे सेल आबादी में epigenetic प्रोफाइल के अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय समाधान प्रदान करने के लक्ष्य के साथ कोशिकाओं की एक सीमित संख्या पर प्रदर्शन किया गया। इस पत्र में वर्णित स्वचालित चिप प्रोटोकॉल विशिष्ट हिस्टोन एंटीबॉडी और अभिकर्मकों बी का उपयोग कर हेला कोशिकाओं पर अनुकूलित किया गया हैकार्यप्रवाह ut प्रयोगात्मक अनुकूलन इसी के साथ अन्य सेल लाइनों और एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

1. मानक चिप प्रयोगों

  1. सेल संग्रह और डीएनए प्रोटीन crosslinking।
    1. 80% -90% के संगम को हेला-S3 कोशिकाओं को विकसित। , संस्कृति मध्यम निकालें 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ दो बार पकवान धोने, और सुसंस्कृत थाली करने के लिए trypsin EDTA (1x) जोड़ें। डिश से कोशिकाओं को अलग करने के लिए दो मिनट की एक अधिकतम के लिए सेते हैं। कोशिकाओं को ले लीजिए और 10 एमएल पीबीएस के साथ दो बार धो लें।
      नोट: अब ऊष्मायन बार कोशिका क्षति को बढ़ावा मिलेगा।
    2. 500 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और पीबीएस के 20 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए आगे बढ़ें।
    3. , 500 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 500 μl जोड़ें। नियतन कदम के लिए कोशिकाओं का इष्टतम संख्या पीबीएस के 500 μl प्रति 10 लाख कोशिकाओं है।
    4. सेल निलंबन के 500 μl के प्रत्येक विभाज्य में ताजा 37% formaldehyde के 13.5 μl जोड़ें। आरटी पर आठ मिनट के लिए कोशिकाओं fixate।
    5. 1.25 एम ग्लाइसिन solut के 57 μl जोड़ेंआयन निर्धारण रोकने के लिए। कोमल भंवर द्वारा लगातार मिश्रण के साथ आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। इस बिंदु के बाद से बर्फ पर काम करते हैं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। धीरे सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बर्फ पर सेल गोली रखने के लिए।
  2. सेल और chromatin कर्तन
    1. सेल गोली बर्फ का ठंडा lysis बफर iL1 के 10 मिलीलीटर जोड़ें (1 मिलियन कोशिकाओं प्रति lysis बफर के 1 मिलीलीटर इष्टतम अनुपात है)। पिपेट ऊपर है और कई बार नीचे और कोमल मिश्रण के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. 500 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए lysate अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    3. Lysates करने के लिए बर्फ का ठंडा lysis बफर IL2 के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए lysates सेते हैं।
    4. 500 XG पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    5. PrepaIS1 बाल काटना बफर करने के लिए 200x protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल (पीआईसी) जोड़कर पूरा कर्तन बफर पुनः। 5 मिनट के लिए बर्फ पर बफर रखें और बाद में बर्फ पर काम करते हैं। गोली प्रत्येक 10 लाख कोशिकाओं को पूरा IS1 बाल काटना बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण। 10 मिनट के नमूने की चिपचिपाहट कम करने के लिए sonication के करने से पहले बर्फ पर नमूने सेते हैं।
    6. 10 चक्र प्रत्येक के 2 से 3 सेट के लिए एक पानी के स्नान sonicator का उपयोग कर sonication द्वारा chromatin के 300 μl aliquots के कतरनी। एक चक्र 30 सेकंड "पर" और एक उच्च शक्ति की स्थापना पर 30 सेकंड "बंद" के होते हैं। वैकल्पिक रूप से, 30 सेकंड "पर", 30 सेकंड "बंद" का 5 से 10 चक्रों की एक छोटी sonication के समय के साथ एक पिको-sonication के डिवाइस का उपयोग करें। संक्षेप में भंवर रन के बीच ट्यूब स्पिन और। Sonicators के अन्य प्रकार का उपयोग करते समय, क्रोमेटिन कर्तन के लिए निर्माता के निर्देशों इसी का पालन करें।
    7. 10 मिनट और सी के लिए 16,000 XG पर sheared क्रोमेटिन अपकेंद्रित्रआईपी ​​चरण में तुरंत इस्तेमाल किया जा करने के लिए सतह पर तैरनेवाला ollect। वैकल्पिक रूप से, भविष्य में उपयोग के लिए 2 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रोमेटिन की दुकान।
    8. पूर्व 1-1.5% TAE agarose जैल या bionalyzer का उपयोग कर immunoprecipitation के कदम को क्रोमेटिन बाल काटना दक्षता का विश्लेषण करें। इष्टतम क्रोमेटिन टुकड़ा आकार 100-600 बीपी के बीच सीमा होती है।

2. कम सेल चिप प्रयोगों

  1. सेल संग्रह और डीएनए प्रोटीन crosslinking
    1. 80% -90% के संगम को हेला-S3 कोशिकाओं को विकसित। , संस्कृति मध्यम निकालें 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ दो बार पकवान धोने, और सुसंस्कृत थाली करने के लिए 1x ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ें। डिश से कोशिकाओं को अलग करने के लिए दो मिनट की एक अधिकतम के लिए सेते हैं।
      नोट: अब ऊष्मायन बार कोशिका क्षति को बढ़ावा मिलेगा।
    2. 1 मिलीलीटर centrifugation के ट्यूब में सीरम युक्त 1 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से जोड़कर कोशिकाओं को इकट्ठा। कोशिकाओं की गणना।
    3. जी एक्स 500 पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सेल नंबर लाओनिर्धारण के लिए संस्कृति के माध्यम से मिलीलीटर प्रति 10,000 कोशिकाओं के लिए।
    4. निर्धारण के लिए प्रत्येक ट्यूब में 36.5% नए सिरे से तैयार formaldehyde के 27 μl जोड़ें। ट्यूब में दो या तीन बार पलटना और आरटी पर 10 मिनट सेते हैं।
    5. ट्यूब पलटना, नमूना के लिए दो या तीन बार 1.25 एम ग्लाइसिन समाधान के 115 μl जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट सेते हैं। इस बिंदु के बाद से बर्फ पर काम करते हैं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। धीरे-धीरे सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. तस्वीर (200x, अंतिम एकाग्रता 1x) के साथ 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड HBSS के साथ कोशिकाओं को धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र resuspend ट्यूब में दो या तीन बार पलटना। धीरे सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बर्फ पर सेल गोली रखने के लिए।
  2. सेल और chromatin कर्तन
    1. 10,000 कोशिकाओं प्रति पूर्ण lysis बफर TL1 (lysis बफर TL1 + पीआईसी) के 25 μl जोड़ें और कोशिकाओं resuspend के लिए मैन्युअल ट्यूब के नीचे आंदोलन। 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    2. पूरा HBSS के 75 μl जोड़ें (HbSS + पीआईसी) 10,000 कोशिकाओं से युक्त प्रत्येक विभाज्य में बफर।
    3. 5 चक्र प्रत्येक के 5 सेट के लिए sonication द्वारा 10,000 कोशिकाओं के 100 μl aliquots के कतरनी। एक चक्र 30 सेकंड "पर" और उच्च शक्ति की स्थापना पर 30 सेकंड "बंद" के होते हैं। वैकल्पिक रूप से, 30 सेकंड "पर", 30 सेकंड "बंद" का 5 चक्रों की एक छोटी sonication के समय के साथ इस्तेमाल किया एक पिको-sonication के डिवाइस का उपयोग करें। इष्टतम क्रोमेटिन टुकड़ा आकार 100-600 बीपी के बीच सीमा होती है। क्रोमेटिन की तैयारी, सेल प्रकार और विभिन्न sonicators अलग कर्तन अनुकूलन प्रयोगों की आवश्यकता है कि ध्यान दें।
    4. अपकेंद्रित्र 10 मिनट पर तैरनेवाला अघुलनशील सामग्री त्यागने और इकट्ठा करने के लिए 14,000 XG पर sheared क्रोमेटिन आईपी चरण में तुरंत इस्तेमाल किया जाएगा। वैकल्पिक रूप से, भविष्य में उपयोग के लिए 2 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रोमेटिन की दुकान।
    5. 1-1.5% TAE agarose जैल का उपयोग करते हुए पूर्व immunoprecipitation के कदम को क्रोमेटिन बाल काटना दक्षता का विश्लेषण करें याbionalyzer। पूर्व RNase के साथ इलाज के नमूने कर्तन के दृश्य आकलन में सुधार करने के क्रम में जेल विश्लेषण agarose करने के लिए। इष्टतम क्रोमेटिन टुकड़ा आकार 100-600 बीपी के बीच सीमा होती है।

3. chromatin immunoprecipitation और पुस्तकालय तैयारी

  1. मानक स्वचालित चिप प्रयोगों के लिए
    1. क्रोमेटिन sheared 100 μl करने के लिए चिप बफर एच (चिप बफर एच + पीआईसी) के 120 μl जोड़ें। आईपी ​​के लिए 200 μl का प्रयोग करें और इनपुट नमूना के रूप में 20 μl के लिए 2 μl रहते हैं।
    2. स्वचालन उपकरण में स्वचालित चिप 200 μl प्रोटोकॉल का चयन करें। प्रोटोकॉल के throughput रन प्रति 1-16 नमूने है।
    3. क्रोमेटिन 1-2 मिलियन कोशिकाओं, विरोधी H3K79me3 की 1-2 माइक्रोग्राम प्रति के लिए इसी का उपयोग कर एक स्वचालित चिप प्रयोग भागो, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 और H3K9me3 चिप seq के ग्रेड खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी। इष्टतम एंटीबॉडी मात्रा हिस्टोन संशोधन और आत्मीयता और कल्पना के आधार पर बदलतीइसी एंटीबॉडी की ificity।
      1. एक निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के रूप में गैर प्रतिरक्षा खरगोश आईजीजी के बराबर राशि का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, uncoated मोती या चिप नियंत्रण के रूप में विशिष्ट अवरुद्ध कर एंटीबॉडी का उपयोग करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए प्रोटीन से एक लेपित चुंबकीय मोतियों की 20 μl जोड़ें।
    4. विरोधी H3K79me3 और -H3K4me2 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ स्वचालित चिप प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए स्वचालित हिस्टोन चिप seq के किट अभिकर्मकों का प्रयोग करें। , विरोधी H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac साथ -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 और -H3K9me3 चिप प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आदर्श चिप seq के किट अभिकर्मकों का प्रयोग करें।
    5. स्वचालन उपकरण में लागू सॉफ्टवेयर निर्देशों का पालन स्वचालित चिप प्रोटोकॉल का चयन करें। एंटीबॉडी कोटिंग चरण के लिए 4 घंटा और immunoprecipitation के कदम के लिए 15 घंटे के लिए चिप प्रयोगात्मक मापदंडों सेट करें। रिवर्स crosslinking चरण 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर स्वचालित उपकरण में जगह लेता है।
    6. स्वचालित प्रणाली पर रिवर्स पार से जुड़े डीएनए शुद्ध। चयन करें autएक प्रोटोकॉल या किट चुंबकीय मनका आधारित डीएनए शुद्धि का उपयोग कर के साथ डीएनए शुद्धि के लिए omated प्रोटोकॉल। पानी के 25 μl में डीएनए elute।
    7. Immunoprecipitated डीएनए का 10% निकालने के द्वारा immunoprecipitated डीएनए यों। immunoprecipitated डीएनए उपज क्रोमेटिन और एंटीबॉडी, सेल प्रकार और लक्ष्य हिस्टोन संशोधन की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक परख किट का उपयोग डीएनए यों।
    8. कम से कम सकारात्मक एक और एक नकारात्मक नियंत्रण जीनोमिक क्षेत्रों के लिए प्राइमरों का उपयोग मात्रात्मक पीसीआर द्वारा immunoprecipitated डीएनए की गुणवत्ता का विश्लेषण। चिप संवर्धन का आकलन करने के लिए कुल immunoprecipitated डीएनए के 10% से अधिक का उपयोग न करें।
      1. QPCR प्रतिक्रियाओं तैयार करें। एक 2x SyberGreen qPCR के मास्टर मिश्रण के 10 μl, प्राइमर मिश्रण की एक μl, immunoprecipitated या इनपुट डीएनए और 20 μl अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए बाँझ पानी के 1-5 μl जोड़ें। qPCR के कार्यक्रम 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम भी शामिल है5-10 मिनट के लिए Taq पोलीमरेज़ के प्रदाता के आधार पर और annealing तापमान चयनित प्राइमरों के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए।
    9. चिप डीएनए के साथ-साथ एक ही क्रोमेटिन तैयारी से बचाया इनपुट डीएनए दोनों का प्रयोग पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Illumina चिप seq के पुस्तकालय तैयारी अभिकर्मकों के साथ संगत का प्रयोग करें स्वचालित पुस्तकालय प्रस्तुत करने का प्रोटोकॉल। पुस्तकालय तैयारी के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी से immunoprecipitated डीएनए के 10-20 एनजी का प्रयोग करें। रन प्रति 16 स्वचालित पुस्तकालयों अप करने के लिए तैयार करते हैं।
    10. पुस्तकालयों अनुक्रम और Illumina निर्माता के निर्देशों के अनुसार समूहों उत्पन्न करते हैं। मानक Illumina पाइप लाइन, फिल्टर निम्नलिखित प्राथमिक जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण (क्लस्टर छानने, बेस फोन, आदि) प्रदर्शन और अलंड एलाइनर साथ (वर्तमान संस्करण GRCh38 है) नवीनतम मानव जीनोम विधानसभा के लिए पढ़ता पंक्ति में। शिखर फोन करने के लिए SICER 7 या एमएसीएस 8 का प्रयोग करें और डब्ल्यू चोटियों के बहाव के विश्लेषण प्रदर्शनith होमर 9, BEDTools 10 या पसंदीदा सॉफ्टवेयर।
  2. कम सेल नंबर स्वचालित चिप प्रयोगों के लिए
    1. क्रोमेटिन sheared 100 μl को पूरा चिप बफर TC1 (चिप बफर TC1 + पीआईसी) के 120 μl जोड़ें। आईपी ​​के लिए 200 μl का प्रयोग करें और इनपुट के रूप में 20 μl रहते हैं।
    2. स्वचालन प्रणाली में स्वचालित चिप 200 μl प्रोटोकॉल का चयन करें। प्रोटोकॉल के throughput रन प्रति 1-16 नमूने है।
    3. कम क्रोमेटिन मात्रा पर काम करने के लिए अनुकूलित स्वचालित चिप अभिकर्मकों और चिप ग्रेड एंटीबॉडी का उपयोग कर एक स्वचालित चिप seq के प्रयोग चलाएँ। 10,000 कोशिकाओं और 100,000 कोशिकाओं, विरोधी H3K27me3 के 0.5 माइक्रोग्राम प्रति, 0.25 माइक्रोग्राम प्रति -H3K4me3, 0.1 माइक्रोग्राम प्रति -H3K27ac, 0.25 माइक्रोग्राम प्रति -H3K9me3 खरगोश प्रीमियम चिप seq के ग्रेड खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के लिए इसी क्रोमेटिन का प्रयोग करें। इष्टतम एंटीबॉडी मात्रा हिस्टोन संशोधन और इसी एंटीबॉडी की आत्मीयता और विशिष्टता के आधार पर बदलती हैं।
      1. गैर प्रतिरक्षा रब के बराबर राशि का उपयोग करेंएक निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के रूप में बिट आईजीजी। वैकल्पिक रूप से, uncoated मोती या चिप नियंत्रण के रूप में विशिष्ट अवरुद्ध कर एंटीबॉडी का उपयोग करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए प्रोटीन से एक लेपित चुंबकीय मोतियों की 10 μl जोड़ें।
    4. स्वचालन उपकरण में लागू सॉफ्टवेयर निर्देशों का पालन स्वचालित चिप प्रोटोकॉल का चयन करें। एंटीबॉडी कोटिंग चरण के लिए 4 घंटा और immunoprecipitation के कदम के लिए 15 घंटे के लिए चिप प्रयोगात्मक मापदंडों सेट करें। रिवर्स crosslinking चरण 4 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर स्वचालित उपकरण में जगह लेता है।
    5. निर्माता के निर्देशों का पालन और पानी के 25 μl के लिए 6 μl से खंडों में elute स्पिन स्तंभों का उपयोग रिवर्स पार से जुड़े डीएनए शुद्ध।
    6. एक वाणिज्यिक परख किट का उपयोग डीएनए यों। QPCR चिप गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्रों के लिए प्राइमरों का उपयोग करके परिणामों का विश्लेषण।
    7. कम डीएनए क्वान के साथ पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए अनुकूलित पुस्तकालय तैयारी अभिकर्मकों के साथ एक पुस्तकालय तैयारी किट का प्रयोग करेंtities। 30 पीजी और पुस्तकालय तैयारी के लिए (क्रमशः 10,000 और 100,000 कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए इसी) चिप डीएनए के 300 पीजी का प्रयोग करें। पुस्तकालय तैयारी अभिकर्मकों के साथ संगत स्वचालित प्रोटोकॉल का उपयोग पुस्तकालयों तैयार करें। स्वचालित पुस्तकालय प्रस्तुत करने का थ्रूपुट रन प्रति 1-48 पुस्तकालयों है।
    8. डबल असहाय डीएनए टेम्पलेट्स के अंत की मरम्मत के बाद, अनुक्रमण प्राइमर साइटों युक्त cleavable स्टेम पाश एडेप्टर ligate। डीएनए विस्तार कदम के बाद, पुस्तकालय तैयारी किट प्रोटोकॉल में वर्णित उच्च निष्ठा प्रवर्धन विधि के साथ नमूना बढ़ाना।
    9. पुस्तकालय प्रवर्धन के बाद, यों और पुस्तकालय तैयारी किट दिशा निर्देशों का पालन पुस्तकालयों शुद्ध। शुद्धि आवश्यक नहीं है कि उसके बाद आकार चयन पर ध्यान दें।
    10. पुस्तकालयों अनुक्रम और निर्माता के निर्देशों के अनुसार समूहों उत्पन्न करते हैं। स्टैंड निम्नलिखित प्राथमिक जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण (क्लस्टर छानने, बेस फोन, आदि) प्रदर्शनएआरडी निर्माता पाइप लाइन, फिल्टर, और अलंड 7 एलाइनर साथ (वर्तमान संस्करण GRCh38 है) नवीनतम मानव जीनोम विधानसभा के लिए पढ़ता पंक्ति में। , BEDTools 10, या किसी भी पसंदीदा सॉफ्टवेयर शिखर फोन करने के लिए SICER 8 या एमएसीएस 9 उपयोग और होमर के साथ चोटियों के बहाव के विश्लेषण करते हैं।

चित्रा 1
आईपी ​​स्टार कॉम्पैक्ट में स्वचालित चिप प्रयोगों स्थापित करने के लिए कैसे दिखा सॉफ्टवेयर की चित्रा 1. स्क्रीनशॉट। सॉफ्टवेयर के रूप में अच्छी तरह से कुंजी प्रयोगात्मक मानकों (एंटीबॉडी कोटिंग, आईपी और washes बदलने के लिए के रूप में चलाने के प्रति नमूनों की राशि का चयन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है ) शोधकर्ता जरूरतों के हिसाब से। स्वचालित प्रक्रिया समानांतर में विभिन्न स्थितियों (यानी, विभिन्न प्रकार और एंटीबॉडी की मात्रा, विभिन्न प्रकार के और कोशिकाओं की मात्रा में और यहां तक कि विभिन्न टी के परीक्षण की अनुमति देता हैypes और एक ही समय में चुंबकीय मोतियों के बराबर है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा स्वचालन प्रणाली में पुस्तकालय किट का उपयोग कर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए स्वचालित पुस्तकालय तैयारी स्थापित करने के लिए कैसे दिखा सॉफ्टवेयर 2. स्क्रीनशॉट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

आठ विभिन्न हिस्टोन मार्करों के लिए स्वचालित चिप seq के प्रयोगों का अनुकूलन

सफलतापूर्वक विकसित करने और पहले से मार्गदर्शन चिप Seq प्रयोगों में मान्य किया गया है कि स्वचालित चिप प्रोटोकॉल, चिप seq के ग्रेड एंटीबॉडी मान्य करने के लिए आदेश में चयन किया गया था (डेटा) नहीं दिखाया। विरोधी H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 और -H3K9me3: निम्न चिप seq के ग्रेड एंटीबॉडी इस अध्ययन के लिए चुने गए हैं। सभी चिप-सेक ग्रेड एंटीबॉडी की विशिष्टता पहले से डॉट धब्बा, पेप्टाइड सरणियों और वेस्टर्न ब्लाट प्रयोगों द्वारा पुष्टि की गई (डेटा) नहीं दिखाया। बढ़ रही एंटीबॉडी मात्रा के साथ पायलट चिप qPCR के प्रयोगों एंटीबॉडी (चित्रा 3) की संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया गया। कम से कम दो सकारात्मक और दो नकारात्मक नियंत्रण लक्ष्य के साथ qPCR विश्लेषण किया गया और उच्च नकारात्मक लक्ष्य से अधिक सकारात्मक के संवर्धन के साथ प्रोफाइल पांचगुना अनुक्रमण अनुभव के लिए अर्हता प्राप्त कर रहे हैं की तुलना iments। यह sheared chromatin की एक उच्च गुणवत्ता के साथ चिप और चिप seq के प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकाशन में दिखाया गया है सभी चिप प्रयोगों ताजा क्रोमेटिन का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। यह -80 डिग्री सेल्सियस पर तय कोशिकाओं फ्रीज और एक अलग दिन पर क्रोमेटिन तैयारी और कर्तन के साथ आगे बढ़ने के लिए भी संभव है। हालांकि, क्रोमेटिन हौसले से तैयार chromatin और इसलिए sonication के शर्तों प्रत्येक क्रोमेटिन तैयारी के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता से अलग तरीके से व्यवहार कर सकते हैं जमे हुए तय कोशिकाओं से तैयार किया। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ काम करते हैं, अलग डिटर्जेंट रचनाओं (एसडीएस) के साथ बाल काटना बफ़र्स इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के निलंबन में उगाई जाने वाली प्राथमिक सेल लाइनों या सेल के रूप में सेल प्रकार कठिन कोशिकाओं कतरनी और हेला में कम एसडीएस सांद्रता (0.1%) की आवश्यकता होगी जैसे वंचित करने के लिए आसान कर रहे हैं कि सेल लाइनों जबकि उच्च एसडीएस सांद्रता (1%) की आवश्यकता होगी रहे हैं बाल काटना बफ़र्स।

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चित्रा स्वचालन प्रणाली का उपयोग कर चिप ग्रेड एंटीबॉडी के 3. मान्यकरण। चिप विरोधी H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, साथ प्रदर्शन किया था से sheared क्रोमेटिन पर -H3K36me3 और -H3K9me3 खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी हिस्टोन संशोधनों के आधार पर 1 लाख हेला-S3 कोशिकाओं। 200 μl काम कर संस्करणों के साथ स्वचालित चिप प्रोटोकॉल एंटीबॉडी अनुमापन प्रयोगों के लिए स्वचालन उपकरण में इस्तेमाल किया गया। 1, 2, 5 और 10 माइक्रोग्राम प्रति की एंटीबॉडी मात्रा चिप प्रयोग प्रति परीक्षण किया गया और 2 माइक्रोग्राम प्रति आईजीजी प्रत्येक प्रयोग में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। संवर्धन के qPCR के द्वारा मूल्यांकन किया गया। परिणाम इनपुट के एक% (qPCR के विश्लेषण के बाद इनपुट डीएनए की तुलना में immunoprecipitated डीएनए के रिश्तेदार राशि) के रूप में दिखाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मान्य और OPTIMA निर्धारण करने के बाद चिप ग्रेड एंटीबॉडी के एल मात्रा स्वचालन प्रणाली में इस्तेमाल किया जाएगा, स्वचालित चिप seq के प्रयोगों के प्रत्येक हिस्टोन संशोधन (चित्रा 4) के लिए अनुक्रमण प्रोफाइल को उत्पन्न करने के क्रम में प्रदर्शन किया गया।

चित्रा 4
चित्रा 4. Histone चिप seq के प्रोफाइल को स्वचालित चिप seq के प्रयोगों द्वारा उत्पन्न। आंकड़ा H3K4me3, H3K9ac और H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3, और H3K36me3 के लिए अलग अलग जीनोमिक क्षेत्रों में चिप seq के प्रोफाइल को दर्शाता है। 4A पूरा एक्स के साथ शिखर वितरण से पता चलता है -chromosome और 4 बी GAPDH जीन आसपास के एक 75 केबी क्षेत्र में वितरण। 4C MYT1 जीन आसपास के एक 500 केबी क्षेत्र में H3K27me3, H3K36me3 और H3K4me3 के प्रोफाइल से पता चलता है और 4D एक 200 केबी क्षेत्र के आसपास के ZNF12 में H3K9me3 के वितरण से पता चलता है।large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जीन की अभिव्यक्ति के साथ जुड़े छह अलग हिस्टोन संशोधन के लिए हिस्टोन epigenetic प्रोफाइल (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 और H3K36me3) उत्पन्न किया गया। चित्रा -4 ए अलग हिस्टोन मार्करों के लिए गुणसूत्र एक्स के साथ चिप seq के प्रोफाइल को दर्शाता है। 6 अलग हिस्टोन प्रोफाइल के बीच मनाया अत्यधिक शिखर सहसंबंध सटीक और विश्वसनीय डेटा उत्पन्न करने के लिए स्वचालित प्रणाली की क्षमताओं को इंगित करता है। 4B चित्रा, 4C और 4D विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में अलग हिस्टोन संशोधन के लिए चोटियों का वितरण दिखा।

200 कोशिकाओं के लिए नीचे स्वचालित chromatin immunoprecipitation प्रयोगों

चिप प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कोशिकाओं की न्यूनतम राशि chromatin की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, specificitY और एंटीबॉडी और अध्ययन हिस्टोन संशोधन या प्रोटीन की प्रचुरता की संवेदनशीलता। सीमित नमूना की मात्रा और इष्टतम अभिकर्मकों और विभिन्न विमान सेवाओं के चयन के साथ काम कर डीएनए वसूली की दक्षता में सुधार और चिप प्रयोग की सफलता के लिए योगदान जब अच्छा चिप-सेक ग्रेड एंटीबॉडी का चयन महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से chromatin की कम मात्रा के साथ काम करने के लिए अनुकूलित चिप अभिकर्मकों का उपयोग कर आईपी स्टार स्वचालित प्रणाली में परीक्षण किया गया स्वचालित चिप प्रोटोकॉल प्रक्रिया कर सकते हैं कि कोशिकाओं, क्रोमेटिन, एंटीबॉडी, और चुंबकीय मोतियों की विभिन्न मात्राओं की न्यूनतम राशि निर्धारित करने के लिए।

प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रथम, 10,000 कोशिकाओं से क्रोमेटिन sonicated गया था। चिप परिणाम नकारात्मक नियंत्रण क्षेत्रों में H3K4me3 सकारात्मक नियंत्रण के क्षेत्रों में एंटीबॉडी और नगण्य संकेत के साथ महत्वपूर्ण संवर्धन से पता चलता है जो qPCR (चित्रा 5A) द्वारा पुष्टि की गई। तुलना और स्थिरता के सबूत, additiona के लिए10,000 कोशिकाओं का उपयोग H3K27ac, H3K9me3 के साथ प्राप्त एल डेटा, और H3K27me3 एंटीबॉडी, प्रदान की जाती है।

स्वचालित चिप प्रयोगों वही H3K4me3 एंटीबॉडी का उपयोग कोशिकाओं की कम मात्रा के साथ काम करने के लिए स्वचालित प्रणाली की क्षमताओं का प्रदर्शन करने के लिए फिर प्रदर्शन किया गया। स्वचालित चिप प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मैनुअल चिप परिणाम (चित्रा 5 ब) के साथ अत्यधिक तुलनीय थे कि दस आईपी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के द्वारा प्रदर्शन किया, अच्छी तरह से प्रदर्शन किया। मैनुअल और स्वचालित प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे थे और स्वचालित प्रोटोकॉल का लाभ परिवर्तनशीलता (चित्रा 5C) प्रयोग करने के लिए प्रयोग को कम करने में देखा गया था।

चित्रा 5
चित्रा 5. मैनुअल चिप प्रयोगों 10,000 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया 10,000 कोशिकाओं पर चिप और ऑटो चिप प्रयोगों के अनुकूलन और H3K4me3 के 0.25 माइक्रोग्राम प्रति, H3K27ac के 0.1 माइक्रोग्राम प्रति, H3K9me3 और 0.2 के 0.5 माइक्रोग्राम प्रति का उपयोग करH3K27me3 एंटीबॉडी के 5 माइक्रोग्राम प्रति। खरगोश आईजीजी के समान मात्रा में एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। qPCR के दो सकारात्मक लोकी और प्रत्येक चिप परख के लिए दो नकारात्मक लोकी के लिए प्राइमरों के साथ प्रदर्शन किया गया था। चित्रा 5A वसूली, निवेश का एक प्रतिशत (qPCR के विश्लेषण के बाद इनपुट डीएनए की तुलना में immunoprecipitated डीएनए के रिश्तेदार राशि) के रूप में व्यक्त पता चलता है। 5B से पता चलता है 10 चिप प्रतिक्रियाओं 0.25 माइक्रोग्राम प्रति H3K4me3 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी और खरगोश आईजीजी के 0.25 माइक्रोग्राम प्रति के रूप में नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग आईपी स्टार कॉम्पैक्ट पर चलाते हैं। तब qPCR विश्लेषण सकारात्मक लोकी EIF4A2 प्रमोटर और GAPDH टीएसएस और नकारात्मक लोकी Myoglobin exon2 और Sat2 के लिए प्राइमरों के साथ प्रदर्शन किया गया था। आंकड़ा वसूली से पता चलता है, इनपुट (qPCR के विश्लेषण के बाद इनपुट डीएनए की तुलना में immunoprecipitated डीएनए के रिश्तेदार राशि) के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया। चित्रा 5C 10 स्वचालित चिप प्रयोगों की तुलना में 10 मार्गदर्शन चिप प्रयोगों की H3K4me3 चिप डेटा से पता चलता है। त्रुटि सलाखों के प्रतिनिधित्व दस प्रतिकृति में से प्रत्येक के tandard विचलन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

स्वचालित चिप प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता को समझने के लिए, प्रयोगों आईपी प्रति एक लाख 200 करने के लिए नीचे कोशिकाओं से लेकर है कि कोशिकाओं की राशि का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। यह एक बहुत ही आम हिस्टोन संशोधन के रूप में विरोधी H3K27me3 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था। अन्य हिस्टोन या गैर हिस्टोन एंटीबॉडी का उपयोग मिलान की बहुतायत है और एंटीबॉडी की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, अधिक या कम कोशिकाओं की आवश्यकता हो सकती है। प्रयोगों मात्रात्मक पीसीआर द्वारा मान्य किया गया है और यह माला और प्रयोगों में एंटीबॉडी पृष्ठभूमि की मात्रा को कम करके के रूप में छोटे रूप में 200 कोशिकाओं एंटीबॉडी (चित्रा 6) के साथ सफल चिप qPCR के परिणामों की अनुमति के लिए कम है कि मनाया गया।

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चित्रा 6 200 कोशिकाओं पर चिप assays स्वचालित। हेला-S3 कोशिकाओं और एंटीबॉडी H3K27me3 के खिलाफ निर्देशित। Chromatin 1 मिलियन कोशिकाओं और चिप प्रतिक्रिया प्रति इस्तेमाल किया गया (100,000 से 200 सेल बराबर करने के लिए) इस क्रोमेटिन के धारावाहिक dilutions से sheared गया था। प्रोटीन एक-लेपित चुंबकीय मोतियों की एक H3K27me3 की माइक्रोग्राम प्रति और 10 μl H3K27me3 के 0.5 माइक्रोग्राम प्रति और 10,000 और 1,000 कोशिकाओं पर मोती के 10 μl, और H3K27me3 की 0.25 माइक्रोग्राम प्रति और 500 और 200 के साथ मोती के 5 μl, 100,000 कोशिकाओं के प्रयोग पर प्रयोग किया गया कोशिकाओं। 100,000 कोशिकाओं और क्रमशः 1000 कोशिकाओं के साथ प्रयोगों प्रदर्शन जब एक माइक्रोग्राम प्रति और खरगोश आईजीजी की माइक्रोग्राम प्रति के 0.5 नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया। 6A। इनपुट% से अधिक में TSH2B और GAPDH जीनों के अधिभोग से पता चलता है 6B नकारात्मक GAPDH नियंत्रण बनाम TSH2B के रिश्तेदार अधिभोग से पता चलता है जीनोमिक क्षेत्र।

पर चिप seq के परिणामों के बहाव के विश्लेषण10,000 कोशिकाओं

10,000 HELA कोशिकाओं और चिप प्रयोगों पर H3K4me3 एंटीबॉडी के 0.25 माइक्रोग्राम प्रति के साथ चिप-सेक assays के प्रदर्शन किया गया स्वचालित कोशिकाओं के कम मूल्य उस संख्या के साथ स्वचालित चिप seq के प्रयोगों की वैश्विक गुणवत्ता का आकलन करने के क्रम में एक लाख हेला-S3 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया पर प्रयोग के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में। स्वचालित पुस्तकालयों कम डीएनए मात्रा के साथ तैयार पुस्तकालयों के लिए अनुकूलित MicroPlex पुस्तकालय तैयारी किट अभिकर्मकों का उपयोग कर तैयार किया गया था। यह संभव है कि भले ही कम से कम 10,000 कोशिकाओं के साथ सफल स्वचालित चिप प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए ध्यान दें कि, नीचे खींच लिया डीएनए की मात्रा किट अभिकर्मकों का उपयोग कर पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा। क्लस्टर पीढ़ी और अनुक्रमण निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया। जैव सूचना विज्ञान कम सेल नंबर चिप नमूने से अनुक्रमण शो उत्कृष्ट परिणाम के बाद विश्लेषण करती है। 30 पीजी डाटासेट (प्रारंभिक सामग्री के 10,000 कोशिकाओं इसी ) कम पृष्ठभूमि शोर और सामग्री शुरू की 100,000 कोशिकाओं को इसी 300 पीजी डाटासेट () और एक बाहरी संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था, जो एन्कोड परियोजना के लिए ब्रॉड संस्थान द्वारा उत्पन्न H3K4me3 डाटासेट दोनों ने इस बात की पुष्टि कर रहे हैं, जो अत्यंत विश्वसनीय संवर्धन चोटियों होते हैं। यह दो डेटासेट सबसे अच्छा 40% से कम से कम एक 80% ओवरलैप है की तुलना अगर चिप seq प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माना जाता है जिसमें एन्कोड 11 परियोजना में इस्तेमाल एक मानक विधि को संदर्भित करता है जो शीर्ष 40 ओवरलैप अनुपात डेटा, नोट करना महत्वपूर्ण है महत्व स्कोर द्वारा क्रम चोटियों की। 300 पीजी डाटासेट (अपनी चोटियों के सभी में ही नहीं, सबसे अच्छा 40% पर विचार कर) और ब्रॉड संस्थान डेटा (तालिका 1) दोनों की तुलना में जब 30 पीजी डाटासेट इन मानदंडों को पूरा करे। 300 पीजी डाटासेट एक 98% शीर्ष 40 ओवरलैप अनुपात (चित्रा 7) के साथ ब्रॉड संस्थान के आंकड़ों के लगभग समान चोटियों से पता चलता है।

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10,000 कोशिकाओं चिप seq के प्रयोगों पर 7. चिप assays चित्रा और पुस्तकालय पीढ़ी H3K4me3 एंटीबॉडी (/ μl 0.25 माइक्रोग्राम प्रति) का उपयोग कर 10,000 और 100,000 हेला-S3 कोशिकाओं पर उत्पन्न किया गया। 35 बीपी टैग अलंड एलाइनर के साथ मानव जीनोम के लिए मैप किया गया। SICER मज़बूती से कम सेल नंबर से के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के लाखों लोगों से संवर्धन की पहचान सकता बुला बाद चोटी के दौरान। डेटासेट का विश्लेषण किया और एक दूसरे के साथ और ब्रॉड संस्थान द्वारा उत्पन्न संदर्भ डेटा की तुलना में थे। कम सेल के नमूने संगत कर रहे हैं और बहुत ही उच्च समानता है। 30 पीजी नमूना को पूरा एन्कोड मापदंड 11 (मि। चोटियों के ऊपर 40% से 80% ओवरलैप चाहिए)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1
तालिका 1।

Discussion

अनुक्रमण द्वारा पीछा chromatin immunoprecipitation अब एक मानक प्रक्रिया है। यहाँ सामग्री शुरू करने के रूप में कुछ के रूप में 10,000 कोशिकाओं के साथ क्रोमेटिन epigenetic प्रोफाइल को उत्पन्न कर सकते हैं कि एक स्वचालित चिप seq के प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है।

चिप और पुस्तकालय तैयारी assays के स्वचालित चिप अनुकूलन प्रक्रिया का मानकीकरण और प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने की अनुमति देता है। यहाँ प्रस्तुत तरल हैंडलिंग प्रणाली, समय पर करने के लिए सिर्फ 30 मिनट के हाथों को कम करने के चिप के साथ जुड़े मैनुअल प्रक्रियाओं के कई समाप्त नमूना नुकसान को कम करता है, और पुस्तकालय इनपुट के बस कुछ ही picograms के साथ सटीक चिप seq के लिए सक्षम बनाता है। सफल स्वचालित चिप seq के प्रयोगों को प्राप्त करने के क्रम में, यह भी एक प्रयोग प्रणाली में उच्च गुणवत्ता sheared क्रोमेटिन तैयारी और चिप seq के ग्रेड एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है चुंबकीय मनका आधारित प्रौद्योगिकी का उपयोग करता है और इस तरह के ऊष्मायन के रूप में मुख्य प्रयोगात्मक मापदंडों को बदलने के लिए लचीलापन प्रदान करता है एंटीबॉडी कोट के लिए समयimmunoprecipitation के चरणों या चिप-seq के अनुकूलन के लिए सभी आवश्यक प्रयोगों का संचालन करने के अनुसंधानकर्ता की इजाजत दी धोने शर्तों के संशोधन आईएनजी और। स्वचालित प्रणाली भी प्रत्येक व्यक्ति के सेल लाइन और एंटीबॉडी के लिए प्रयोगात्मक शर्तों के अनुकूलन के लिए समानांतर में कई अभिकर्मकों की तुलना की अनुमति देता है और विभिन्न प्रकार के और chromatin की सांद्रता, अलग एंटीबॉडी और चुंबकीय के भी विभिन्न प्रकार के प्रत्यक्ष तुलना में सक्षम बनाता है कि एक "खुला" मंच है मोती।

स्वचालित प्रणाली की सीमाओं में से एक 5 μl से 200 μl करने के लिए सीमा है कि खंडों में सभी प्रोटोकॉल स्वचालित की जरूरत होती है। हालांकि, इस स्वचालित मंच में प्रयोगों के miniaturization भी अभिकर्मकों में लागत बचत सक्षम बनाता है।

इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल के अलावा, प्रणाली अनुकूलनीय है और भी ऐसे immunoprecipitation के एक के रूप में अन्य चुंबकीय मनका आधारित आवेदनों की एक किस्म automatesएन डी डीएनए methylated (MeDIP और MethylCap टेक्नोलॉजीज), hydroxylmethylated डीएनए (hMEDIP), अनुक्रमिक chromatin immunoprecipitation (ReChIP), आरएनए immunoprecipitation (आरएनए आईपी), bisulfite रूपांतरण की immunoprecipitation, और डीएनए शुद्धि assays के कब्जा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS  Life technologies 14190-094
Trypsin-EDTA Sigma T3924-100ML
Formaldehyde 37% Sigma F8775-25
1.25 M Glycine Solution Diagenode C01020010 Component of the ideal ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL1 Diagenode C01020010 Component of the ideal ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL2 Diagenode C01020010 Component of the ideal ChIP-seq kit
Shearing Buffer iS1 Diagenode C01020010 Component of the ideal ChIP-seq kit
Protease Inhibitors Mix (200x) Diagenode C01010130 Component of the Auto True Micro ChIP kit
HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Life technologies 14175-053
Lysis Buffer tL1 Diagenode C01010130 Component of the Auto True Micro ChIP kit
ChIP Buffer tC1 Diagenode C01010130 Component of the Auto True Micro ChIP kit
ideal ChIP-seq kit Diagneode C01010051
ChIP-Buffer H Diagenode C01010020 Component of the Auto Histone ChIP-seq kit
Auto Histone ChIP-seq kit Diagenode C01010020
Auto True Micro ChIP kit Diagenode C01010130
H3K79me3 polyclonal antibody-Classic Diagenode C15310068
H3K27me3 polyclonal antibody-Classic Diagenode C15410069
H3K4me3 polyclonal antibody-Classic Diagenode C15410030
H3K4me2 polyclonal antibody-Classic Diagenode C15410035
H3K9ac polyclonal antibody-Premium Diagenode C15410004
H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium Diagenode C15410200
H3K36me3 polyclonal antibody-Premium Diagenode C15410058
H3K9me3 polyclonal antibody-Premium Diagenode C15410193
Rabbit IgG Diagenode C15410206
Protein-A coated paramagnetic beads Diagenode C01010020
Auto IPure Diagenode C03010010
MicroChIP DiaPure columns Diagenode C03040001
Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml Diagenode DMMLD2D100 
Quant-IT dsDNA Invitrogen Q32854
Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA Illumina FC-121-3001
Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit Illumina IP-202-1012
MicroPlex Library Preparation Kit Diagenode C05010010
Agencourt AMPure XP beads Beckman Coulter A63881
Illumina Library prep Quantification kit Kapa Biosystems KK4844
IP-Star Compact  Automated System Diagenode B03000002
Bioruptor Plus Diagenode B01020001
Bioruptor Pico Diagenode B01060001
Qubit system Invitrogen Q32857
Illumina Hiseq systems Illumina

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 94 स्वचालन chromatin immunoprecipitation कम डीएनए मात्रा हिस्टोन एंटीबॉडी अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी
चिप seq के प्रयोगों को स्वचालित 10,000 HELA कोशिकाओं पर epigenetic प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए
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Berguet, G., Hendrickx, J., Sabatel, … More

Berguet, G., Hendrickx, J., Sabatel, C., Laczik, M., Squazzo, S., Mazon Pelaez, I., Saxena, R., Pendeville, H., Poncelet, D. Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells. J. Vis. Exp. (94), e52150, doi:10.3791/52150 (2014).

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