Introduction
Som Next-Generation Sequencing (NGS) teknologi har blitt utbredt og mer tilgjengelig, den primære metoden for genome-wide kartlegging av protein-DNA interaksjoner er nå Kromatin immunoprecipitation fulgt av NGS deteksjon (ChIP-seq), som gjør oppdagelsen av transkripsjonsfaktor bindingsseter eller mønstre av histonmodifikasjonene. ChIP-seq er fordelaktig ved å gi high-throughput data av hele genomet som kan brukes for kvantitativ og kvalitativ analyse av protein-DNA-interaksjoner ved måling av de anrikede DNA-fragmenter. Det finnes imidlertid noen ulemper i standard chip-seq eksperimenter slik som vanskeligheten med å oppnå nok materiale for å skape et sekvense bibliotek.
Chip eksperimenter er delt inn i seks grunnleggende trinn som innbefatter 1) tverrbindingsprotein-DNA-bindende regioner 2) prøvepreparering som omfatter cellelyse og skjære kromatin ved ultralydbehandling, 3) dannelse av immunkomplekser,4) utfelling av immunokomplekser, 5) vasking av immunkomplekser, og 6) eluering av anriket materiale og analyse ved qPCR og NGS.
Suksessen til en chip-analysen er avhengig av tre faktorer: en god kromatin bearbeiding, mengden av antigen i det opprinnelige prøven, og den spesifisitet og affinitet av antistoffet for dets beslektede antigen. En viktig begrensning er behovet for store mengder av startcellenumrene for å oppnå tilstrekkelig anriket DNA-sekvensering for å lage en bibliotek. For forskere som jobber med begrensede prøvemengder, for eksempel biopsiprøver eller celleunderpopulasjoner, Chip-seq eksperimenter er svært utfordrende. Nyere studier har vist at Chip-seq analyser kan utføres når du arbeider med en lav mengde celler 1, 2. DIAGENODE har utviklet en robot væskehåndtering system som fullt ut kan automat Chip-seq eksperimenter når du starter med et begrenset antall celler.
Automatisering girmange fordeler fremfor manuell utarbeidelse av Chip-seq prøvene som det reduserer menneskelige feil, reduserer variasjon, og reduserer eksperimentell kostnad. Semi-automatisert protokoller for kromatin immunoutfelling og biblioteket fremstillingen er blitt rapportert, men ingen av disse studiene har vist data ved bruk av lave celletall 3, 4, 5, 6.
I denne utredningen et komplett automatisert arbeidsflyt er beskrevet for både kromatin immunoutfellingsstudier og bibliotek forberedelse forsøk i en robotvæskehåndtering system som bruker magnetiske kuler-basert teknologi og som kan ta flere parametere i protokollen optimalisering. Her ble automatisert Chip-seq eksperimenter vellykket utført på et begrenset antall celler med mål om å forenkle, standardisere, og gir en pålitelig løsning for å studere epigenetiske profiler i små cellepopulasjoner. Den automatiserte ChIP protokollen er beskrevet i denne artikkelen har blitt optimalisert på HeLa celler ved hjelp av spesifikke histone antistoffer og reagenser bUT arbeidsflyt kan tilpasses til andre cellelinjer og antistoffer med tilsvarende eksperimentelle optimalisering.
Protocol
1. Standard Chip Experiments
- Celle innsamling og DNA-protein kryssbinding.
- Grow HeLa-S3 celler til en sammenfletting av 80% -90%. Fjerne dyrkningsmedium, vasker fatet to ganger med 10 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett Trypsin-EDTA (1x) til den kultiverte plate. Inkuber for maksimalt 2 min å løsne cellene fra fatet. Samle cellene og vaskes to ganger med 10 ml PBS.
MERK: Lengre inkubasjonstid vil føre til celleskade. - Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 x g og resuspender cellene i 20 ml PBS. Fortsett å telle cellene.
- Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 xg, kast supernatanten og tilsett 500 mL PBS. Det optimale antall celler for fiksering trinnet er 10 millioner celler pr 500 ul PBS.
- Legg 13,5 ul av frisk 37% formaldehyd i hver porsjon av 500 ul av cellesuspensjonen. Fiksere cellene i 8 min ved RT.
- Legg 57 mL av 1,25 M glysin solution for å stoppe fiksering. Inkuber i 5 min ved RT med konstant blanding ved forsiktig vortex. Jobbe med is fra dette punktet og fremover.
- Sentrifuger cellene ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C og kast supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
- Vask cellene to ganger med 1 ml PBS. Kast supernatanten forsiktig og holde cellepelleten på is.
- Grow HeLa-S3 celler til en sammenfletting av 80% -90%. Fjerne dyrkningsmedium, vasker fatet to ganger med 10 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett Trypsin-EDTA (1x) til den kultiverte plate. Inkuber for maksimalt 2 min å løsne cellene fra fatet. Samle cellene og vaskes to ganger med 10 ml PBS.
- Cellelyse og kromatin klipping
- Tilsett 10 ml iskald lysisbuffer IL1 til cellepelleten (1 ml lyseringsbuffer per 1 million celler er det optimale forhold). Pipetter opp og ned flere ganger og inkuberes i 10 min ved 4 ° C med forsiktig blanding.
- Sentrifugere lysatet i 5 min ved 500 x g og 4 ° C. Kast supernatanten.
- Tilsett 10 ml iskald lysisbuffer IL2 til lysatene, og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned. Inkuber lysatene i 10 minutter ved 4 ° C.
- Sentrifuger i 5 min ved 500 x g og 4 ° C, og supernatanten kastes.
- Behandling anleggre hele skjær buffer legge den 200x proteasehemmer cocktail (PIC) til is1 klipping buffer. Hold buffer på is i 5 minutter og arbeide på is etterpå. Tilsett 1 ml av den komplette is1 klipping buffer til hver 10 millioner celler pellet og forsiktig bland ved å pipettere opp og ned. Før sonikering inkubere prøvene på is i 10 min for å redusere viskositeten av prøven.
- Skjær 300 ul alikvoter av kromatin ved sonikering ved anvendelse av en sonikator vannbad i 2 til 3 sett av 10 sykluser hver. En syklus består av 30 sek "ON" og 30 sek "OFF" på en høy effektinnstilling. Alternativt kan du bruke en pico-ultralydenhet med en kortere sonication tid på 5 til 10 sykluser på 30 sek "ON", 30 sek "OFF". Kort vortex og spinne rørene mellom kjøringer. Ved bruk av andre typer sonicators, følger tilsvarende produsentens instruksjoner for kromatin klipping.
- Sentrifuger skåret kromatin ved 16.000 xg i 10 min, og cUtlevering av supernatanten som skal brukes umiddelbart i IP-trinnet. Alternativt lagre kromatinet ved -80 ° C i opp til to måneder for fremtidig bruk.
- Analyser kromatin klipping effektivitet før immunopresipitering skritt med 1-1,5% TAE agarosegel eller bionalyzer. Optimale kromatin fragment størrelsene varierer mellom 100-600 bp.
2. Lave Cell chip Experiments
- Celle innsamling og DNA-protein kryssbinding
- Grow HeLa-S3 celler til en sammenfletting av 80% -90%. Fjerne dyrkningsmedium, vasker fatet to ganger med 10 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett 1x Trypsin-EDTA til den kultiverte plate. Inkuber for maksimalt 2 min å løsne cellene fra fatet.
MERK: Lengre inkubasjonstid vil føre til celleskade. - Samle cellene ved tilsetning av 1 ml kulturmedium inneholdende serum i en 1 ml sentrifuge rør. Telle cellene.
- Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 x g. Bringe celle nummertil 10 000 celler per ml kulturmedium for fiksering.
- Legg 27 ul av 36,5% friskt tilberedt formaldehyd i hvert rør for fiksering. Snu røret to eller tre ganger og inkuberes i 10 minutter ved RT.
- Legg 115 ul av 1,25 M glysin-løsning til prøven, snu røret to eller tre ganger og inkuberes i 5 minutter ved RT. Jobbe med is fra dette punktet og fremover.
- Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten sakte.
- Vask celler med 1 ml iskald HBSS med PIC (200x, endelig konsentrasjon 1x). Snu røret to eller tre ganger for å resuspendere cellene og sentrifugering ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten forsiktig og holde cellepelleten på is.
- Grow HeLa-S3 celler til en sammenfletting av 80% -90%. Fjerne dyrkningsmedium, vasker fatet to ganger med 10 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS), og tilsett 1x Trypsin-EDTA til den kultiverte plate. Inkuber for maksimalt 2 min å løsne cellene fra fatet.
- Cellelyse og kromatin klipping
- Legg 25 ul komplett Lysis Buffer TL1 (Lysis Buffer TL1 + PIC) per 10.000 celler, og agitere manuelt i bunnen av røret for å resuspendere cellene. Inkuber på is i 5 min.
- Legg 75 mL av komplette HBSS (HBSS + PIC) buffer i hver porsjon inneholder 10 000 celler.
- Skjær 100 ul alikvoter av 10 000 celler ved sonikering i 5 sett av 5 hver syklus. En syklus består av 30 sek "ON" og 30 sek "OFF" på høy effektinnstilling. Alternativt kan du bruke en pico-ultralyd enhet som brukes med en kortere sonication tid av fem sykluser på 30 sek "ON", 30 sek "OFF". Optimale kromatin fragment størrelsene varierer mellom 100-600 bp. Merk at kromatin preparater, celletyper og ulike sonicators kreve separate klipping optimalisering eksperimenter.
- Sentrifuger skåret kromatin ved 14.000 xg i 10 minutter for å forkaste det uoppløselige materialet og samle supernatanten som skal brukes umiddelbart i IP-trinnet. Alternativt lagre kromatinet ved -80 ° C i opp til to måneder for fremtidig bruk.
- Analyser kromatin klipping effektivitet før immunopresipitering skritt med 1-1,5% TAE agarosegel ellerden bionalyzer. Behandler prøver med RNase før agarosegel analyse for å forbedre visuell vurdering av klipping. Optimale kromatin fragment størrelsene varierer mellom 100-600 bp.
3. Chromatin Immunpresipitering og Bibliotek Prep
- For standard automatisert chip eksperimenter
- Legg 120 mL av ChIP Buffer H (ChIP Buffer H + PIC) til 100 mL skåret kromatin. Bruke 200 mL for IP og holde 2 mL til 20 mL som input prøven.
- Velg automatiserte ChIP 200 mL protokoll i automatisering instrument. Gjennomstrømningen av protokollen er 1 til 16 sampler pr løp.
- Kjør en automatisert ChIP eksperiment ved hjelp, kromatin tilsvarende 1-2 millioner celler, 1-2 mikrogram av anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og H3K9me3 ChIP-seq klasse kanin polyklonale antistoffer. Optimale antistoff mengder varierer avhengig av histone modifikasjon og tilhørighet og specificity av det tilsvarende antistoff.
- Bruk like mengder ikke-immun kanin IgG som en isotype kontroll-antistoff. Alternativt kan du bruke ubestrøket perler eller spesifikk blokkert antistoff som Chip kontroller. Tilsett 20 ul protein A-belagte magnetiske kuler for hver reaksjon.
- Bruk automatiserte histone Chip-seq settreagensene å utføre automatiserte chip eksperimenter med anti-H3K79me3 og -H3K4me2 polyklonale antistoffer. Bruk ideelle Chip-seq settreagensene å utføre chip eksperimenter med anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og -H3K9me3.
- Velg automatiserte ChIP protokollen å følge bruksanvisningen for programvaren implementert i automatiseringsenheten. Sette brikken eksperimentelle parametre til 4 timer for antistoff beleggingstrinnet og 15 timer for immunpresipitering trinn. Det motsatte tverrbindingstrinnet finner sted i den automatiserte instrument ved 65 ° C i 4 timer.
- Rense omvendt tverrbundet DNA på automatisert system. Velg automated protokoller for DNA rensing med en protokoll eller kit hjelp basert på magnetiske kuler DNA rensing. Eluere DNA i 25 ul vann.
- Kvantifisere immunopresipitert DNA ved å ekstrahere 10% av immunopresipitert DNA. Den immunopresipitert DNA Utbyttet avhenger av kvaliteten av kromatin og antistoff, celletype og målet histon modifikasjon. Kvantifisere DNA ved hjelp av en testsettet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Analysere kvaliteten av immunopresipitert DNA ved kvantitativ PCR ved anvendelse av primere i minst en positiv og en negativ kontroll genomiske regioner. Ikke bruk mer enn 10% av den totale immunopresipitert DNA for å vurdere CHIP enrichments.
- Forberede qPCR reaksjoner. Legg 10 mL av en 2x SyberGreen qPCR mester mix, 1 mL av primerblanding, 1-5 ul immunpresipitert eller innspill DNA og sterilt vann opp til 20 mL endelig reaksjon volum. QPCR Programmet omfatter en innledende denatureringstrinn ved 95 ° Cfor 5-10 min avhengig av leverandør av Taq polymerase og annealing temperaturen bør settes i henhold til de primere valgt.
- Bruk automatisert bibliotek prep protokoller kompatible med de kommersielt tilgjengelige Illumina ChIP-seq bibliotek reagenser å bygge bibliotekene som bruker både ChIP DNA samt den lagrede innspill DNA fra samme kromatin forberedelse. Bruk 10-20 ng av immunopresipitert DNA fra hver antistoff for bibliotek forberedelse. Forberede opptil 16 automatiserte biblioteker per løp.
- Sekvensere bibliotekene og generere klynger ifølge Illumina produsentens anvisninger. Utføre primær bioinformatikk analyse (cluster filtrering, base ringer, etc.) etter standard Illumina rørledningen, filter og justere leser til den nyeste menneskelige genom enheten (gjeldende versjon er GRCh38) med ELAND aligner. Bruk SICER 7 eller MACS 8 for peak kall og utføre nedstrøms analyser av toppene with Homer 9, BEDTools 10 eller foretrukne programvare.
- For lav celletall automatisert chip eksperimenter
- Legg 120 mL av komplett ChIP buffer TC1 (ChIP Buffer TC1 + PIC) til 100 mL skåret kromatin. Bruke 200 mL for IP og holde 20 mL som input.
- Velg automatisert ChIP 200 mL protokoll i automasjonssystem. Gjennomstrømningen av protokollen er 1 til 16 sampler pr løp.
- Kjør en automatisert ChIP-seq eksperiment ved hjelp av automatiserte Chip reagenser og Chip klasse antistoffer optimalisert for å jobbe på lave kromatin mengder. Bruk kromatin som tilsvarer 10.000 celler og 100.000 celler, 0,5 mikrogram av anti-H3K27me3, 0,25 mikrogram -H3K4me3, 0,1 mikrogram -H3K27ac, 0,25 mikrogram -H3K9me3 kanin Premium Chip-seq klasse kanin polyklonale antistoffer. Optimale antistoff mengder varierer avhengig av histon modifikasjon og affiniteten og spesifisiteten av det tilsvarende antistoff.
- Bruke lik mengde ikke-immune rabbit IgG som en isotype kontroll-antistoff. Alternativt kan du bruke ubestrøket perler eller spesifikk blokkert antistoff som Chip kontroller. Tilsett 10 pl av protein-A-belagte magnetiske kuler for hver reaksjon.
- Velg automatiserte ChIP protokollen å følge bruksanvisningen for programvaren implementert i automatiseringsenheten. Sette brikken eksperimentelle parametre til 4 timer for antistoff beleggingstrinnet og 15 timer for immunpresipitering trinn. Det motsatte tverrbindingstrinnet finner sted i den automatiserte instrument ved 65 ° C i 4 timer.
- Rense omvendt tverrbundet DNA ved hjelp av spin kolonner etter produsentens anvisninger og elueres i volumene fra 6 mL til 25 ul av vann.
- Kvantifisere DNA ved hjelp av en kommersiell analyse kit. Analysere resultatene av qPCR ved anvendelse av primere for positive og negative kontrollregioner for å evaluere fliskvalitet.
- Bruke et bibliotek forberedelse kit med optimalisert bibliotek reagenser for å forberede biblioteker med lav DNA quanmengder. Bruk 30 pg og 300 pg av ChIP DNA (tilsvarende 10 000 og 100 000 celler eksperimenter henholdsvis) for bibliotek forberedelse. Forberede bibliotekene ved hjelp av automatiserte protokollen kompatibel med bibliotek reagenser. Den automatiserte bibliotek prep gjennomstrømning er 1 til 48 biblioteker per løp.
- Etter slutten reparasjon av dobbelt DNA maler, ligate de spaltbare Scammeløkke-adaptere som inneholder sekvense primer nettsteder. Etter DNA-forlengelsestrinn, forsterke prøven med high fidelity forsterkning metoden beskrevet i biblioteket fremstillingen settprotokollen.
- Etter bibliotek forsterkning, kvantifisere og rense bibliotekene følgende bibliotek forberedelse kit retningslinjer. Merk at størrelse valg etter rensing er ikke nødvendig.
- Sekvensere bibliotekene og generere klynger i henhold til produsentens instruksjoner. Utføre primær bioinformatikk analyse (cluster filtrering, base ringer, etc.) etter stativetard produsenten rørledning, filter, og juster leser til den nyeste menneskelige genom enheten (gjeldende versjon er GRCh38) med ELAND 7 aligner. Bruk SICER 8 eller MACS 9 for peak kall og utføre nedstrøms analyser av topper med Homer, BEDTools 10, eller noen foretrukne programvare.
Figur 1. Skjermbilder av programvaren som viser hvordan du setter opp automatiske chip eksperimenter i IP-Star Compact. Programvaren gir fleksibilitet til å velge hvor mye prøver per løp, samt å endre sentrale eksperimentelle parametre (Antistoff Coating, IP og vasker ) i henhold til forskeren behov. Den automatiserte prosedyren kan teste ulike forhold i parallell (dvs. ulike typer og mengder av antistoffer, ulike typer og mengder av celler og til og med forskjellig types og mengder av magnetiske kuler i samme løp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Screenshots av programvaren som viser hvordan du setter opp automatisert bibliotek forberedelse for neste generasjons sekvense bruke biblioteket kit i automasjonssystem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Optimalisere automatiserte Chip-seq eksperimenter i åtte forskjellige histone markører
For å lykkes med å utvikle og validere automatiserte Chip protokoller, Chip-seq klasse antistoffer som tidligere ble validert i manuell chip-Seq eksperimenter (data ikke vist) ble valgt. Følgende Chip-seq klasse antistoffer ble valgt for denne studien: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og -H3K9me3. Spesifisitet av alle chip-seq klasse antistoffer ble tidligere bekreftet av dot blot, peptid arrays og Western Blot eksperimenter (data ikke vist). Pilot bitvise-qPCR eksperimenter med økende mengder antistoff ble utført for å bestemme sensitiviteten av antistoffene (figur 3). qPCR med minst to positive og to negative kontroll mål ble analysert og profiler med enrichments av positiv enn negativ målet høyere enn femdoblet er kvalifisert for sekvense exper iments. Det er viktig å utføre chip og chip-seq eksperimenter med en høy kvalitet på skåret kromatin. Alle chip eksperimenter vist i denne brosjyren ble utført ved hjelp av frisk kromatin. Det er også mulig å fryse de fikserte celler ved -80 ° C, og fortsette med kromatin forberedelse og skjæring på en annen dag. Men kromatin forberedt fra frosne faste celler kan oppføre seg annerledes enn kromatin tilberedes og derfor Sonikering forhold kan trenge å bli optimalisert for hver kromatin forberedelse. Når det arbeides med forskjellige celletyper, kan skjær buffere med forskjellige vaskemiddelblandinger (SDS) kan brukes. Celletyper som for eksempel primære cellelinjer eller celle dyrket i suspensjon er vanskelige celler til å skjære, og vil kreve høye konsentrasjoner SDS (1%), mens cellelinjer som er lett å skjære slik som HeLa vil kreve lave konsentrasjoner SDS (0,1%) i skjær buffere.
res.jpg "/>
Figur 3. Validering av ChIP-klasse antistoffer ved hjelp av automasjonssystem. ChIP ble utført med anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 og -H3K9me3 kanin polyklonale antistoffer på skåret kromatin fra 1 million HeLa-S3-celler, avhengig av histonmodifikasjonene. Automatiserte Chip protokoller med 200 ul arbeider volumer ble brukt i automatisering instrument for antistoff titrering eksperimenter. Antistoff mengder av 1, 2, 5 og 10 pg ble testet pr ChIP eksperiment og 2 ug IgG ble brukt som negativ kontroll i hvert forsøk. Anrikninger ble vurdert av qPCR. Resultatene er vist som% av inngang (den relative mengden av immunopresipitert DNA i forhold til innspill DNA etter qPCR analyse). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter validering og bestemme optima l mengder ChIP grad antistoffene som skal anvendes i automatiseringssystemet, ble automatisert chip-seq eksperimenter utført for å generere sekvense profiler for hver histon modifikasjon (figur 4).
Figur 4. Histone Chip-seq profiler generert av automatiserte Chip-seq eksperimenter. Figuren viser chip-seq profiler i ulike genomiske regioner for H3K4me3, H3K9ac og H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3, og H3K36me3. 4A viser peak fordeling langs hele X -chromosome og 4B fordelingen i et 75 kb region som omgir GAPDH-genet. 4C viser profilene av H3K27me3, H3K36me3 og H3K4me3 i en 500 kb region som omgir MYT1 genet og 4D viser fordelingen av H3K9me3 i en 200 kb region som omgir ZNF12.large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Histone epigenetiske profiler for seks forskjellige histonmodifikasjonene forbundet med genuttrykk ble generert (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 og H3K36me3). Figur 4A viser ChIP-seq profiler langs kromosom X for de ulike histone markører. Den sterkt topp korrelasjon observert mellom de 6 forskjellige histon profiler indikerer egenskapene til automatisert system for å generere nøyaktige og pålitelige data. Figur 4B, 4C og 4D viser fordelingen av toppene for forskjellige histonmodifikasjonene på bestemte genomiske regioner.
Automatiserte kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter ned til 200 celler
Den minimale mengde av celler som kan anvendes i Chip eksperimenter er avhengig av kvaliteten av kromatin, den specificity og følsomheten av antistoffet og overflod av histon-modifikasjon eller proteinet undersøkt. Velge gode Chip-seq klasse antistoffer er viktig når man jobber med begrensede mengder av prøven og valg av optimale reagenser og ulike operatører forbedrer effektiviteten av DNA utvinning og bidra til suksess for ChIP eksperiment. For å bestemme minimum av celler som den automatiserte ChIP protokollen kan behandle, ulike mengder av kromatin, antistoff, og magnetiske kuler ble testet i IP-Star automatisert system som bruker chip reagenser spesielt optimalisert for å arbeide med lave mengder av kromatin.
Først kromatin fra 10.000 celler ble sonikert som beskrevet i protokollen. Brikken resultatene ble bekreftet av qPCR (figur 5A) som viser betydelige enrichments med H3K4me3 antistoff i positive kontroll regioner og ubetydelig signal i negative kontroll regioner. For sammenligning og bevis på konsistens, additional data innhentet med H3K27ac, H3K9me3 og H3K27me3 antistoffer, som bruker 10 000 celler er gitt.
Automatiserte chip eksperimenter ble utført da å demonstrere egenskapene til det automatiserte systemet til å arbeide med lave mengder av celler ved hjelp av den samme H3K4me3 antistoff. Den automatiserte ChIP gode resultater, vist ved en serie på ti IP reaksjoner som var reproduserbar og meget sammenlignbare med de manuelle chip resultater (Figur 5B). Manuelle og automatiserte eksperimenter ble utført og fordelene av automatiserte protokollene ble sett i å redusere eksperiment for å eksperimentere variabilitet (figur 5C).
Figur 5. Optimalisering av Chip og Auto Chip eksperimenter på 10.000 celler Manuelle chip eksperimenter ble utført på 10 000 celler og bruker 0,25 mikrogram H3K4me3, 0,1 mikrogram H3K27ac, 0,5 mikrogram av H3K9me3 og 0,25 mikrogram av H3K27me3 antistoffer. Identiske mengder av kanin-IgG ble anvendt som en kontroll. QPCR ble utført med primerne for to positive og to negative loci loci for hver brikke assay. Figur 5A viser utvinningen, uttrykt som en prosentandel av inngang (den relative mengde av immunopresipitert DNA sammenlignet med inngangs DNA etter qPCR-analyse). Figur 5B viser 10 Chip reaksjoner kjøre på IP-Star Compact bruker 0,25 mikrogram H3K4me3 polyklonale antistoff og 0,25 mikrogram av kanin IgG som negativ kontroll antistoff. Deretter qPCR analyse ble utført med primere for den positive loci EIF4A2 promoter og GAPDH TSS og den negative loci myoglobin exon2 og SAT2. Figuren viser utvinning, uttrykt som en prosent av inndata (relativ mengde av immunopresipitert DNA sammenlignet med inngangs DNA etter qPCR-analyse). Figur 5C viser H3K4me3 chip-data for 10 manuell chip eksperimenter i forhold til 10 automatiserte chip eksperimenter. Feilfelt representerer s tandard avvik på hver av de ti replikater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å forstå følsomheten av automatiserte chip protokoller, ble eksperimenter utført ved anvendelse av en mengde av celler som varierte fra 100 000 ned til 200 celler pr IP. Den anti-H3K27me3 antistoff ble brukt som det er en meget vanlig histon modifikasjon. Bruken av andre histon eller ikke-histon-antistoffer kan kreve mer eller mindre celler, avhengig av overflod av epitopen og kvaliteten av antistoffet. Forsøkene ble bekreftet ved kvantitativ PCR, og det ble observert at ved å redusere mengder av perler og antistoff bakgrunn i eksperimentene er redusert slik at vellykkede ChIP-qPCR resultater med så lite som 200 celler antistoff (figur 6).
iles / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg "/>
Figur 6. Automatisert chip analyser på 200 celler. Hela S3-celler og antistoff rettet mot H3K27me3. Kromatin ble skåret fra 1 million celler og serielle fortynninger av denne kromatin (fra 100 000 til 200 celleekvivalenter) ble anvendt pr ChIP reaksjon. 1 ug av H3K27me3 og 10 ul protein A-belagte magnetiske kuler ble brukt på 100.000 celler eksperiment, 0,5 ug H3K27me3 og 10 ul av perler på 10000 og 1000-celler, og 0,25 ug H3K27me3 og 5 ul av perler med 500 og 200 celler. 1 mikrogram og 0,5 av mikrogram av kanin IgG ble brukt som negativ kontroll antistoff når du utfører eksperimenter med 100.000 celler og 1000 celler henholdsvis. 6A viser belegg på TSH2B og GAPDH gener i% over inngang. 6B viser relativ belegg på TSH2B versus negativ GAPDH kontroll genomisk region.
Genetisk analyse av ChIP-seq resultater på10.000 celler
For å vurdere den globale kvaliteten av de automatiserte chip-seq eksperimenter med lave utgangs antall celler, automatisert Chip-sekvensanalyser ble utført med 0,25 pg av det H3K4me3 antistoff på 10 000 HeLa-celler og chip eksperimenter på 100 000 HeLa-S3-celler ble brukt som positiv kontroll til eksperimentet. De automatiserte bibliotekene ble utarbeidet etter de Microplex bibliotek forberedelse settreagensene tilpasset preparerte biblioteker med lave DNA beløp. Legg merke til at selv om det er mulig å utføre vellykkede automatiserte chip-eksperimenter med mindre enn 10.000 celler, vil mengdene av trukket ned DNA ikke være nok til å fremstille biblioteker ved hjelp av reagenser. Cluster generasjon og sekvensering ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Den bioinformatikk analyser etter sekvensering viser fremragende resultater fra de lave celle nummer chip prøver. 30 pg datasettet (svarende til 10 000 celler av utgangsmaterialet ) Inneholder lav bakgrunnsstøy og meget pålitelige berikelse topper som er bekreftet ved både 300 pg datasettet (svarende til 100 000 celler av utgangsmaterialet) og H3K4me3 datasettet generert av Broad Institute for ENCODE prosjekt som ble brukt som ekstern henvisning. Det er viktig å være oppmerksom på Topp 40 lapper ratio data, som refererer til en standard metode som brukes i ENCODE 11 prosjekt der ChIP-seq anses reproduserbar hvis man sammenligner to datasett det er minst en 80% overlapping av de beste 40% av toppene rangert etter betydning poengsum. Den 30 pg datasettet oppfyller disse kriteriene i forhold til både 300 pg datasettet (vurderer alle sine topper, ikke bare den beste 40%) og Broad Institute data (tabell 1). 300 pg datasettet viser nesten identiske topper til Broad Institute data med en 98% Topp 40 overlapping ratio (figur 7).
ighres.jpg "/>
Figur 7. Chip analyser og bibliotek generasjon på 10.000 celler ChIP-seq eksperimenter ble generert på 10.000 og 100.000 HeLa-S3 celler ved hjelp H3K4me3 antistoff (0,25 ug / ul). De 35 bp koder ble kartlagt til det menneskelige genom med ELAND aligner. Under den etterfølgende topp ringer SICER kunne pålitelig identifisere de anrikninger av lave celletall, så vel som fra millioner av celler. De datasett som ble analysert og sammenlignet med hverandre og med de referansedata som er generert av Broad Institute. De lave celleprøver er konsistente og har meget stor likhet. Den 30 pg prøve oppfyller Encode kriterier 11 (min. 80% av de øverste 40% av toppene bør overlappe). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1.
Discussion
Kromatin immunoprecipitation fulgt av sekvensering er nå en standard prosedyre. Her en automatisert ChIP-seq protokoll som kan generere kromatin epigenetiske profiler med så få som 10 000 celler av utgangsmateriale presenteres.
Automatisere Chip og bibliotek forberedelse analyser gir standardisere ChIP optimalisering prosedyre og redusere eksperimentell variabilitet. Den flytende håndteringssystem presenteres her eliminerer mange av de manuelle prosedyrer knyttet ChIP redusere hendene på tide å bare 30 min, minimerer prøve tap, og muliggjør nøyaktig ChIP-seq med bare noen få pikogram av bibliotek innspill. For å oppnå vellykket automatiserte Chip-seq eksperimenter, er det også viktig å bruke høy kvalitet skåret kromatin forberedelser og chip-seq klasse antistoffer i hvert forsøk Systemet bruker magnetiske kuler-basert teknologi, og tilbyr fleksibilitet til å endre viktigste eksperimentelle parametre som inkubasjon tid for antistoffet beleggeing og immunoutfellingsstudier trinn eller modifisering av vaske forholdene tillater forskeren å gjennomføre alle nødvendige eksperimenter for ChIP-seq optimalisering. Det automatiserte system er en "åpen" plattform som også tillater sammenligning av flere reagenser i parallell for optimalisering av eksperimentelle betingelser for hvert enkelt cellelinje og antistoff, og muliggjør direkte sammenligning av forskjellige typer og konsentrasjoner av kromatin, forskjellige antistoffer og til og med forskjellige typer av magnetisk perler.
En av begrensningene til automatisert system er det behov for å automatisere alle protokoller i volumer som spenner fra 5 mL til 200 mL. Imidlertid miniatyrisering av forsøkene i dette automatisert plattformen gjør det også mulig å spare kostnader i reagenser.
I tillegg til de protokoller som er beskrevet i denne studien, er at systemet kan tilpasses og også automatiserer forskjellige andre basert på magnetiske kuler applikasjoner som en immunoutfellingnd fangst av metylert DNA (MeDIP og MethylCap teknologier), immunopresipitering av hydroxylmethylated DNA (hMEDIP), sekvensiell kromatin immunopresipitering (ReChIP), RNA immunopresipitering (RNA-IP), bisulfitt konvertering, og DNA rensing analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Life technologies | 14190-094 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T3924-100ML | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | |
| 1.25 M Glycine Solution | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Lysis Buffer iL1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Lysis Buffer iL2 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Shearing Buffer iS1 | Diagenode | C01020010 | Component of the ideal ChIP-seq kit |
| Protease Inhibitors Mix (200x) | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Life technologies | 14175-053 | |
| Lysis Buffer tL1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| ChIP Buffer tC1 | Diagenode | C01010130 | Component of the Auto True Micro ChIP kit |
| ideal ChIP-seq kit | Diagneode | C01010051 | |
| ChIP-Buffer H | Diagenode | C01010020 | Component of the Auto Histone ChIP-seq kit |
| Auto Histone ChIP-seq kit | Diagenode | C01010020 | |
| Auto True Micro ChIP kit | Diagenode | C01010130 | |
| H3K79me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15310068 | |
| H3K27me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410069 | |
| H3K4me3 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410030 | |
| H3K4me2 polyclonal antibody-Classic | Diagenode | C15410035 | |
| H3K9ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410004 | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410200 | |
| H3K36me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410058 | |
| H3K9me3 polyclonal antibody-Premium | Diagenode | C15410193 | |
| Rabbit IgG | Diagenode | C15410206 | |
| Protein-A coated paramagnetic beads | Diagenode | C01010020 | |
| Auto IPure | Diagenode | C03010010 | |
| MicroChIP DiaPure columns | Diagenode | C03040001 | |
| Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml | Diagenode | DMMLD2D100 | |
| Quant-IT dsDNA | Invitrogen | Q32854 | |
| Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA | Illumina | FC-121-3001 | |
| Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| MicroPlex Library Preparation Kit | Diagenode | C05010010 | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Illumina Library prep Quantification kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
| IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Bioruptor Pico | Diagenode | B01060001 | |
| Qubit system | Invitrogen | Q32857 | |
| Illumina Hiseq systems | Illumina |
References
- Dahl, J. A., Collas, P. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP). Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).
- Aldridge, S., et al. AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation. Genome Biology. 14, 124 (2013).
- Farias-Hesson, E., et al. Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms. Journal of Biomedicin., & Biotechnology. 2010, (2010).
- Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms. BioTechniques. 56, 28-35 (2014).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25, Oxford, England. 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137 (2008).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
