Thymectomy completa in ratti adulti con non-invasiva intubazione endotracheale

Abstract

Thymectomy nei roditori neonatale è una procedura consolidata e affidabile per studi immunologici. Tuttavia, in ratti adulti, complicanze di emorragia e pneumotorace di interruzione pleurico può provocare un notevole tasso di mortalità. Questo protocollo è un metodo semplice di timectomia topo che utilizza un mini-sternotomia e intubazione endotracheale. Intubazione è compiuto con un metodo non-invasivo e facilmente riproducibile e consente di ventilazione a pressione positiva per evitare pneumotorace e una via aerea controllata che permette un tempo sufficiente per un'attenta timo dissezione per minimizzare i disagi pleurico. A 1,5 centimetri un'incisione sternale diminuisce il contatto con i vasi del mediastino e pleura, pur fornendo una visualizzazione completa di timo. Dopo l'esposizione del mediastino, il timo viene rimosso per via smussa sotto ingrandimento. Lo spazio pleurico viene poi sigillata da sutura dei muscoli pre-tracheale seguita dall'applicazione di colla chirurgica. Iltorace è poi chiusa da sutura dello sterno, seguita da sutura della pelle. Tutti thymectomies erano completo come evidenziato da immunoistochimica (IHC) colorazione del tessuto mediastinica, e l'assenza di cellule T naive mediante citometria di flusso, e la procedura ha avuto un tasso di sopravvivenza del 96%. Questo metodo è adatto quando timectomia completo di complicazioni minime si desidera per ulteriori studi immunologici nei ratti adulti atimici.

Introduction

Dall'inizio degli anni 1960, il timo è stato riconosciuto per il suo ruolo fondamentale nello sviluppo della tolleranza immunologica centrale. Roditore thymectomy ha dimostrato di essere una procedura essenziale nella definizione del ruolo del timo nella differenziazione dei linfociti, auto-tolleranza e immunotolleranza nella cornice del trapianto allogenico e metastasi tumorali. La rimozione del timo topo permette studi che coinvolgono la deplezione delle cellule T o il trasferimento adottivo di popolazioni di cellule T definiti senza il riemergere di cellule T naive nativi.

Thymectomies nei roditori neonatali può essere realizzato utilizzando una tecnica di aspirazione con risultati affidabili ^1. In ratti adulti, questa tecnica è associata ad un tasso di mortalità approssimativa 20% e spesso si traduce in un timectomia incompleta ^2. Per ottenere sempre completa timectomia in ratti adulti, è necessaria l'esposizione aperta del mediastino attraverso una sternotomia mediana. Tuttavia, questoprocedura è associata a complicazioni che includono lesioni tracheale, emorragia e pneumotorace che porta a un tasso di mortalità complessiva che vanno 1,5-6% ^{2- 4.}

Negli ultimi due decenni, il miglioramento delle tecniche di timectomia sono diminuiti complicanze perioperatorie e hanno migliorato i tassi di sopravvivenza. Intubazione endotracheale consentendo la ventilazione a pressione positiva ha diminuito i tassi di pneumotorace ^5. Metodi di intubazione gamma precedentemente descritti dall'esposizione aperta alla trachea a metodi meno invasivi che utilizzano la visualizzazione diretta delle corde vocali. Le complicanze associate alla procedura di intubazione tracheale includono infortunio, rottura delle corde vocali, non intenzionale intubazione esofagea, e emorragia derivante dalla puntura cardiaca o lacerazione della vena cava superiore. Inoltre, prossimità dei lobi timici inferiori al rivestimento pleurico può provocare pneumotorace.

Qui si descrive una tecnica dithymectomy attraverso un mini-invasiva due centimetri incisione cutanea a seguito di un semplice metodo di intubazione endotracheale utilizzando un angiocatheter smussato-end e l'illuminazione tracheale transcutanea. Il thymectomy comporta una sternotomia 1,5 centimetri ed una chiusura a tre strati con l'applicazione della colla chirurgica per sigillare il mediastino e minimizzare l'incidenza di emorragia e complicazioni respiratorie. Questo metodo assicura in maniera affidabile completa timectomia come evidenziato dalla scomparsa di cellule T naive CD4 ⁺ e CD8 ⁺ seguendo timectomia e l'assenza di tessuto timico sul IHC colorazione. I tempi operativi e mortalità peri-procedurale sono ridotti al minimo.

Protocol

NOTA: Tutte le procedure sperimentali che prevedono l'uso di ratti sono stati fatti secondo protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato della Duke University.

1. Preparazione del tracheale intubazione cannula

1. Tagliare la fine dell'ago di un 2 pollici 14 G angiocathether ago con taglienti.
2. Pinch il lume dell'ago chiuso con pinze ad ago.
3. Tagliare sezione pizzicato fino al bordo della porzione aperta lumen con le pinze di taglio, e quindi tagliare i bordi su entrambi i lati della restante estremità a 30 - 45 ° angolo al bordo dell'ago.
4. Posizionare la parte inferiore 3 - 4 mm della cannula nella zona aperta di pinze slip-joint diritte e tirare verso l'alto fino a quando una leggera curva verso l'alto è formata alla fine.
   NOTA: Ciò faciliterà dirigere il catetere nella trachea (Figura 1).
5. Utilizzare carta vetrata fine per lisciare i bordi all'estremità della cannula.

Procedure 2. Pre-chirurgiche

1. Impostare il sito per la procedura inserendo un microscopio operatorio impostato a 10 volte di ingrandimento su tutta l'area operativa.
2. Posizionare un pad di riscaldamento sul campo operatorio e coprire con un tampone assorbente pulita.
3. Impostare una frequenza cardiaca e un monitor ossigenazione del sangue nei pressi del campo operatorio.
4. Pesare il ratto per basato sul peso farmaci dosaggio (ad esempio, analgesia postoperatoria, antibiotici, o linfociti riducono anticorpi).
   NOTA: tipico ratti adulti pesano tra 350-450 g.
5. Sedate ratto con vaporizzato 3% isoflurano-O ₂ (3 L / min) utilizzando una camera di induzione ventilato ad un sistema di evacuazione dei gas anestetico rifiuti contenenti carbone attivo. Lasciare 5 min per l'induzione dell'anestesia per fornire profonda anestesia necessaria per l'intubazione endotracheale.
6. Somministrare Carprofen o Meloxicane (4,4 mg / kg) per via sottocutanea nel ratto prima di procedere con intubazione e chirurgia.
7. Utilizzare tagliatori elettrici a radersi il collo e il petto del topo anestetizzato prima di intubazione.

3. intubazione

1. Preparare la configurazione intubazione strofinando una piccola quantità di lubrificante (ad esempio, gel KY) sull'estremità della cannula. Accendere il ventilatore per iniziare il flusso di gas isoflurano attraverso il tubo connettore.
2. Trasferire il ratto all'apparato intubazione e sospende il ratto sulla barra metallica dal suo incisivo superiore denti (Figura 2A).
   NOTA: alcuni apparecchi intubazione possono essere acquistati on-line. Il modello mostrato qui è fatto in casa utilizzando un foglio acrilico modellato attorno a sezioni di un pollice pezzo lombare 2 x 4 con una torcia butano, e rinforzi sono attaccati con cloroformio. Il bar (o filo metallico) è attaccato da fori di perforazione oltre nastro adesivo immessi sul side dell'acrilico per evitare scheggiature o crepe.
3. Trans-illuminare il collo del ratto posizionando una fonte di luce ad alta intensità flessibile 1 - 2 cm dalla superficie ventrale del collo (Figura 2B).
4. Utilizzare un paio di pinze studente modello standard per tirare la linguetta leggermente verso l'alto e verso il lato dei denti inferiori. Grip linguetta tra il pollice e l'indice di una mano mentre si posiziona la superficie interna piatta di un lato della pinza contro l'estremità inferiore della lingua. Premere ventralmente per esporre l'epiglottide e l'apertura della laringe (Figura 2C).
5. Visualizzare le corde vocali e guidare la rovesciata, estremità smussata della cannula intubazione anteriormente attraverso la glottide aperta nella trachea fino mozzo della angiocatheter tocca incisivi.
6. Togliere il mandrino metallico, e collegare il tubo dell'anestesia all'apertura angiocatheter per cominciare la ventilazione con isoflurano.
   NOTA: Il tipico flo ossigenotasso w al ventilatore è 3 L / min con il 3% isoflurano.
   1. Impostare il ventilatore ad una velocità di 60 respirazioni / min in una modalità ventilatore controllato volume raggiunge una pressione di ~ 12 - 14 mmHg. Utilizzare una pressione positiva di fine espirazione (PEEP) del 3 cm H ₂ O.
7. Osservare espansione parete toracica bilaterale in sincronia con il ventilatore per garantire il corretto posizionamento del tubo endotracheale.
8. Applicare veterinario consigliato occhio pomata agli occhi del ratto per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
9. Applicare veterinario pomata sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
10. Fissare il tubo endotracheale alla testa del ratto con una striscia di nastro di stoffa. Garantire un collegamento stabile tra il tubo endotracheale e la tubazione afflusso anestetico.
11. Attaccare l'ossigenazione del sangue e il monitor della frequenza cardiaca al piede del ratto e iniziare il monitoraggio. Verificare il corretto anestesia confermando non vi è alcuna reazione ae-pizzico.

4. Toracotomia e Thymectomy

1. Seguire tecnica asettica standard per l'interezza della procedura.
   1. Pulire l'area e il funzionamento tavolo di lavoro e disinfettare con una soluzione di etanolo al 70%.
   2. Utilizzare guanti chirurgici sterili durante la procedura, e autoclave tutti gli strumenti ei materiali utilizzati durante la procedura.
   3. Applicare Providone-iodio per l'intera area del torace e lasciarlo asciugare. Poi pulire la superficie della pelle con il 70% di etanolo su garza. Coprire il ratto con involucro di plastica trasparente tagliare un buco per esporre il campo operatorio sterile.
2. Identificare soprasternale nella regione toracica superiore. Effettuare un'incisione di 2 cm mediana attraverso la pelle partenza 2 - 3 mm sopra il soprasternale e si estende distalmente linea mediana che attraversa lo sterno con le forbici Shea punta smussata.
3. Eseguire una sternotomia mediana 1,5 centimetri dal soprasternale di nuovo con le forbici Shea punta smussata. KEEP il bordo inferiore delle forbici appena sotto lo sterno e avanzare lentamente.
4. Inserire un piccolo divaricatore Alm appena sotto lo sterno separati e si apre per rivelare il muscoli cinghia pre-tracheale (sterno-ioideo e muscoli sterno-tiroideo). Separare i muscoli cinghia pre-tracheale con smussato pinze Graefe. NOTA: A questo punto, la trachea può essere visto, e il tubo di intubazione deve essere visualizzato all'interno della trachea.
5. Posizionare le punte del piccolo divaricatore Alm sotto i muscoli cinghia separati e sterno. Aprire riavvolgitore per esporre la porzione superiore del timo.
6. Utilizzare pinza sottile Dumont per rilasciare i bordi laterali del tessuto del timo e esporre i lobi timici inferiori.
7. Estrarre il timo delicatamente superiormente al sito di incisione aperta, avendo cura di evitare il contatto con i vasi vena cava, succlavia e carotidi superiori, e per minimizzare i disagi del rivestimento pleurico delicato tra il timo ei polmoni.
8. Come tegli timica vasi sono sezionati e rivelati, utilizzare micro-forbici per dividerli. Usare un tampone di cotone per mantenere la pressione sui vasi di emostasi, se necessario.
9. Consegnare i lobi timici inferiori nell'incisione e poi bruscamente lisare gli allegati posteriori. Rimuovere il timo intatta e controllare attentamente il timo rimosso in tutte le sezioni mancanti.
   NOTA: I piccoli linfonodi del torace possono essere visualizzati circonda il timo e sono spesso difficili da distinguere dal tessuto del timo. Questi saranno i nodi discreti rotondi con un aspetto simile al tessuto del timo, ma non sarà in continuità con il timo.
10. Rimuovere il divaricatore Alm e chiudere i muscoli sterno-ioideo e sternothyoid con due interrotto 5-0 suture Maxon.
11. Applicare 2 gocce di tessuto adesivo cianoacrilato grado chirurgico attraverso le suture per sigillare il mediastino sotto ventilazione a pressione positiva.
    NOTA: Questo diminuire l'incidenza di pneumotorace ed ematoma.
12. Chiudere la sternum con due interrotto 4-0 punti di sutura di seta su un ago di taglio. Inserire l'ago attraverso spazi fra le costolette, avendo cura di guidare l'ago appena sotto lo sterno per evitare lo strato muscolare sottostante.
13. Chiudere lo strato di pelle con un running 4-0 Nylon sutura. Interrompere l'isoflurano a questo punto di abbreviare il periodo di recupero post-operatorio anestesia.
14. Pulire il sito di incisione e la pelle circostante con garza salina-inumidito.
15. Applicare alcune gocce di bupivicaina (0,25%) per l'anestesia locale, seguito da 1 - 2 gocce di colla cianoacrilato sopra l'incisione per sigillare l'incisione.
16. Continuare a ventilazione fino a quando il topo mostra segni di sforzo respiratorio indipendente e comincia a muoversi sue estremità. Estubare ratto e permettono di recuperare sotto stretta osservazione in una gabbia posta su un rilievo di riscaldamento.
17. Somministrare Buprenorfina (0,01-0,05 mg / kg) per via sottocutanea per il ratto subito dopo l'intervento e ripetere ogni 8-12 ore per 48 ore post-operatorio (normalmente 5 dosi totali). A 24 e 48 ore dopo l'intervento, l'amministrazione Carprofen o Meloxicane (4,4 mg / kg) per via sottocutanea (3 dosi totali, comprese la dose pre-operatoria).
18. Continuare a monitorare fino a quando il topo si muove intorno alla gabbia. A tutti i segni di difficoltà respiratoria, effettuare re-intubazione e ri-esplorazione del torace.
    1. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
    2. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
19. Rimuovere le suture strato di pelle 1 settimana dopo l'intervento.

Representative Results

Questa procedura è stata eseguita su ratti adulti Lewis (n = 26). Il tempo di funzionamento medio è stato di 15 ± 3 min. Non c'era la mortalità intraoperatoria. Il tempo medio di intubazione - dal posizionamento del ratto su dell'apparato intubazione alla costituzione di ventilazione - è stato di 45 ± 5 sec. 24 ratti avevano un pieno recupero dall'operazione senza evidenza di difficoltà respiratorie o emorragia attraverso giornata post-operatoria (POD) 14. Un ratto sviluppato difficoltà respiratorie in POD 4 e sottoposti-operazione nuovamente per esplorare il mediastino. Il ratto è stato trovato per avere un lobo polmone collassato. Dopo riespansione del polmone, del mediastino stato nuovamente sigillato con colla chirurgica sotto ventilazione a pressione positiva e la cassa è stato nuovamente chiuso. Il ratto recuperato con piena senza ulteriori anomalie respiratorie. Un topo morto il POD 7 per cause sconosciute.

Il mediastino post-timectomia è stato ispezionato per timo conservato e il tessuto del timo rimosso era visually ispezionato per le sezioni mancanti e successivamente sottoposti ad esame istologico. Alla necroscopia, tessuto toracico è stato esaminato da ematossilina-eosina (H & E) macchia. Immunoistochimica (IHC) per citocheratina è stata quindi eseguita per differenziare il tessuto del timo residuo dai nodi toracici linfonodi (LN), concentrandosi in particolare sulle sezioni con livelli più elevati di colorazione nucleare di H & E, come è normale per il tessuto del timo. Citocheratina colorazione è stata effettuata utilizzando pan coniglio anti-citocheratina come primario ab, seguita da IgG anti-coniglio di capra biotinilato e Vectastain Elite ABC Kit diapositive sono stati contro-colorate con ematossilina prima microscopia valutazione. Tessuto timico può essere distinto dal LNs toraciche dalla colorazione nucleare densa su H & E (Figura 3A e 3B) ed un modello caratteristico pizzo di citocheratina colorazione, che differisce dalla mancanza di citocheratina colorazione visto in LNs (Figure 3C e 3D).

Campioni di sangue periferico ottenuteratti da eutanasia sono stati analizzati per esaurimento persistente delle cellule T naive. Brevemente, i globuli rossi sono state lisate con tampone e lisi ACK leucociti del sangue periferico (PBL) sono state lavate due volte con PBS 2% FBS prima colorate con anticorpi per 30 min a 4 ° C. PBLs stati poi fissate con 4% w / v paraformaldeide in soluzione salina tamponata pH neutro prima dell'analisi da multicolore citometria a flusso. Totale cellule T sono stati identificati mediante colorazione PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) con anti-CD45 + e CD3 +, e le cellule T naive sono stati identificati dalla colorazione con anti-CD45RC, anti-CD62L e sia anti-CD4 o anti-CD8. Le percentuali di ciascuna sottopopolazione di cellule T sono stati moltiplicati per il numero dei linfociti assoluto (ottenuto dal Duca Vet Lab diagnostica clinica) per determinare il conteggio delle cellule. Rappresentante Naïve CD4 ⁺ e CD8 ⁺ T-cellule totali e conta delle cellule T sono mostrati in Figura 4. Ratti Thymectomized mantenuti conteggi totali delle cellule T rispetto al controllo rats ma ha dimostrato la perdita delle popolazioni di cellule T naive.

Figura 1. Struttura della cannula. La cannula è formata da ottundimento la fine del mandrino di 14 G x 2 pollici angiocatheter. Il distale 3 mm di mandrino è leggermente piegato per guidare il catetere ventrale per facilitare l'intubazione tracheale. (A) Vista laterale di stiletto in metallo. (B) Vista laterale della angiocatheter su stiletto. (C) Visualizzazione ingrandita della punta smussata del mandrino.

Figura 2. Una piattaforma intubazione inclinato viene utilizzato per posizionare il ratto per intubazione. Il ratto è sospesa dalla barra metallica della piattaforma intubazione dai suoi incisivi superiori. A Sourc lucee verrà quindi posizionata ventrale al collo del topo per trans-illuminare la faringe. Forcipe sono usati per tenere la lingua ed esporre l'apertura della laringe. (A) Vista dall'alto e (B) vista laterale della piattaforma di intubazione. (C) Diagramma della visualizzazione della glottide dopo la sospensione del ratto e l'esposizione della laringe . La laringe nel diagramma è una diapositiva acquistato da Motifolio.

Figura 3. H & E e citocheratina colorazione del tessuto mediastinica può distinguere timo dal linfonodi. Ematossilina e eosina (H & E) colorazione di un timo normale (A) e LN toracica (B). Citocheratina colorazione del tessuto del timo (C) e una LN toracica recuperato post-timectomia Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Attrito di sangue periferico naïve cellule T post-timectomia. Totale delle cellule T, ingenui cellule T CD4 + e CD8 + T naive dove quantificata da PBLs mediante citometria di flusso in pre-timectomia (Pre) e ratti 4 settimane post-timectomia (Post ). I dati sono mostrati per un ratto per gruppo e sono rappresentativi dei risultati complessivi ottenuti.

Discussion

Il presente protocollo per completare timectomia fornisce un approccio mini-invasivo con una chiusura un'incisione a tre strati con l'applicazione colla chirurgica per ridurre al minimo le complicanze. La rimozione completa del timo è stata dimostrata dalla perdita di cellule T naive e IHC colorazione del tessuto linfoide mediastinica per citocheratina.

La procedura di ratto adulto timectomia è stata complicata dalla mortalità da 1,5 - 20% a causa di complicazioni perioperatorie, molti dei quali sono il attribuibile alla intima associazione dei lobi inferiori del timo con la pleura, il cuore e la grandi vasi del mediastino ^2-4. Aperte le tecniche di intubazione tracheale, dove la trachea viene forato, hanno un tasso di mortalità del 6% ^2. L'uso di intubazione tracheale non invasiva è stato riportato da Na e collaboratori; Tuttavia, i tassi di sopravvivenza non sono stati riportati ^5. Intubazione con la cannula preparato come descritto quicon illuminazione tracheale transcutanea permette chiara visualizzazione delle corde vocali per intubazioni sempre successo. Nessuna attrezzature avanzate è necessaria per il metodo presentato, che si differenzia dalle altre, presentate tecniche non invasive ^{2,5- 8.} Il nostro metodo di ottundimento la fine di un ago angiocatheter e creando una piega verso l'alto, alla fine rende facile evitare accidentali intubazione esofagea e minimizza il trauma tracheale. Questi sono miglioramenti a un metodo precedentemente descritto di intubazione anche utilizzando una angiocatheter modificato ^9.

Troviamo che mantenere l'incisione sternale al minimo diminuisce contatto con grossi vasi mediastinici e rischio associato di emorragia pur consentendo un adeguato esposizione per rimozione completa del timo. Teoricamente, l'incisione più piccola dovrebbe anche ridurre il dolore e il tempo di recupero post-procedurale. L'uso di colla di fibrina è stata riportata come modifica di un intubazione tracheale apertaprocedura per evitare pneumotorace e lesioni delle vie aeree ^2. Abbiamo trovato che l'applicazione di una piccola quantità di colla sui muscoli pre-tracheali suturati applicando una pressione positiva sigilla adeguatamente la cavità pleurica e aiuta a prevenire le complicanze respiratorie postoperatorie.

Ci sono alcuni aspetti del protocollo che sono importanti per evidenziare quindi la procedura può essere eseguita con successo. È importante proteggere il tubo anestesia con nastro adesivo adeguato perché è possibile scollegare il flusso di gas durante l'operazione mani del chirurgo sono posizionati vicino alla testa del ratto e la visualizzazione è focalizzata solo sul sito chirurgico al microscopio. L'eventuale lubrificazione minima applicata alla cannula prima intubazione impedisce la cannula di scivolare nell'esofago. Durante la chiusura multistrato, ma aiuta anche applicare l'adesivo cianoacrilato tessuto attraverso un piccolo ago calibro con una siringa, che consente un'applicazione precisa e previene accidentali eccessiva applicazione di colla.

Questa procedura non permette ri-vascolarizzazione del timo rimosso in un topo ricevente, che è stato descritto altrove ^10. Abbiamo anche fatto non tentare questa procedura in topi, che sono spesso utilizzati per gli studi immunitarie. Le descrizioni più recenti della procedura timectomia in topi adulti coinvolgono sia vuoto aspirazione del timo dopo l'esposizione, che ha alta percentuale di complicanze in ratti adulti, oppure un metodo di dissezione che è simile alla nostra procedura ^11,12. La chiusura non viene eseguita in strati, e anestesia è raggiunto mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital, che non mandato intubazione. I principali limiti della procedura timectomia in qualsiasi roditori sono il requisito di un microscopio operatorio, che può essere molto costoso, e le competenze tecniche necessarie per operare sotto ingrandimento ed eseguire la procedura rapidamente.

content "> timectomia completa in ratti adulti facilita studi immunologici che coinvolgono lo sviluppo delle cellule T, la reattività delle cellule T e la tolleranza negli studi di trapianto e di tumore, e gli studi su deplezione delle cellule T nei ratti atimici ^{13- 15.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 inch 14 G angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator) and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity fiber optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35