Komplett tymektomi hos voksne rotter med Non-invasiv endotrakeal intubering

Abstract

Thymektomi i neonatale gnagere er en etablert og pålitelig prosedyre for immunologiske studier. Men hos voksne rotter, kan komplikasjoner av blødning og pneumothorax fra pleural avbrudd resultere i en betydelig dødelighet. Denne protokollen er en enkel metode for rotte thymektomi som utnytter en mini-sternotomi og endotrakeal intubasjon. Intubasjon oppnås med en ikke-invasiv og lett reproduserbar fremgangsmåte og gir mulighet for overtrykksventilasjon for å hindre pneumothorax og en kontrollert luftveier som gjør at tilstrekkelig tid for forsiktig disseksjon thymus å minimalisere pleural avbrudd. En 1,5 cm sternum snitt reduserer kontakt med mediastinum fartøy og pleura, samtidig gi full visualisering av thymus. Etter eksponering av mediastinum, er thymus fjernes ved stump disseksjon under forstørrelse. Pleurahulen blir deretter forseglet ved sutur lukking av pre-luftrørsmuskler etterfulgt av påføring av kirurgisk lim. Denthorax blir deretter lukket ved sutur lukking av brystbenet, etterfulgt av sutur lukking av huden. Alle thymectomies var fullført som vist ved immunhistokjemisk (IHC) farging av mediastinum vevet, og fravær av naive T-celler ved flow-cytometri, og fremgangsmåten hadde en 96% overlevelse. Denne metoden er egnet når komplett thymektomi med minimale komplikasjoner er ønskelig for ytterligere immunologiske studier i atymiske voksne rotter.

Introduction

Siden tidlig på 1960-tallet, har thymus blitt anerkjent for sin kritiske rolle i utviklingen av sentrale immunologiske toleranse. Gnager thymektomi har vist seg å være en viktig undersøkelse i å definere rollen av thymus i lymfocytt differensiering, self-toleranse, og immunotolerance i innstillingen av allograft transplantasjon og tumor metastasering. Fjerning av rotte thymus åpner for studier med T-celle uttømming eller adoptiv overføring av definerte T celle populasjoner uten en ny fremvekst av innfødte naive T-celler.

Thymectomies i neonatale gnagere kan oppnås ved hjelp av en sugeteknikk med pålitelige resultater ^1. Hos voksne rotter, er denne teknikken forbundet med en omtrentlig 20% dødelighet, og ofte resulterer i en ufullstendig thymektomi ^2. Å konsekvent oppnå fullstendig tymektomi hos voksne rotter, er åpen eksponering av mediastinum gjennom en median sternotomi nødvendig. Men denneProsedyren er forbundet med komplikasjoner som inkluderer tracheal skade, blødning og pneumothorax føre til en total dødelighet strekker 1,5 til 6% ^2-4.

I løpet av de siste to tiårene forbedringer i thymektomi teknikker har redusert perioperative komplikasjoner og har bedret overlevelse. Endotrakeal intubasjon åpner for overtrykksventilasjon har minsket pneumothorax priser ^5. Metoder for intubasjon tidligere beskrevet varierer fra åpen eksponering til luftrøret til mindre invasive metoder ved hjelp av direkte stemmebånd visualisering. Komplikasjoner forbundet med intubasjon prosedyren inkluderer tracheal skade, stemmebånd brudd, utilsiktet esophageal intubasjon, og blødning som følge av hjertestans punktering eller sårskader av den overlegne vena cava. I tillegg kan nærhet av de nedre fliker tymiske til pleural foring resultere i pneumothorax.

Her beskriver en teknikk forthymektomi gjennom en minimal invasiv 2 cm innsnitt følge en enkel fremgangsmåte for endotracheal intubasjon ved anvendelse av en avstumpet ende angiocatheter og transkutan tracheal belysning. Den thymektomi innebærer en 1,5 cm sternotomi og en tre-lags lukking med kirurgisk lim søknad for å forsegle mediastinum og minimere risikoen for blødning og respiratoriske komplikasjoner. Denne metoden resulterer i fullstendig pålitelig thymektomi som vist ved forsvinningen av CD4 ⁺ og CD8 ⁺ naive T-celler etter thymektomi og fravær av thymus-vev på IHC-farging. Operative tider og peri-prosessuelle dødelighet holdes på et minimum.

Protocol

MERK: Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer bruk av rotter ble gjort i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og bruk komité Duke University.

1. Klargjøring av intubasjonsforhold Kanyle

1. Klipp av nålen slutten av en 2 tommers 14 G angiocathether nål med avbitertang.
2. Knip lumen nålen lukket med spisstang.
3. Skjær klemt delen ned til kanten av den åpne lumen del med avbitertang, og deretter klippe kantene på begge sider av den gjenværende slutten på 30 - 45 ° vinkel til nålen kanten.
4. Plasser de nederste 3-4 mm av kanylen inn i det åpne området av rette glideskjøt tang og trekke oppover til en svakt stigende kurve har blitt dannet i enden.
   MERK: Dette vil gjøre det lettere å styre kateter inn i luftrøret (figur 1).
5. Bruk fint sandpapir for å glatte kantene ned ved enden av kanylen.

2. Pre-kirurgiske prosedyrer

1. Satt opp området for prosedyren ved å plassere et operasjonsmikroskop satt til 10X forstørrelse over driftsområdet.
2. Plasser en oppvarming pad på operasjonsområdet og dekk med en ren absorberende bit.
3. Sett opp en hjertefrekvens og oksygentilførsel i blodet skjermen nær operasjonsområdet.
4. Vei rotte for vektbasert medisinering dosering (f.eks, postoperativ analgesi, antibiotika, eller Lymfocyttreduserende antistoff).
   MERK: Typisk voksne rotter veier mellom 350-450 g.
5. Sedat rat med fordampede 3% isofluran-O ₂ (3 l / min) ved hjelp av en induksjons kammeret ventilert til et avfalls bedøvende gass fjerningssystem inneholdende aktivt kull. Tillate 5 min for anestesi induksjon å gi dyp anestesi nødvendig for endotrakeal intubasjon.
6. Administrere Carprofen eller Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutant til rotten før du fortsetter med intubasjon og kirurgi.
7. Bruk elektriske klippere å barbere halsen og brystet av den bedøvet rotte før intubasjon.

3. Intubasjon

1. Forberede intubasjon oppsett ved å gni en liten mengde smøring (f.eks KY gel) på slutten av intubasjon kanyle. Slå på respiratoren for å starte strømmen av isofluran gass gjennom kontaktrøret.
2. Overfør rotte til intubasjon apparater og suspen rotta på metallstangen ved sin øvre fortann tenner (Figur 2A).
   MERK: Visse intubasjon apparater kan kjøpes online. Modellen som vises her er hjemmelaget ved hjelp av en akryl ark støpt rundt deler av en 2 x 4 tommers korsrygg stykke ved hjelp av en butan lommelykt, og forsterkninger er festet med kloroform. Baren (eller metalltråd) er festet ved å bore hull enn maskeringstape plassert på side av akryl for å forebygge splintres eller sprukket.
3. Trans-belyse rottens nakke ved å plassere en fleksibel høyintensiv lyskilde 1 - 2 cm fra baksiden av halsen (figur 2B).
4. Bruke et par av studentstandardmønster tang for å trekke tungen forsiktig oppover og til siden av de nederste tenner. Grep tungen mellom tommel og pekefinger på en hånd mens plassere den flate indre overflate av en side av tang mot den nedre ende av tungen. Trykk ventralt for å eksponere strupelokket og blenderåpning i strupehodet (figur 2C).
5. Visualisere stemmebåndene og veilede hvelvet, avstumpet slutten av intubasjon kanyle anteriorly gjennom åpen glottis inn i luftrøret til navet på angiocatheter berører fortennene.
6. Fjern metall stylet, og fest anestesi slangen til angiocatheter åpning for å starte ventilasjon med isofluran.
   MERK: Den typiske oksygen flow hastighet til ventilator er 3 l / min med 3% isofluran.
   1. Sett respiratoren ved en hastighet på 60 respirasjon / min i et volum kontrollert ventilator modus som oppnår et trykk på ~ 12-14 mmHg. Bruk en positiv end-ekspiratorisk trykk (PEEP) på 3 cm H ₂ O.
7. Observere bilateral brystveggen ekspansjon i sync med ventilator for å sikre riktig plassering av endotrakealtuben.
8. Påfør veterinær anbefalte øyesalve til rotte øyne for å hindre tørrhet mens under narkose.
9. Påfør veterinær salve på rotte øyne for å hindre tørrhet mens under narkose.
10. Fest endotrakealtuben til hodet på rotta med en stripe av tøy tape. Sikre en fast forbindelse mellom endotrakealtuben og anestesi tilsig tubing.
11. Fest blod oksygenering og pulsmåler til rotte fot og begynne overvåking. Bekreft riktig anesthetization ved å bekrefte det ingen reaksjon på åe-klemme.

4. Torakotomi og thymektomi

1. Følge standard aseptisk teknikk for helheten av fremgangsmåten.
   1. Rens arbeidsområde og operasjonsbordet og desinfisere med en 70% etanolløsning.
   2. Bruk sterile kirurgiske hansker under prosedyren, og autoklav alle instrumenter og materialer som brukes under prosedyren.
   3. Påfør providone-jod til hele brystet og la den tørke. Deretter rengjør overflaten av huden med 70% etanol på gasbind. Dekk rotte med klar plastfolie skjære et hull å eksponere sterilt operasjonsfelt.
2. Identifisere suprasternal hakket i øvre thorax-regionen. Gjør en 2 cm midtlinjen snitt gjennom huden starter 2-3 mm over suprasternal hakk og som strekker seg distalt midtlinje langs brystbenet med butte-tipped Shea saks.
3. Utfør en 1,5 cm median sternotomi fra suprasternal hakk igjen med butte-tipped Shea saks. KEEP nedre kant av saksen like under brystbenet og avansere sakte.
4. Sett inn en liten Alm retractor like under den separerte sternum og åpen for å avdekke den pre-tracheal stropp muskler (sternohyoid og sternothyroid muskler). Skill de pre-tracheal stroppen muskler med butte Græfe tang. MERK: Ved dette punkt, trachea kan sees, og intubasjon røret skal visualiseres inne i luftrøret.
5. Plasser utstikkerne av den lille Alm retractor under separerte stroppen muskler og brystbenet. Åpne rullen for å eksponere den overlegne aspekt av thymus.
6. Bruk tynne Dumont pinsett for å frigjøre de laterale kanter av thymus vevet og eksponere den nedre tymiske fliker.
7. Trekk thymus forsiktig overlegent i det åpne innsnitt området, ta vare å unngå kontakt med den overlegne vena cava, subclavia og carotis fartøyer, og for å minimere avbrudd av den delikate pleural fôr mellom thymus og lungene.
8. Som than thymisk fartøyene dissekert og avslørt, bruker mikro-saks til å dele dem. Bruk en bomullspinne for å holde press på skipene for hemostase hvis nødvendig.
9. Lever de lavere thymic lapper i snittet og deretter kraftig lyse den bakre vedlegg. Fjerne den intakte thymus og nøye inspisere fjernet thymus for eventuelle manglende deler.
   MERK: Små thorax lymfeknuter kan bli visualisert rundt thymus og er ofte vanskelig å skille fra tymisk vev. Disse vil være adskilte runde noder med et lignende utseende som tymisk vev, men vil ikke være i kontinuitet med thymus.
10. Ta av Alm retractor og lukke sternohyoid og sternothyoid muskler med to avbrutt 5-0 Maxon sting.
11. Påfør to dråper kirurgisk karakter cyanoacrylate vevlim over sting å forsegle mediastinum under positivt press ventilasjon.
    MERK: Dette vil redusere forekomsten av pneumothorax og hematom.
12. Lukk sternum med to avbrutt 4-0 silkesuturer på en klippe nål. Stikk nålen gjennom åpninger mellom ribbeina, ta vare å guide nålen rett under brystbenet for å unngå den underliggende muskel lag.
13. Lukk hudlaget med en løpende 4-0 Nylon sutur. Avvikle isofluran på dette punktet for å forkorte den postoperative anestesi utvinning perioden.
14. Rengjør innsnitt området og huden rundt med saltvann fuktet gasbind.
15. Anvende flere dråper Bupivicaine (0,25%) for lokal anestesi, etterfulgt av 1 - 2 dråper av cyanoakrylat-lim over innsnittet for å tette snittet.
16. Fortsett å ventilere til rotta viser tegn på uavhengig åndedretts innsats og begynner å bevege sine ekstremiteter. Extubate rotte og la den komme under nøye observasjon i et bur plassert på en oppvarming pad.
17. Administrere buprenorfin (0,01 til 0,05 mg / kg) subkutant til rotter umiddelbart postoperativt og gjenta hver 8-12 timer i 48 timer post-operativt (normalt 5 totaldoser). På 24 og 48 timer postoperativt, administrere Carprofen eller Meloxicane (4,4 mg / kg) subkutant (3 totalt doser inkludert pre-operative dose).
18. Fortsette å overvåke inntil rotte beveger seg rundt i buret. På noen tegn til pustevansker, utføre re-intubasjon og re-utforskning av brystet.
    1. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternum recumbency.
    2. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt restituert.
19. Fjerne hud lag sting en uke etter operasjonen.

Representative Results

Denne prosedyren ble utført på voksne Lewis-rotter (n = 26). Den midlere driftstiden var 15 ± 3 min. Det var ingen intraoperativ dødelighet. Middelverdien intubasjon gang - fra plassering av rotte på intubasjon apparat til etablering av ventilasjon - var 45 ± 5 sek. 24 rotter hadde en full gjenoppretting fra driften uten tegn til pustevansker eller blødning gjennom postoperative dag (POD) 14. En rotte utviklet pustevanskeligheter på POD 4 og gjennomgikk ny operasjon for å utforske mediastinum. Rotte ble funnet å ha en kollapset lunge lapp. Etter re-ekspansjon av lungen, mediastinum ble gjen forseglet med kirurgisk lim under positivt trykk ventilasjon og brystet ble på nytt lukket. Rotte utvinnes med fullt uten videre respiratoriske unormalt. En rotte døde på POD 7 av ukjente årsaker.

Den post-thymektomi mediastinum ble inspisert for beholdt thymus og fjernet thymus vev var visually inspisert for manglende deler og senere undersøkt histologisk. Ved obduksjon ble thorax vev undersøkt av hematoxylin-eosin (H & E) flekken. Immunhistokjemi (IHC) for cytokeratin ble deretter utført for å skille rest thymic vev fra thorax lymfeknuter (LN), med fokus spesielt på strekninger med høyere nivåer av nukleær farging av H & E som er normalt for thymus vev. Cytokeratin farging ble utført ved hjelp av kanin pan anti-cytokeratin som den primære ab, etterfulgt av biotinylerte geit anti-kanin IgG og Vectastain Elite ABC Kit Slides ble kontra farget med haematoxylin før mikroskopi evaluering. Thymisk vev kan skilles fra thorax LNS ved tettere nukleær farging med H & E (figur 3A og 3B) og et karakteristisk mønster av Lacy cytokeratin flekker, som skiller seg fra fraværet av cytokeratin farging sett i LNS (figurene 3C og 3D).

Perifere blodprøver innhentetfra avlives rottene ble analysert for vedvarende uttømming av naive T-celler. Kort sagt ble de røde blodceller ble lysert med ACK lysebuffer og perifere blod leukocytter (PBL) ble vasket to ganger med PBS 2% FBS før farget med antistoffer i 30 minutter ved 4 ° C. PBL ble deretter fiksert med 4% w / v paraformaldehyd i nøytral pH-bufret saltvann før analyse ved flerfarge flowcytometri. Total T-celler ble identifisert ved farging PBMC (mononukleære celler fra perifert blod) med anti-CD45 og CD3 + +, og naive T-celler ble identifisert ved farging med anti-CD45RC, anti-CD62L, og enten anti-CD4- eller anti-CD8. Prosenter for hver T-celle subpopulasjon ble multiplisert med den absolutte lymfocytter (fås ved Duke Vet Clinical Diagnostic Lab) for å bestemme celletall. Representative naive CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celle og totale T-celletall, er vist i figur 4. Thymectomized rotter opprettholdt samlede T-celle-verdiene sammenlignet med kontroll rATS men viste tap av naive T-celle populasjoner.

Kanylen er dannet av blunting enden av stilett med en 14 G x 2 tommer angiocatheter Figur 1. Utforming av intubasjon kanyle.. Den distale 3 mm av stilett er litt bøyd for å veilede kateteret ventralt å lette intubasjonsforhold. (A) Side view of metall stylet. (B) Side view of angiocatheter løpet stylet. (C) Forstørret visning av avstumpet spissen av stylet.

Figur 2. En skrå intubasjon plattformen blir brukt til å posisjonere rat for intubasjon. Rotten blir opphengt fra metallstangen for intubasjon plattform ved sin øvre fortennene. Et lys Source vil da bli plassert ventral til rotte hals til trans-belyse svelget. Tang blir brukt til å holde tungen og eksponere åpningen av strupehodet. (A), sett ovenfra, og (B) fra siden av intubasjon plattform. (C) Diagram for visualisering av glottis etter suspensjon av rotte og eksponering av strupehodet . Strupehodet i diagrammet er fra et lysbilde kjøpt fra Motifolio.

Figur 3. H & E og cytokeratin farging av mediastinum vev kan skille thymus fra lymfeknuter. Hematoksylin og eosin (H & E) farging av en normal thymus (A) og thorax LN (B). Cytokeratin farging av thymic vev (C) og en thorax LN restituert etter thymektomi Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Slitasje av perifert blod naive T-celler etter tymektomi. Total T-celle, naive CD4 + T-celler og naive CD8 + T-celler hvor kvantifisert fra PBLs av flowcytometri i pre-tymektomi (Pre) og rotter fire uker etter thymektomi (Post ). Data er vist for en rotte per gruppe og er representative for de samlede resultatene som er oppnådd.

Discussion

Den nåværende protokoll for komplett thymektomi gir en minimal invasiv tilnærming med en tre lags snitt lukking med kirurgisk lim program utviklet for å redusere faren for komplikasjoner. Fullstendig fjerning av thymus ble demonstrert ved tap av naive T-celler, og ved IHC-farging av mediastinum lymfoid vev for cytokeratin.

Prosedyren for voksen rotte thymektomi har blitt komplisert av dødelighet fra 1,5 - 20% på grunn av peri-operative komplikasjoner, hvorav de fleste er det tilskrives den intime sammenslutning av de lavere fliker av thymus med pleura, hjertet og store mediastinum fartøy ^2-4. Åpne intubasjonsforhold teknikker, hvor luftrøret er punktert, har en 6% dødelighet ^to. Bruken av ikke-invasiv intubasjonsforhold har blitt rapportert av Na og medarbeidere; imidlertid ikke ble rapportert overlevelse ^fem. Intubasjon med kanylen fremstilt som beskrevet hermed transkutan tracheal belysning tillater tydelig visualisering av stemmebåndene for konsekvent vellykkede intubations. Ingen avansert utstyr er nødvendig for den presenterte metoden, som skiller seg fra andre rapporterte ikke-invasive teknikker ^{2,5- 8.} Vår fremgangsmåte for blunting enden av en angiocatheter nål og å skape en oppadrettet bøyning i enden som gjør det lettere å unngå utilsiktet øsofageal intubasjon og minimerer tracheal traumer. Dette er en forbedring av tidligere beskrevne fremgangsmåte for intubasjon også ved hjelp av en modifisert angiocatheter ^9.

Vi finner at det å holde den sternal innsnitt til et minimum reduserer kontakt med store mediastinale fartøy og tilhørende risiko for blødning mens du lar tilstrekkelig eksponering for fullstendig fjerning av thymus. Teoretisk sett skal det mindre snitt også minske post-prosessuelle smerte og utvinning tid. Bruken av fibrin-lim ble først rapportert som en modifikasjon av en åpen trakeal intuberingprosedyre for å hindre pneumothorax og luftveisskader ^2. Vi har funnet at anvendelse av en liten mengde lim i de sutureres pre-luftrørsmuskler mens søknad positivt trykk tilstrekkelig tetter pleuralhulrommet, og bidrar til å forhindre post-operative komplikasjoner respiratoriske.

Det er noen aspekter av protokollen som er viktig å understreke, slik prosedyren kan utføres med hell. Det er viktig å sikre anestesi rør med tilstrekkelig båndet, fordi det er mulig å koble fra gass-strømmen i løpet av den operasjon som kirurgens hender er plassert i nærheten av rotte hode og visualisering er fokusert bare på det kirurgiske området under mikroskopet. Minst mulig smøring påført på kanylen før intubasjon forhindrer at kanylen ikke kan skli inn i spiserøret. I løpet av multi-layer nedleggelse, hjelper det også å gjelde den cyanoacrylate vevlim gjennom en tynn kanyle med en sprøyte, som tillater presis påføring og forhindrer at påføring av lim.

Denne fremgangsmåten tillater ikke re-vaskularisering av thymus fjernes i en mottaker rat, som er blitt beskrevet andre steder ^10. Vi gjorde ikke også forsøke denne prosedyren i mus, som ofte brukes for immun studier. De siste beskrivelser av thymektomi måten i voksne mus omfatte enten vakuum aspirasjon av thymus etter eksponering, som har høy komplikasjoner hos voksne rotter, eller et disseksjon metode som er lik vår fremgangsmåte ^11,12. Lukningen er ikke utført i lag, og anestesi oppnådd ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital, som påbyr intubering. De viktigste begrensningene i thymektomi prosedyre i noen gnager er kravet for en drifts mikroskop, som kan være svært kostbart, og den tekniske ekspertisen som trengs for å operere under forstørrelse og utføre prosedyren raskt.

innhold "> Komplett tymektomi hos voksne rotter forenkler immunologiske studier med T-celle utvikling, T cellere og toleranse i transplantasjon og kreftstudier og studier med T-celle uttømming i atymiske rotter ^{13- 15.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 inch 14 G angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator) and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity fiber optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35