La timectomía completo en ratas adultas con no invasiva La intubación endotraqueal

Abstract

La timectomía en roedores neonatales es un procedimiento establecido y fiable para estudios inmunológicos. Sin embargo, en ratas adultas, las complicaciones de hemorragia y neumotórax de interrupción pleural pueden resultar en una tasa de mortalidad significativa. Este protocolo es un método simple de la timectomía rata que utiliza un mini-intubación endotraqueal y esternotomía. La intubación se logra con un método no invasivo y fácilmente reproducible y permite la ventilación con presión positiva para prevenir el neumotórax y una vía aérea controlada que permite el tiempo suficiente para la disección timo cuidado para minimizar la interrupción pleural. A 1,5 cm incisión esternal disminuye el contacto con los vasos mediastínicos y pleura, mientras que todavía proporciona visualización completa del timo. Después de la exposición del mediastino, el timo se retira mediante disección roma con una lupa. El espacio pleural se sella entonces por el cierre de la sutura de los músculos pre-traqueales seguido por la aplicación de pegamento quirúrgico. Latórax se cierra entonces por el cierre de sutura del esternón, seguido por el cierre de la sutura de la piel. Todos timectomías estaban completas como se evidencia por inmunohistoquímica (IHC) tinción del tejido mediastinal, y la ausencia de células T ingenuas por citometría de flujo, y el procedimiento tuvo una tasa de supervivencia del 96%. Este método es adecuado cuando se desea timectomía completa con mínimas complicaciones de realizar más estudios inmunológicos en ratas adultas sin timo.

Introduction

Desde principios de la década de 1960, el timo ha sido reconocido por su papel crítico en el desarrollo de la tolerancia inmunológica central. Timectomía roedores ha demostrado ser un procedimiento esencial en la definición de la función del timo en la diferenciación de linfocitos, la auto-tolerancia y la inmunotolerancia en el contexto de trasplante de aloinjerto y la metástasis tumoral. La eliminación del timo de rata permite estudios con depleción de células T o la transferencia adoptiva de las poblaciones de células T definidas sin la reaparición de células T vírgenes nativos.

Timectomías en roedores neonatales pueden llevarse a cabo usando una técnica de aspiración con resultados fiables ^1. En ratas adultas, esta técnica está asociado con una tasa de mortalidad del 20% aproximada y con frecuencia resulta en una timectomía incompleta ^2. Para lograr consistentemente timectomía completa en ratas adultas, se requiere la exposición pública del mediastino a través de una esternotomía media. Sin embargo, esteprocedimiento se asocia con complicaciones que incluyen lesión traqueal, hemorragia y neumotórax que conduce a una tasa de mortalidad global que oscila 1,5-6% ^{2- 4.}

En las últimas dos décadas las mejoras en las técnicas de timectomía han disminuido las complicaciones perioperatorias y han mejorado las tasas de supervivencia. La intubación endotraqueal permitiendo la ventilación con presión positiva ha disminuido las tasas de neumotórax ^5. Métodos de intubación descritos anteriormente rango de la exposición abierta a la tráquea a los métodos menos invasivos que utilizan la visualización directa de las cuerdas vocales. Las complicaciones asociadas con el procedimiento de intubación incluyen lesión traqueal, la rotura de las cuerdas vocales, la intubación esofágica no intencional, y la hemorragia resultante de punción cardíaca o laceración de la vena cava superior. Además, la proximidad de los lóbulos tímicos inferiores a el revestimiento pleural puede resultar en neumotórax.

Aquí se describe una técnica detimectomía a través de una incisión en la piel mínimamente invasiva 2 cm tras un método simple de la intubación endotraqueal usando un angiocatéter de extremo romo y la iluminación traqueal transcutánea. La timectomía implica una esternotomía 1,5 cm y un cierre de tres capas con la aplicación de pegamento quirúrgico para sellar el mediastino y minimizar la incidencia de hemorragia y complicaciones respiratorias. Este método da como resultado de forma fiable en la timectomía completa como lo demuestra la desaparición de las células T ingenuas CD4 ⁺ y CD8 ⁺ después de la timectomía y la ausencia de tejido tímico en la tinción IHC. Los tiempos operatorios y la mortalidad peri-procedimiento se reducen al mínimo.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos experimentales sobre la utilización de las ratas se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke.

1. Preparación de la intubación traqueal Cánula

1. Corte el extremo de la aguja de un 2 pulgadas 14 G aguja angiocathether con alicates de corte.
2. Apriete la luz de la aguja cerrada con unos alicates de punta fina.
3. Cortar la sección pellizcado hasta el borde de la porción lumen abierto con unos alicates de corte, y luego cortar los bordes en ambos lados de el extremo restante a 30 - 45 ° ángulo con el borde de la aguja.
4. Coloque la parte inferior 3 - 4 mm de la cánula en la zona abierta de alicates de junta deslizante recta y tire hacia arriba hasta una curva ligeramente hacia arriba se ha formado en el extremo.
   NOTA: Esto facilitará dirigir el catéter en la tráquea (Figura 1).
5. Utilice papel de lija fino para suavizar los bordes en el extremo de la cánula.

Procedimientos 2. Pre-quirúrgicos

1. Configurar el sitio para el procedimiento mediante la colocación de un microscopio de 10X de aumento sobre el área de operación.
2. Coloque una almohadilla térmica en el área de operaciones y cubrir con una almohadilla absorbente limpio.
3. Establecer un monitor de frecuencia cardíaca y oxigenación de la sangre cerca del campo quirúrgico.
4. Pese la rata para la dosificación basada en el peso de medicamentos (por ejemplo, la analgesia postoperatoria, antibióticos, o anticuerpo linfocito ozono).
   NOTA: Típico ratas adultas pesan entre 350 a 450 g.
5. Sedar al rata con vaporizado 3% de isoflurano-O ₂ (3 L / min) usando una cámara de inducción ventila a un sistema de recogida de gases anestésicos residuales que contienen carbón activado. Permita 5 min para la inducción de anestesia para proporcionar anestesia profunda necesaria para la intubación endotraqueal.
6. Administrar carprofeno o Meloxicane (4,4 mg / kg) por vía subcutánea a la rata antes de proceder con la intubación y la cirugía.
7. Utilice una maquinilla eléctrica de afeitar el cuello y el pecho de la rata anestesiada antes de la intubación.

3. La intubación

1. Preparar la configuración de la intubación por el roce de una pequeña cantidad de lubricación (por ejemplo, KY gel) en el extremo de la cánula de intubación. Encienda el ventilador para comenzar el flujo de gas isoflurano a través del tubo conector.
2. Transferencia de la rata en el aparato de intubación y suspender la rata en la barra de metal por su dientes incisivo superior (Figura 2A).
   NOTA: Algunos aparatos de intubación pueden ser comprados en línea. El modelo que se muestra aquí es hecho en casa utilizando una hoja de acrílico moldeado alrededor de las secciones de una pulgada pieza de 2 x 4 lumbar utilizando un soplete de butano, y los refuerzos están unidos con cloroformo. La barra (o alambre de metal) se une por los agujeros de perforación más cinta adhesiva colocadas en el side del acrílico para evitar que se astille o formación de grietas.
3. Trans-iluminar el cuello de la rata mediante la colocación de una fuente de luz de alta intensidad flexible de 1 - 2 cm de la superficie ventral del cuello (Figura 2B).
4. Use un par de pinzas de estudiantes patrón estándar para tirar de la lengua suavemente hacia arriba y hacia el lado de los dientes inferiores. Grip la lengüeta entre el pulgar y el dedo índice de una mano mientras que la colocación de la superficie interior plana de un lado de la pinza contra el extremo inferior de la lengua. Pulse ventralmente para exponer la epiglotis y la abertura de la laringe (Figura 2C).
5. Visualizar las cuerdas vocales y guiar el extremo vuelto hacia arriba, romo de la cánula de intubación anterior a través de la glotis abierta en la tráquea hasta el centro de la angiocatheter toca los incisivos.
6. Retire el estilete de metal, y conecte el tubo de anestesia para la apertura angiocatéter para iniciar la ventilación con isoflurano.
   NOTA: El flo típica de oxígenotasa de w para el ventilador es de 3 L / min con 3% de isoflurano.
   1. Ajuste el ventilador a una velocidad de 60 respiraciones / min en un modo de ventilador de volumen controlado que alcanza una presión de ~ 12 - 14 mmHg. Use una presión positiva espiratoria final (PEEP) de 3 cm H ₂ O.
7. Observar la expansión de la pared torácica bilateral en sincronía con el ventilador para asegurar la colocación correcta del tubo endotraqueal.
8. Aplicar veterinario recomendado ungüento para los ojos a los ojos de la rata para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
9. Aplique un ungüento veterinario en los ojos de la rata para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
10. Asegure el tubo endotraqueal a la cabeza de la rata con una tira de cinta de tela. Asegurar una conexión firme entre el tubo endotraqueal y el tubo de entrada de anestésico.
11. Coloque la oxigenación de la sangre y el monitor de ritmo cardíaco para el pie de la rata y comenzar la vigilancia. Confirme anestesia adecuada al confirmar que no hay reacción al ae-pellizco.

4. La toracotomía y timectomía

1. Siga técnica aséptica estándar para la totalidad del procedimiento.
   1. Limpie la tabla del área de trabajo y de funcionamiento y desinfectar con una solución de etanol al 70%.
   2. Utilizar guantes quirúrgicos estériles durante el procedimiento, y el autoclave todos los instrumentos y materiales utilizados durante el procedimiento.
   3. Aplicar providona-yodo para toda la zona del pecho y deje que se seque. A continuación, limpiar la superficie de la piel con etanol al 70% en gasa. Cubra la rata con una envoltura de plástico transparente cortar un agujero para exponer el campo operatorio estéril.
2. Identificar la horquilla esternal en la región torácica superior. Hacer un 2 cm incisión en la línea media a través de la piel a partir de 2 - 3 mm por encima de la horquilla esternal y se extiende a distancia de la línea media a lo largo del esternón con unas tijeras de punta roma Shea.
3. Realice una esternotomía 1,5 cm mediana de la horquilla esternal de nuevo con unas tijeras de punta roma Shea. KEEP el borde inferior de las tijeras justo debajo del esternón y avanzar lentamente.
4. Inserte un pequeño retractor Alm justo debajo del esternón se separó y se abren para revelar el músculos correa pre-traqueal (esternohioideo y músculos esternotiroideo). Separar los músculos de la correa pre-traqueales utilizando fórceps Graefe contundentes. NOTA: En este punto, la tráquea se puede ver, y el tubo de intubación se debe visualizar el interior de la tráquea.
5. Coloque los dientes del pequeño retractor Alm debajo de los músculos de la correa separadas y el esternón. Abra el retractor para exponer la cara superior del timo.
6. Utilice unas pinzas finas Dumont para liberar los bordes laterales del tejido del timo y exponer los lóbulos tímicos inferiores.
7. Tire el timo suavemente superiormente en el sitio de la incisión abierta, teniendo cuidado de evitar el contacto con los vasos de la vena cava, subclavia y carótida superiores, y para minimizar la interrupción del delicado revestimiento pleural entre el timo y los pulmones.
8. Como tél tímica vasos se disecan y reveló, utilice micro-tijeras para dividirlos. Use un hisopo de algodón para mantener la presión sobre los vasos de la hemostasia si es necesario.
9. Entregar los lóbulos tímicos más bajos dentro de la incisión y luego bruscamente lisar los archivos adjuntos posteriores. Retire el timo intacta e inspeccionar cuidadosamente el timo retirado por cualquiera de las secciones que faltan.
   NOTA: Los pequeños ganglios linfáticos torácicos pueden ser visualizados rodea el timo y son a menudo difíciles de diferenciar de tejido del timo. Estos serán los nodos redondos discretos con un aspecto similar al tejido del timo, pero no estarán en continuidad con el timo.
10. Retire el retractor Alm y cerrar los músculos esternohioideo y sternothyoid con dos suturas interrumpidas 5-0 Maxon.
11. Aplicar 2 gotas de grado quirúrgico adhesivo tisular de cianoacrilato a través de los puntos de sutura para cerrar el mediastino bajo ventilación con presión positiva.
    NOTA: Esto disminuirá la incidencia de neumotórax y hematoma.
12. Cierre el sternum con dos interrumpido suturas de seda 4-0 en una aguja de corte. Insertar la aguja a través de huecos entre las costillas, teniendo cuidado para guiar la aguja justo debajo del esternón para evitar la capa muscular subyacente.
13. Cierre la capa de la piel con un corredor de nylon 4-0 sutura. Suspenda el isoflurano en este punto para acortar el período de recuperación de la anestesia después de la operación.
14. Limpie el sitio de la incisión y la piel circundante con una gasa húmeda con salina.
15. Aplicar varias gotas de bupivicaína (0,25%) para la anestesia local, seguido de 1 - 2 gotas de pegamento de cianoacrilato sobre la incisión para sellar la incisión.
16. Continuar para ventilar hasta que la rata muestra signos de esfuerzo respiratorio independiente y comienza a mover sus extremidades. Retirar la intubación a la rata y deje que se recupere bajo observación en una jaula colocada sobre una almohadilla térmica.
17. Administrar buprenorfina (0,01-0,05 mg / kg) por vía subcutánea a la rata inmediatamente después de la operación y repita cada 8-12 h durante 48 h post-operativamente (normalmente 5 dosis en total). A las 24 y 48 horas después de la operación, administrar Carprofeno o Meloxicane (4,4 mg / kg) por vía subcutánea (3 dosis totales incluyendo la dosis preoperatoria).
18. Seguir vigilando hasta que la rata se mueve alrededor de la jaula. En cualquier signo de dificultad respiratoria, realizar re-intubación y re-exploración del pecho.
    1. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.
    2. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.
19. Retire las suturas de la piel de la capa 1 semana después de la operación.

Representative Results

Este procedimiento se realizó en ratas Lewis adultas (n = 26). El tiempo de operación promedio fue de 15 ± 3 min. No hubo mortalidad intraoperatoria. El tiempo de intubación media - a partir de la colocación de la rata en el aparato de intubación para el establecimiento de la ventilación - fue de 45 ± 5 seg. 24 ratas tuvieron una recuperación completa de la operación, sin evidencia de dificultades respiratorias o hemorragia a través día postoperatorio (POD) 14. Una rata desarrollado dificultad respiratoria en el POD 4 y se sometieron a reoperación para explorar el mediastino. Se encontró que la rata de tener un lóbulo del pulmón colapsado. Después de volver a la expansión del pulmón, mediastino fue re-sellado con pegamento quirúrgico bajo ventilación de presión positiva y el pecho se vuelve a cerrar. La rata se recuperó con totalmente sin alteraciones respiratorias más. Una rata murió el POD 7 por causas desconocidas.

El mediastino posterior a la timectomía fue inspeccionado por el timo retenido y el tejido del timo fue eliminado visually inspeccionado por los tramos pendientes y posteriormente examinado histológicamente. En la necropsia, el tejido torácico fue examinado por hematoxilina-eosina (H & E) tinción. Entonces inmunohistoquímica (IHC) para citoqueratina se realizó para diferenciar el tejido del timo remanente de los ganglios linfáticos del tórax (LN), centrándose especialmente en los tramos con mayores niveles de tinción nuclear de H & E como es normal para el tejido del timo. Citoqueratina tinción se realizó con pan de conejo anti-citoqueratina como el principal ab, seguido de biotina de cabra anti-IgG de conejo y Vectastain Elite ABC kit Diapositivas fueron contador-manchado con hematoxilina antes de la microscopía de evaluación. Tejido tímico se puede distinguir de los LN torácicos por tinción nuclear más denso en H & E (Figura 3A y 3B) y un patrón de encaje característica de la tinción de citoqueratina, que difiere de la ausencia de tinción de citoqueratina visto en los LN (Figuras 3C y 3D).

Muestras de sangre periférica obtenidaSe analizaron las ratas de sacrificados para el agotamiento persistente de células T vírgenes. Brevemente, las células rojas de la sangre se lisaron con tampón de lisis ACK y leucocitos de sangre periférica (PBL) se lavaron dos veces con PBS 2% de FBS antes de la teñidas con anticuerpos durante 30 min a 4 ° C. PBL fueron fijadas con 4% w / v de paraformaldehído en solución salina tamponada con pH neutro antes del análisis por el multi-color de citometría de flujo. Total de las células T se identificaron por tinción PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) con células T vírgenes anti-CD45 + y CD3 +, y se identificaron mediante tinción con anti-CD45RC, anti-CD62L y, ​​o bien anti-CD4 o anti-CD8. Los porcentajes de cada subpoblación de células T se multiplicaron por el recuento absoluto de linfocitos (obtenido por el duque Vet Clínica Laboratorio de Diagnóstico) para determinar el recuento de células. Naïve Representante CD4 ⁺ y de células T CD8 ⁺ y el recuento total de células T se muestran en la Figura 4. Timectomizados ratas mantienen recuentos totales de células T en comparación con el control de rats pero demostró pérdida de las poblaciones de células T ingenuas.

Figura 1. Diseño de la cánula de intubación. La cánula está formado por embotamiento el extremo del estilete de un 14 G x 2 pulgadas angiocatéter. La distal 3 mm del estilete es ligeramente flexionadas para guiar el catéter ventral para facilitar la intubación traqueal. (A) Vista lateral del estilete de metal. (B) Vista lateral de angiocatéter sobre estilete. (C) La vista ampliada de la punta roma de estilete.

Figura 2. Una plataforma de intubación en pendiente se utiliza para posicionar la rata para la intubación. La rata está suspendido de la barra de metal de la plataforma de intubación por sus dientes incisivos superiores. A la luz de vitame A continuación, se coloca en el cuello ventral de la rata a trans-iluminar la faringe. Los fórceps se utilizan para mantener la lengua y exponer la abertura de la laringe. (A) vista desde arriba y (B) vista lateral de la plataforma de la intubación. (C) Diagrama de la visualización de la glotis después de la suspensión de la rata y la exposición de la laringe . La laringe en el diagrama es de una diapositiva comprado de Motifolio.

Figura 3. H & E y tinción de citoqueratina de tejido mediastinal pueden distinguir timo de los ganglios linfáticos. Hematoxilina y eosina (H & E) tinción de un timo normal (A) y LN torácica (B). Tinción de citoqueratina de tejido tímico (C) y una LN torácica se recuperó después de la timectomía Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Desgaste de sangre periférica ingenuos células T después de la timectomía. Total de células T, ingenuo células T CD4 + y las células T CD8 + vírgenes donde cuantifica a partir de PBL por citometría de flujo en pre-timectomía (Pre) y ratas 4 semanas después de la timectomía (Publicar ). Los datos se muestran para una rata por grupo y son representativos de los resultados globales obtenidos.

Discussion

El presente protocolo para la timectomía completa ofrece un abordaje mínimamente invasivo, con un cierre de la incisión de tres capas con aplicación de pegamento quirúrgico diseñado para minimizar las complicaciones. La eliminación completa del timo se demostró por la pérdida de células T vírgenes y por tinción IHC de tejido linfoide mediastinal para citoqueratina.

El procedimiento de la timectomía rata adulta se ha complicado por las tasas de mortalidad que van desde 1,5 hasta 20%, debido a complicaciones perioperatorias, la mayoría de los cuales son la atribuible a la íntima asociación de los lóbulos inferiores del timo con la pleura, el corazón y la principales vasos mediastínicos ^2-4. Técnicas de intubación traqueal abiertas, donde se pincha la tráquea, tienen una tasa de mortalidad del 6% ^2. El uso de la intubación traqueal no invasivo ha sido reportado por Na y compañeros de trabajo; sin embargo, no se informaron las tasas de supervivencia a ^5. Intubación con la cánula preparado como se describe aquícon iluminación traqueal transcutánea permite una clara visualización de las cuerdas vocales para intubaciones consistente y exitoso. No se necesita equipo avanzado para el método presentado, que se diferencia de otros reportados técnicas no invasivas ^{2,5- 8.} Nuestro método de embotar el final de una aguja de angiocatéter y la creación de una curva hacia arriba en el extremo hace que sea más fácil evitar la intubación esofágica inadvertida y minimiza el trauma traqueal. Estas son mejoras a un método descrito anteriormente de la intubación también utilizando un angiocatéter modificado ^9.

Encontramos que el mantenimiento de la incisión esternal a un mínimo disminuye el contacto con los principales vasos mediastínicos y el riesgo de hemorragia asociado al tiempo que permite una exposición adecuada para la eliminación completa del timo. En teoría, la incisión más pequeña también debería disminuir el dolor y la recuperación post-procedimiento momento. El uso de cola de fibrina se informó por primera vez como una modificación de una intubación traqueal abiertoprocedimiento para prevenir el neumotórax y las vías respiratorias lesiones ^2. Hemos encontrado que la aplicación de una pequeña cantidad de pegamento sobre los músculos pre-traqueales suturadas mientras se aplica presión positiva sella adecuadamente la cavidad pleural y ayuda a prevenir complicaciones respiratorias postoperatorias.

Hay unos cuantos aspectos del protocolo que son importantes para resaltar lo que el procedimiento puede realizarse con éxito. Es importante asegurar el tubo de la anestesia con cinta adecuada porque es posible desconectar el flujo de gas durante la operación como las manos del cirujano están situadas cerca de la cabeza de la rata y la visualización se centra sólo en el sitio quirúrgico bajo el microscopio. La lubricación mínima posible aplicado a la cánula antes de la intubación evita que la cánula se deslice hacia el esófago. Durante el cierre de múltiples capas, sino que también ayuda a aplicar el adhesivo tisular de cianoacrilato a través de una aguja de pequeño calibre con una jeringa, el cual permite una aplicación precisa y evita accidental sobre aplicación de pegamento.

Este procedimiento no permite re-vascularización del timo eliminado en una rata receptora, que ha sido descrito en otra parte ^10. Asimismo, no intente este procedimiento en ratones, que se utilizan a menudo para estudios inmunológicos. Las descripciones más recientes del procedimiento de la timectomía en ratones adultos implican o bien la aspiración por vacío del timo después de la exposición, que tiene una alta tasa de complicaciones en ratas adultas, o un método de disección que es similar a nuestro procedimiento ^11,12. El cierre no se realiza en capas, y la anestesia se logra mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital, que no obliga a la intubación. Las principales limitaciones del procedimiento timectomía en cualquier roedor son la exigencia de un microscopio quirúrgico, que puede ser muy caro, y los conocimientos técnicos necesarios para operar con una lupa y realizan el procedimiento rápidamente.

contenido "> timectomía completo en ratas adultas facilita los estudios inmunológicos que implican el desarrollo de células T, la reactividad de células T y la tolerancia en los estudios de trasplante y tumorales, y estudios con depleción de células T en ratas atímicos ^{13- 15.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 inch 14 G angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator) and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity fiber optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35