Timectomia completo em ratos adultos com não-invasiva entubação endotraqueal

Abstract

Timectomia em roedores neonatais é um procedimento estabelecido e confiável para estudos imunológicos. No entanto, em ratos adultos, complicações de hemorragia e pneumotórax de ruptura pleural pode resultar numa taxa de mortalidade significativa. Este protocolo é um método simples de thymectomy rato que utiliza um mini-esternotomia e entubação endotraqueal. Intubação é realizado com um método não-invasivo e de fácil reprodução e permite a ventilação com pressão positiva para evitar pneumotórax e uma via aérea controlada que permite tempo suficiente para a dissecção timo cuidado para minimizar a interrupção pleural. A 1,5 centímetros incisão esternal diminui o contato com os vasos do mediastino e pleura, enquanto ainda fornece a visualização completa do timo. Após a exposição do mediastino, o timo é removido por dissecção romba sob ampliação. O espaço pleural é então selado por fecho de sutura dos músculos pré-traqueal, seguido pela aplicação de cola cirúrgica. Otórax é então fechada por sutura de encerramento do esterno, seguido por fecho de sutura da pele. Todos os timectomias estavam completos como evidenciado pela imuno-histoquímica (IHQ) coloração de tecidos do mediastino, e ausência de células T naive por citometria de fluxo, e que o processo tinha uma taxa de sobrevivência de 96%. Esse método é apropriado quando a timectomia completa com o mínimo de complicações é desejado para mais estudos imunológicos em ratos atímicos adultos.

Introduction

Desde o início da década de 1960, o timo foi reconhecido o papel crítico no desenvolvimento da tolerância imunológica central. Roedor timectomia provou ser um processo essencial para definir o papel do timo na diferenciação de linfócitos, a auto-tolerância, e imunotolerância na definição de transplante aloenxerto e metástase do tumor. A remoção do timo do rato permite a estudos que envolvem a depleção de células T ou a transferência adoptiva de populações de células T definidos, sem o reaparecimento de células T naive nativas.

Timectomias em roedores neonatais pode ser realizada utilizando uma técnica de sucção com resultados fiáveis ^​​1. Em ratos adultos, esta técnica está associada com uma taxa de mortalidade de 20% e, frequentemente, resulta em uma timectomia ² incompleta. Para alcançar consistentemente thymectomy completo em ratos adultos, é necessária a exposição aberta do mediastino por esternotomia mediana. No entanto, esteprocedimento está associada a complicações que incluem lesão traqueal, hemorragia e pneumotórax levando a uma taxa global de mortalidade variando 1,5-6% ^{2- 4.}

Ao longo das duas últimas décadas melhorias nas técnicas de timectomia diminuíram complicações perioperatórias e melhoraram as taxas de sobrevivência. A entubação endotraqueal permitindo a ventilação com pressão positiva diminuiu as taxas de pneumotórax ^5. Métodos de intubação anteriormente descrito gama de exposição aberta ao traquéia para métodos menos invasivos, utilizando a visualização direta das cordas vocais. As complicações associadas ao procedimento de intubação traqueal incluem lesão, a ruptura das cordas vocais, intubação esofágica não intencional, e hemorragia decorrente da punção cardíaca ou laceração da veia cava superior. Além disso, a proximidade dos lobos do timo mais baixos para o revestimento pleural podem resultar em pneumotórax.

Aqui nós descrevemos uma técnica dethymectomy através de um minimamente invasiva dois centímetros da pele incisão na sequência de um método simples de entubação endotraqueal usando um angiocateter embotados-end e iluminação traqueal transcutânea. O thymectomy envolve um 1,5 centímetros sternotomy e um encerramento de três camadas com aplicação de cola cirúrgica para selar o mediastino e minimizar a incidência de hemorragia e complicações respiratórias. Este método resulta de forma fiável, timectomia completa, como evidenciado pelo desaparecimento das células T ingénuas CD4 ⁺ e CD8 ⁺ a seguir a timectomia e a ausência de tecido do timo de coloração IHC. Tempos operatórios e mortalidade peri-processual são mantidos a um mínimo.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos experimentais que envolvam a utilização de ratos foram feitas de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado e uso Comitê da Universidade de Duke Animal.

1. Preparação da intubação traqueal Cannula

1. Corte a ponta da agulha de um 2 polegadas 14 G angiocathether agulha com alicate de corte.
2. Comprima o lúmen da agulha fechado com alicate de bico.
3. Corte a parte comprimida para baixo à extremidade da porção de lúmen aberto com alicates de corte, e depois cortar as extremidades de ambos os lados da extremidade remanescente a 30 - 45 ° ângulo da borda da agulha.
4. Coloque a parte inferior 3 - 4 mm de comprimento da cânula para a área aberta do alicate deslizamento-conjunta rectas e puxar para cima até uma ligeira curva para cima foi formado no final.
   NOTA: Este irá facilitar a dirigir o cateter para dentro da traqueia (Figura 1).
5. Use lixa fina para alisar as arestas na extremidade da cânula.

Procedimentos 2. Pré-cirúrgicos

1. Configure o local para o procedimento, colocando um microscópio cirúrgico definido como aumento de 10x sobre a área de operação.
2. Coloque uma almofada de aquecimento na área de operação e cubra com um pano absorvente limpo.
3. Configurar um monitor de frequência cardíaca e oxigenação do sangue perto do campo cirúrgico.
4. Pesar o rato para sistemas baseados em peso medicação dosagem (por exemplo, a analgesia pós-operatória, os antibióticos, ou anticorpo linfócitos esgotando).
   NOTA: Típico ratos adultos pesam entre 350-450 g.
5. Sedar o rato vaporizado com 3% de _{isoflurano-O2} (3 L / min) usando uma câmara de indução ventilada para um sistema de eliminação de resíduos de gás anestésico contendo carvão activado. Permitir 5 min para a indução anestésica para fornecer anestesia profunda necessária para entubação endotraqueal.
6. Administrar carprofeno ou Meloxicane (4,4 mg / kg) por via subcutânea a ratos antes de prosseguir com a intubação e cirurgia.
7. Use cortador elétrico para fazer a barba do pescoço e peito do rato anestesiado antes da intubação.

3. Intubation

1. Preparar a configuração intubação por fricção uma pequena quantidade de lubrificante (por exemplo, gel KY) na extremidade da cânula de intubação. Ligar o ventilador para iniciar o fluxo de gás através do tubo de isoflurano conector.
2. Transferir o rato para o aparelho de intubação e suspender o rato sobre a barra de metal por sua dentes incisivos superiores (Figura 2A).
   NOTA: Alguns aparelhos de intubação pode ser comprado online. O modelo mostrado aqui é caseiro usando uma folha de acrílico moldado em torno de seções de uma polegada pedaço 2 x 4 lombar usando um maçarico de butano, e reforços são presos com clorofórmio. O bar (ou fio de metal) é presa por fazer furos mais de fita adesiva colocados no side do acrílico para impedir uma fragmentação ou fissuras.
3. Trans-iluminar o pescoço do rato por posicionamento de uma fonte de luz de alta intensidade flexível 1 - 2 cm da superfície ventral do pescoço (Figura 2B).
4. Utilizar um par de fórceps estudante padrão normalizados para puxar a língua suavemente para cima e para o lado dos dentes de baixo. Aderência a língua entre o polegar eo dedo indicador de uma mão, enquanto coloca a superfície interior plana de um lado da pinça contra a extremidade inferior da língua. Pressione ventralmente para expor a epiglote e a abertura da laringe (Figura 2C).
5. Visualize as cordas vocais e orientar o arrebitado final, embotada da cânula de intubação anteriormente através da glote aberta na traquéia até o centro da angiocateter toca os incisivos.
6. Retirar o estilete metal, e conectar o tubo de anestesia para a abertura angiocateter para início da ventilação com isoflurano.
   NOTA: O flo típico de oxigêniotaxa de w para o ventilador é de 3 L / min, com 3% de isoflurano.
   1. Definir o ventilador a uma taxa de 60 respirações / min, em um modo de ventilador de volume controlado que atinge uma pressão de ~ 12 - 14 mmHg. Use uma pressão expiratória final positiva (PEEP) de 3 cm H ₂ O.
7. Observar a expansão da parede torácica bilateral em sincronia com o ventilador para assegurar a colocação adequada do tubo endotraqueal.
8. Aplicar recomenda-veterinário pomada para os olhos do rato para evitar o ressecamento e sob anestesia.
9. Aplicar veterinário pomada nos olhos do rato para evitar a secura e sob anestesia.
10. Prenda o tubo endotraqueal para a cabeça do rato com uma tira de fita de tecido. Garanta uma ligação sólida entre o tubo endotraqueal e a tubulação ingresso anestésico.
11. Fixe a oxigenação do sangue e monitor cardíaco para o pé do rato e iniciar o monitoramento. Confirme anesthetization adequada ao confirmar que não há reação ao quee-pinch.

4. Thoracotomy e Timectomia

1. Siga técnica asséptica padrão para a totalidade do processo.
   1. Limpe a área e operacional a mesa de trabalho e desinfectar com uma solução de etanol a 70%.
   2. Use luvas cirúrgicas estéreis durante o procedimento, e autoclave todos os instrumentos e materiais utilizados durante o procedimento.
   3. Aplicar providone-iodo para a área de todo o peito e deixe-a secar. Em seguida, limpar a superfície da pele com etanol a 70% em gaze. Cubra o rato com filme plástico transparente cortar um buraco para expor o campo operatório estéril.
2. Identificar fúrcula na região torácica superior. Faça uma incisão na linha média 2 centímetros através da pele a partir 2-3 mm acima da fúrcula e estendendo-se distalmente linha média ao longo do esterno com uma tesoura Shea atraumáticas.
3. Realize uma sternotomy 1,5 centímetros mediana de fúrcula novamente usando uma tesoura Shea atraumáticas. KEEP da borda inferior das tesouras apenas por baixo do esterno e avançar lentamente.
4. Insira um pequeno afastador Alm logo abaixo do esterno separadas e aberto para revelar o pré-traqueal músculos cinta (esterno e músculos esternotireóideo). Separe os músculos cinta pré-traqueais usando uma pinça Graefe contundentes. NOTA: Neste ponto, a traqueia pode ser visto, o tubo de intubação e deve ser visualizada no interior da traqueia.
5. Coloque os dentes do pequeno afastador Alm debaixo dos músculos cinta separadas e esterno. Abra o retractor para expor a face superior do timo.
6. Use uma pinça Dumont finas para libertar as arestas laterais do tecido do timo e expor os lóbulos inferiores do timo.
7. Puxe o timo suavemente superiormente para o local da incisão aberta, tendo o cuidado de evitar o contacto com as veias cavas, subclávia e carótida vasos superiores, e para minimizar a interrupção do revestimento pleural delicado entre o timo e os pulmões.
8. Como tele thymic vasos são dissecados e revelou, usar micro-tesoura para dividi-los. Use um cotonete para manter a pressão sobre os vasos para hemostasia, se necessário.
9. Entregar os lobos do timo mais baixos na incisão e, em seguida, lisar acentuadamente os anexos posteriores. Retire o timo intacta e inspecione cuidadosamente o timo removido para quaisquer seções desaparecidas.
   Nota: Pequenas linfonodos torácicos pode ser visualizado em torno do timo e são muitas vezes difíceis de diferenciar de tecido do timo. Estes serão os nós redondas discretas com uma aparência semelhante a tecido tímico, mas não será em continuidade com o timo.
10. Retire o afastador Alm e fechar os músculos esterno hioideo e sternothyoid com dois interrompido 5-0 Maxon.
11. Aplique 2 gotas de aplicação de cola grau cirúrgico através das suturas para selar o mediastino sob ventilação com pressão positiva.
    NOTA: Isto irá diminuir a incidência de pneumotórax e hematoma.
12. Feche a sternum com dois interrompido fio de seda 4-0 em uma agulha de corte. Insira a agulha através de espaços entre as costelas, tendo o cuidado para guiar a agulha logo abaixo do esterno para evitar a camada muscular subjacente.
13. Fechar a camada de pele com uma sutura de nylon 4-0 execução. Descontinuar o isoflurano neste momento para encurtar o período de recuperação da anestesia pós-operatória.
14. Limpe o local da incisão e pele circundante com gaze embebida em soro fisiológico.
15. Aplique várias gotas de bupivicaína (0,25%) para a anestesia local, seguido por 1 - 2 gotas de cola de cianoacrilato sobre a incisão para selar a incisão.
16. Continuar a ventilar até o rato mostra sinais de esforço respiratório independente e começa a se mover suas extremidades. Extubação o rato e permitir que ele se recuperar sob observação em uma jaula colocada sobre uma almofada de aquecimento.
17. Administrar Buprenorfina (0,01-0,05 mg / kg) por via subcutânea ao rato imediatamente no pós-operatório e repetir a cada 8-12 horas para 48 horas post-operatório (normalmente 5 doses no total). Aos 24 e 48 horas de pós-operatório, administrar Carprofen ou Meloxicane (4,4 mg / kg) por via subcutânea (3 doses totais, incluindo a dose pré-operatório).
18. Continue a acompanhar até que o rato está se movendo ao redor da gaiola. Em quaisquer sinais de desconforto respiratório, realizar re-intubação e re-exploração do peito.
    1. Não deixe um animal sem supervisão até que ele recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
    2. Não devolva um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
19. Retirar as suturas da camada da pele uma semana de pós-operatório.

Representative Results

Este procedimento foi realizado em ratos Lewis adultos (n = 26). O tempo médio de operação foi de 15 ± 3 min. Não houve mortalidade intra-operatória. O tempo de intubação média - de colocação de rato em cima do aparelho de intubação para o estabelecimento da ventilação - foi de 45 ± 5 segundos. 24 ratos tiveram uma recuperação completa da operação, sem evidência de dificuldades respiratórias ou hemorragia através dia de pós-operatório (DPO) 14. Um rato desenvolvido dificuldade respiratória em POD 4 e foram submetidos a re-operação para explorar o mediastino. O rato foi encontrada para ter um lobo pulmonar colapsado. Após re-expansão do pulmão, do mediastino foi re-selado com cola cirúrgica sob ventilação com pressão positiva eo tórax foi re-fechada. O rato recuperado com totalmente sem outras anormalidades respiratórias. Um rato morreu no POD 7 de causas desconhecidas.

O mediastino pós-thymectomy foi inspecionado por timo retido e o tecido do timo foi removido visually inspecionados para a falta de seções e, posteriormente, a um exame histológico. Na necropsia, o tecido torácica foi examinado por hematoxilina-eosina (H & E) mancha. A imuno-histoquímica (IHQ) para citoqueratina foi então conduzido para diferenciar o tecido do timo resquício de gânglios torácicos linfáticos (LN), com destaque para seções com níveis mais elevados de coloração nuclear por H & E como é normal para o tecido do timo. Citoqueratina coloração foi realizada utilizando panela de coelho anti-citoqueratina como o primário ab, seguido de cabra biotinilado anti-IgG de coelho e Vectastain Elite ABC Kit lamelas foram contra-coradas com hematoxilina antes da microscopia de avaliação. Tecido de timo pode ser distinguida de LNs torácicas por coloração nuclear de maior densidade na H & E (Figura 3A e 3B) e um padrão de coloração característico laçado citoqueratina, que difere da ausência de coloração citoqueratina visto em LNs (Figuras 3C e 3D).

Amostras de sangue periférico obtidoratos de eutanasiados foram analisadas para esgotamento persistente de células T naive. Resumidamente, as células vermelhas do sangue foram lisadas com tampão de lise ACK e leucócitos do sangue periférico (PBLs) foram lavados duas vezes com PBS 2% de FBS antes coradas com anticorpos durante 30 min a 4 ° C. Os PBLs foram então fixadas com 4% w / v de paraformaldeído em solução salina tamponada com pH neutro, antes da análise por multi-cor de citometria de fluxo. As células T totais foram identificados por coloração PBMCs (células mononucleares do sangue periférico), com anti-CD45 + e CD3 +, e células T virgens foram identificados através de coloração com anti-CD45RC, anti-CD62L e anticorpos anti-CD4 ou anti-CD8. Os percentuais de cada subpopulação de células T foram multiplicados pela contagem absoluta de linfócitos (obtido pela Duke Clinical Vet Lab Diagnostic) para determinar a contagem de células. Representante Naive CD4 ⁺ e CD8 ⁺ T-célula e as contagens totais de células T são mostrados na Figura 4. Timectomizado ratos mantidas as contagens totais de células T em relação ao controle rats mas demonstrou perda de populações de células T naïve.

Figura 1. Desenho da cânula de intubação. A cânula é formada por embotamento da extremidade do estilete de uma 14 L x 2 polegadas angiocateter. O distal 3 milímetros do estilete é ligeiramente curvado para guiar o cateter ventrally para facilitar a intubação traqueal. (A) Vista lateral de metal de estilete. (B) Vista lateral da angiocateter sobre estilete. (C) visualização ampliada de ponta embotada de estilete.

Figura 2. A plataforma intubação inclinado é usado para posicionar o rato para intubação. O rato é suspenso a partir da barra de metal da plataforma intubação pelos seus dentes incisivos superiores. A sourc luze será então posicionado ventral no pescoço do rato para trans-iluminar a faringe. Fórceps são usados ​​para segurar a língua e expor a abertura da laringe. (A) Vista superior e (B) vista lateral da plataforma de intubação. (C) Diagrama da visualização da glote após a suspensão do rato e exposição da laringe . A laringe no diagrama é um slide comprado de Motifolio.

Figura 3. H & E e citoqueratina coloração de tecido mediastinal pode distinguir timo a partir de nódulos linfáticos. Hematoxilina e eosina (H & E) coloração de um timo normal (A) e LN torácica (B). Coloração Cytokeratin de tecido do timo (C) e um LN torácica recuperado pós-thymectomy Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Atrito de sangue periférico de células T naive pós-timectomia. Célula Total T, as células CD4 + T naive e células CD8 + T naive onde quantificados a partir de PBL por citometria de fluxo na pré-thymectomy (PRE) e ratos 4 semanas pós-thymectomy (Mensagem ). Os dados são apresentados para um rato de cada grupo e são representativos dos resultados globais obtidos.

Discussion

O presente protocolo para thymectomy completa fornece uma abordagem minimamente invasiva com um fecho de incisão de três camadas com aplicação de cola cirúrgica projetado para minimizar as complicações. A remoção completa do timo foi demonstrado pela perda de células T naive e por IHC coloração do tecido linfóide do mediastino para citoqueratina.

O procedimento de thymectomy rato adulto tem sido complicada por taxas de mortalidade variando de 1,5 - 20% devido a complicações peri-operatórias, a maioria dos quais são a atribuível à associação íntima dos lobos inferiores do timo com a pleura, o coração eo grandes vasos mediastinais ^2-4. Técnicas de intubação traqueal aberto, onde a traquéia é perfurada, têm uma taxa de mortalidade de 6% ^2. O uso de entubação traqueal não invasivas têm sido relatados por Na e colaboradores; no entanto, as taxas de sobrevivência não foram relatados ^5. A intubação com a cânula preparado como descrito aquicom iluminação traqueal transcutânea permite melhor visualização das cordas vocais para intubações consistentemente bem-sucedidas. Nenhum equipamento avançado é necessário para o método apresentado, o qual difere de outros relataram técnicas não-invasivas ^{2,5- 8.} O nosso método de embotar a extremidade de uma agulha de angiocateter e criando uma dobra para cima na extremidade faz com que seja mais fácil de evitar a prótese esofágica inadvertida e minimiza o trauma traqueal. Estes são melhorias para um método previamente descrito de intubação também usando um angiocateter modificado ^9.

Descobrimos que mantendo a incisão esternal diminui para um mínimo de contacto com grandes vasos mediastinais e risco de hemorragia associado, permitindo uma exposição adequada para a remoção completa do timo. Teoricamente, a incisão menor também deve diminuir a dor e tempo de recuperação pós-procedimento. O uso da cola de fibrina foi relatada pela primeira vez como uma modificação de uma intubação traqueal abertoprocedimento para evitar pneumotórax e lesão das vias aéreas ^2. Descobrimos que a aplicação de uma pequena quantidade de cola sobre os músculos da traqueia pré-suturadas enquanto que aplicam pressão positiva veda adequadamente a cavidade pleural e ajuda a prevenir complicações respiratórias pós-operatórias.

Existem alguns aspectos do protocolo que são importantes para realçar de modo que o procedimento pode ser realizado com sucesso. É importante para fixar o tubo de fita com a anestesia adequada porque é possível desligar o fluxo de gás durante a operação como as mãos do cirurgião está posicionada perto da cabeça do rato e visualização é focado apenas no local da cirurgia sob o microscópio. A lubrificação mínimo possível aplicar à cânula antes da intubação evita que a cânula de deslizar para o esófago. Durante o fecho multi-camada, que também ajuda a aplicar a aplicação de cola através de uma agulha de calibre pequeno com uma seringa, a qual permite a aplicação precisa e impede acidental excesso de aplicação de cola.

Este procedimento não permite re-vascularização do timo removido num rato receptor, o que foi descrito em outro lugar ^10. Também não tente este procedimento em camundongos, que são muitas vezes utilizados para estudos imunológicos. As descrições mais recentes do processo timectomia em ratos adultos envolvem tanto a aspiração de vácuo do timo após a exposição, que tem um elevado índice de complicações em ratos adultos, ou um método de esvaziamento que é semelhante ao nosso processo ^11,12. A tampa não é realizada em camadas, e a anestesia é conseguida por injecção intraperitoneal de pentobarbital, que não exige a intubação. As principais limitações do procedimento thymectomy em qualquer roedor são a exigência de um microscópio cirúrgico, o que pode ser muito caro, e os conhecimentos técnicos necessários para operar sob a ampliação e realizar o procedimento rapidamente.

conteúdo "> timectomia completa em ratos adultos facilita estudos imunológicos envolvem o desenvolvimento de células T, a reactividade de células T e tolerância em estudos de transplantação e tumorais, e estudos que envolvem a depleção de células T em ratos atímicos ^{13- 15.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 inch 14 G angiocatheter
Operating microscope	Zeiss
Warming pad
Heart rate and blood oxygenation monitor for rodents with foot sensors	Harvard Apparatus	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (Rat foot sensor)
Intubation apparatus (plastic with metal bar at the top)			See Figure 2
Small animal anesthesia system with induction box, isoflurane tank and O2 tank	Harvard Apparatus	ST1 72-6420
Small animal ventilator with tubing	CWE	12-02000 (ventilator) and 12-04000 (external valve assembly for mice/rats)
High-intensity fiber optic Illuminator	Dolan Jenner	EEG 2823M
Student standard pattern forceps	Fine Science Tools	91100-16
Fine straight scissors	Fine Science Tools	14060-09
Blunt-tipped Shea scissors	Fine Science Tools	14105-12
Small Alm retractor (for sternum)	Fine Science Tools	17008-07
Blunt Graefe forceps	Fine Science Tools	11050-10
Fine Dumont forceps	Fine Science Tools	11254-20
5-0 Maxon sutures	Ethicon
4-0 Silk sutures (with cutting needle)	Ethicon
6-0 Nylon suture	Ethicon
Cyanoacrylate glue (Endermil)
Lubrication gel	Akorn Animal Health	NDC 17478-162-35