Introduction
遺伝子ターゲティング技術の開発は、異なる生物学的システム1-3を調査するために、細胞株およびマウスモデルの構築を可能にした。ゲノム配列の修飾において重要第一段階は、ベクトル4遺伝子ターゲティングの設計および構築である。ターゲティングベクターは、選択マーカー（ 例えば、ネオマイシン ）、および哺乳動物細胞5における効率的な相同組換えのために必要な長いゲノム領域に隣接し、所望の修飾（複数可）を含む関心のある対立遺伝子を担持するプラスミド構築物である。正確な遺伝子改変は、胚性幹（ES）細胞を6または体細胞7、意図された変更の転送におけるターゲティングベクター上のDNA配列の同一ストレッチおよびゲノム遺伝子座の結果とすることにより、相同組換えにターゲティングベクターを導入することにより達成される遺伝子変換8によるゲノムへ。このようなMODIFIES細胞は、その後の生殖細胞9を介してこれらの修飾された対立遺伝子を伝達することができる子孫（キメラ）を生成するために、マウスの胚盤胞に注入することができる編。トランスジェニックマウスを作製するための代替経路は、マウスゲノム10中のベクターのランダムな組込みをもたらす単細胞マウス接合体への遺伝子発現ベクターのマイクロインジェクションを含む。ベクター構築の従来の方法は、ベクターバックボーンに異なる選択マーカーとゲノム断片をクローニングするために制限酵素およびDNAリガーゼを使用してクローニング「カット＆ペースト」従来に頼ってきた。しかし、伝統的なクローニングの固有の制限要因は、特に、より長いDNA配列と、制限部位の位置および選択である。これは多くの場合、複数のサブクローニングステップを必要とし、また、多くの場合、遺伝子ターゲティングの低い効率につながるベクターに、外来DNA配列が導入されています。
コンビ（組換えENGineering）E.ファージの組換えタンパク質によって媒介される相同組換え（HR）を使用してこれらの制限を克服するDNA工学技術である大腸菌細胞 11,12。相同配列の任意の領域をリコンビニアリングの基質として働くことができるので、制限部位の利用可能性の制約が取り除かれる。大型DNA配列は、シームレス従って、それらの構造的完全性を維持13、インビボで直接改変することができる。遺伝子改変は、短い相同性（50塩基対）14、したがって相同性ア ーム（HA）との非常に効率的で便利な合成オリゴ配列に組み込むことができる。典型的なコンビ実験、オリゴまたはHAを含む二本鎖DNA（dsDNAの）断片でコンビテントE.にエレクトロポレーションされている染色体上またはプラスミド15のいずれかに位置して標的を含有する大腸菌細胞 。再結合の可能性は、Red RECの誘導発現によって付与されるombinationファージ16,17のタンパク質またはRACプロファージ18のRecETタンパク質。赤/のRecEエキソヌクレアーゼは、そのパートナー、赤/ RECT、一本鎖アニーリングタンパク質（SSAP）19によって結合される一本鎖DNA（ssDNA）の中間に線形のdsDNAに変換する。長い一本鎖DNAまたはその相補的標的配列への短いオリゴのアニーリングは複製フォークのラギング鎖上に発生し、標的部位での配列の組み込みをもたらす。鎖のssDNA換えを遅れはコンビの高効率の基礎であり、「ベータ」再結合モデル20,21によって記述することができる。
遺伝子ターゲッティングベクターを構築するための典型的なコンビニアリングワークフローでは、次の二つの経路のいずれかを伴う。一つの経路は、loxP組換え部位の順次挿入したプラスミドへのマウスBACクローンから目的のゲノム領域、選択マーカーをサブクローニング含ま
Protocol
デザインをターゲット1.ジーン
- 興味のあるゲノム領域をカバーする適切なBACクローンを注文。これは、ES細胞などを修正する、RPCI-23およびC57BL / 6 ES細胞を用いて遺伝子ターゲティングのためのRPCI-24 BACクローンのタイプに同質遺伝子であることを確認してください。
- ターゲティングベクターを設計する際の基準を対象に従来の遺伝子を適用します。主なパラメータは、変更がイントロンカセットの遺伝子ノックアウト戦略との間隔と配置に削除のための重要なエクソン（CE）を定義する、構成的または条件付きであることが要求されているかどうかが含まれる。
注：これらの各々は、他の場所10で詳細に論じられている。 - ターゲット修飾部位に隣接する5〜6キロバイトの各ゲノム領域を選択してください。
注：上限等をp15A、pBR322のようなプラスミドをサブクローニング低コピーと80キロバイトとBACと、最大200キロバイトの高さであり得るが、サブクローン挿入物の大きさは、通常、そのため10〜12キロバイトですベクトル。
2.マルチプレックス遺伝子改変オリゴ
- プラスミド骨格（サブクローニングプラスミド）および選択マーカー（挿入カセット）の設計上のオリゴ。それは180 bpのHA隣接するゲノム標的部位と挿入カセットまたはサブクローニングプラスミド（ 図2）の具体的なプライミング配列の20塩基対を含むように各オリゴを設計します。
注：相同アームは、任意の反復要素を含むべきではない、反復的な要素の存在が間違っターゲティングおよびサブクローニングになります。反復要素 'は、'リピートマスカー」などのウェブベースのツールを使用して検出することができる。 - （ 図2）を標的ES細胞のための遺伝子ターゲッティングベクターを線形化するベクトルオリゴの1にユニークな制限酵素（RE）サイトもあります。
- オリゴアナライザプログラムを使用して、オリゴパラメータを確認してください。プライミング領域での二次構造を避けるように注意してくださいS。
- 挿入カセットの短いHA（50 bp）が許容され、組換え体の下側の数を出したが、サブクローニングプラスミドHAが長い（180 bp）を常にであることを保証されている。
- '' cloneDB ''のようなウェブベースのツールを使用して、特定のBACクローンのゲノムDNAインサートの向きを決定します。 BACライブラリーの構築に使用されるBACプラスミドバックボーンのマップをチェックして、オリスからのレプリケーションの方向を確立します。
注：オリスは、すべての一般的に使用されるBACプラスミドのためのクロラムフェニコール（クロロフィル）マーカーの転写方向とは、通常は反対である。 - BACクローンのレプリケーションの方向と反対であるオリゴの5 '末端に二つの末端ホスホロチオエート（PTO）結合を追加する。リバースオリゴ（ 図2）に5 'リン酸修飾を追加します。
メモ：Red消化の際に非対称ホスホロチオエートPCRカセットは、その缶プライムラギング鎖のssDNA中間生成複製フォークの。
注：最大多重組換え頻度は、ラギング鎖保護されたカセットを用いて観察される。リーディング鎖は、保護またはデュアル保護されたカセットは、いくつかの遺伝子座で同等の再結合効率を得られないことがあります。 - ページまたはHPLC精製とオリゴを注文。
はpSC101 BADgbaA遺伝子改変プラスミド3. BACクローン変換。
- E.を作成するには熟練したBACのコンビを有する大腸菌株は、赤遺伝子16を含むBADgbaAはpSC101プラスミドとそれを変換する。
注：はpSC101 BADgbaAプラスミドはアラビノース誘導のaraC-P BADプロモーター、テトラサイクリン選択マーカーおよび温度感受性はpSC101レプリコンの制御下に赤とのRecA遺伝子が含まれています。- BAC寒天培養におけるスタブの滅菌ピペットチップおよび12.5を含有するLB培地（LB）pH8.0で5.0mlの接種56; G ml -1のクロロフィル。 200rpmで振盪し、5時間37℃で成長する。
- 氷上で10％（v / v） のグリセロール溶液、マイクロチューブ、エレクトロポレーションキュベットを冷却する。 4℃の冷蔵大型遠心機およびマイクロ遠心クール。
- 分光光度計を使用して培養物の光学密度（OD）を決定し、600nmで吸光度を測定する。 0.3〜0.8のOD 600読み取りに達したとき（後述）エレクトロコンピテント細胞を調製する。
- 4℃で5分間、1216×gで大きな遠心分離機で50mlの遠心チューブに細胞をスピンダウンする。
- チルド10％グリセロール1mlで細胞を洗浄し、4℃で20秒間17949×gで細胞をスピンダウン。洗浄工程を3回の合計を実行します。
- 10％グリセロールの全量50μlで細胞を再懸濁し、はpSC101 BADgbaAのコンビプラスミドの10-200 ngのを追加します。ピペッティングにより単一細胞懸濁液を得数回上下した後、予備冷却1ミリメートルギャップエレクトロポレーションキュベットに細胞を移す。
- 1.8 KV、25μFと200Ωの設定で細胞をエレクトロポレーション。
注：エレクトロの各ブランドの正しい設定を確認してください。エレクトロポレーションの時定数は、4未満の塩および他の不純物の存在を示している。 - 直ちにLB 1mlの細胞を回収し、50 ml遠心チューブに細胞を移す。
- 200 rpmで振とう2時間、30℃でBAC gbaA文化を育てる。
注：細胞は、温度感受性REPEの複製因子の不活性化を37℃で増殖させた場合はpSC101 BADgbaAプラスミドが失われた。コンビ機能を維持するために30℃でgbaA細胞を増殖。 - 回収されたBAC gbaA培養液に12.5μgのml -1のクロロフィルを含むLBの9ミリリットルと4μgのmlの-1テトラサイクリン（テト）を追加します。成長する30でのBAC gbaA文化O / N ℃、200 rpmで振とう。
注：スーパーコイルgbaAプラスミドをエレクトロポレーションの形質転換効率は、液体培地中で飽和成長O / Nを可能にするのに十分に高い。
挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドの4準備
- 以下に説明するように、挿入カセット（複数可）およびサブクローニングプラスミドにHAを組み込むことが、長い修飾オリゴを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行う。
- オプション：コンビ反応へのプラスミドのキャリーオーバーを防止するために、挿入カセットを増幅するためにR6K起源または類似の狭い宿主域プラスミドテンプレートを使用します。
- 代替的に、RE消化物（ 表2）を用いてプラスミド鋳型を線形。 PCR増幅領域の外側にカットして、熱不活性化されるREを選択してください。 MANUFにより推奨されるように熱がREを不活性化acturer。
- 忠実度の高いホットスタートDNAポリメラーゼ系を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を設定する。 （ 表3）に詳述するようにPCRマスターミックスを調製する。 （ 表3）に示すように、熱サイクルを実行します。
- アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を分析する。 0.5mgのml -1の臭化エチジウム（EtBrを）を含む1％（w / v）アガロースゲル上に、各PCRの負荷1-5μlの。
NOTE：非特異的増幅産物の存在は、リコンビ反応に干渉しない。しかし、いくつかの場合において、プライマーダイマーはコンビ効率を減少させることができる。 - PCR精製キットを用いてPCR産物を精製する。
- オプション：PCRクリーンアップに続いてDpnIで処理することにより、PCRのからプラスミドテンプレートを削除。 （製造業者によって推奨されるように）滅菌脱イオン水の最小量のDNAを溶出する。
注：のDpnIを添加すると、目の切断の効率の低下にPCR反応の結果を未精製のためメチル化プラスミドDNA鋳型を電子。
- オプション：PCRクリーンアップに続いてDpnIで処理することにより、PCRのからプラスミドテンプレートを削除。 （製造業者によって推奨されるように）滅菌脱イオン水の最小量のDNAを溶出する。
- DNA標準、例えば 、λのHindIII消化物の既知のセットに対して、またはナノドロップ分光光度計を用いて、アガロースゲル分析によってPCR増幅されたDNAを定量化する。
5.サブクローニングプラスの挿入
- 10mlのLB +クロロフィル+テトに200μlのを追加することによって、O / N BAC gbaA文化50倍に希釈する。 30で成長する ℃で1時間50分間200rpmで振盪。ネガティブコントロールとして使用されるべきサンプルを含む。
- ステップ3.1.2で説明したように4℃にすべてのリコンビの資機材を冷やす。
- LB寒天のpHをサブクローニングベクター（ 表4）を選択するための、ならびに挿入されたDNA断片の選択を可能にする適切な選択的抗生物質（単数または複数）の正確な濃度を含む8のプレートを注ぐ。
注：一部の抗生物質は、pH感受性である。 LBを使用してくださいルールとして寒天のpH 8。 - L-アラビノースの10％（w / v）の溶液を調製する。 0.2μmのシリンジフィルターに通して滅菌フィルター。
NOTE：アラビノースgbaAプラスミドからコンビタンパク質の発現を誘導する。 - 分光光度計を用いてBAC gbaA文化のODを確認してください。 0.25〜0.3のOD 600に到達すると、次のステップで説明するように、リコンビニアリングタンパク質を誘導する。
- 0.2％のアラビノースの最終濃度を達成するためにBAC培養液10mlに10％のアラビノース溶液200μlを加える。 （アラビノースを含まない）非誘導培養物が含まれるが、陰性対照として使用する。
- 37にBAC文化を転送 C振盪インキュベーター°、230 rpmで振とう45分間レッド発現を誘導する。
注：赤のタンパク質の発現は、30℃において非効率的である。 - 細胞をスピンダウンし、ステップ3.1.5で説明したように、10％グリセロールで3回洗浄する。
- 、600-1追加000コンビ反応にサブクローニングプラスミドおよび挿入カセット（複数）の各々ngの。ベクター及びカセットの再結合能力との整合性をチェックするための唯一のベクトルとベクトルプラス単一のINSERTコントロールを含めます。
- 上下にピペッティングすることによって単一細胞懸濁液を得た。 BACベクターの3時間37℃で、多コピープラスミドまたはLB 10ml中で1時間、37℃で1 mlのLB中にステップ3.1.7およびその後の回復に記載のようにエレクトロポレーションを行う。
- デュアル選択寒天プレート上で回収した培養プレートの異なる希釈例えば、90％、10％、1％及び37で成長 16時間のC°。
組換え体の6.分析
- オプション：6から12個のコロニーを選び、HAフランキングプライマーとインサート特異的プライマーを用いたコロニーPCRを行う。サブクローニングプラスミドと挿入CASを含めるセッテプラスミドだけでなく、ネガティブコントロールとして、親BACクローン。
- コロニーPCRのアガロースゲル分析を実行します。予想されたサイズの明るいバンドの存在により陽性クローンを特定します。
注：SPIクローニングプロセスの高効率化は、主に正しい組換え体を生成します。
- コロニーPCRのアガロースゲル分析を実行します。予想されたサイズの明るいバンドの存在により陽性クローンを特定します。
- 選択的な抗生物質を含む5 mlのLBのpHを8にコロニーをピックアップし、37℃でO / Nを育てる。
- 製造業者の指示に従ってカラム精製キットを用いてDNAミニプレップを準備します。
- 標準的なフェノール - クロロホルム離または類似のプロトコルを使用してBACミニプレップDNAを準備します。
- ミニプレップDNA上REダイジェストを実行します。アガロースゲル電気泳動によって別々のDNA。正確なターゲティングベクターの期待断片サイズを有するクローンを同定するためにREパターンを分析。はっきり挿入欠けているベクトル（S）とインサート（複数可）を含有するベクターを区別するREを選択してください。
- オプティオナル：E.依然として存在しているBAC、を欠いている細胞を得るためにコンビ後コリ DH5アルファまたはDH10B 大腸菌を形質転換し、ミニプレッププラスミドDNAを使用してcoli細胞 。
- オリゴ合成のエラーをチェックするために、HAと挿入カセット間でDNA配列決定を行います。
Representative Results
ノックインのベクトル
ノックインターゲティングベクターは、タンパク質または遺伝子発現カセットの組込みにタンパク質コード領域における単一塩基対置換を含むゲノムにおける新規の配列特徴、蛍光マーカー、または親和性タグの融合を導入する必要性を反映している。ノックインベクターの構築戦略のSPIのアプリケーションをテストするために、2つの異なるテストケースを検討した。Dnttip1、タンパク質1A（TDIF1）と共にクラスIの脱アセチル化酵素（HDAC）、ヒストン分裂脱アセチル化酵素複合体を形成する相互作用、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端をコードし（MIDAC） 28。細胞分裂におけるDnttip1の役割を調査するために、タンデムアフィニティータギングアプローチは、相互作用タンパク質TDIF1を特定するために行った。長い相同性領域を含有するp15Aベクターを用いDnttip1遺伝子の一部をサブクローニングするための以前の試みは、低ギャップ修復効率がaで得られたndは頻繁に異常な組換え産物（データは示さず）。このように、Dnttip1座でノックインベクターの構築は困難なコンビの練習を提供しました。 SPI戦略は終止コドン（ 図3Aに置き換え、低コピーをp15Aベクターに最終エキソン（エキソン13）にまたがるDnttip1遺伝子 12 kbの部分をサブクローニングし、同時にエクソン13に二重親和性タグを選択カセットを挿入するように設計された）。 2X FLAG-カルモジュリン結合タンパク質（CBP）は、FRT-PGK-EM7-ネオマイシン（ネオ）-BGhpA-FRTカセット（2.0キロバイト）はDnttip1に隣接する120 bpのHAを含有していた二重のPTO修飾オリゴを使用して再直線化プラスミドから増幅したリンク終止コドン。 p15A不和合ZEO Dnttip1のサブクローニングベクター（1.7キロバイト）はDnttip1配列の末端に相同な200 bpの領域をサブクローン化することが含まれるものを構築した。 Dnttip1サブクローニングしたプラスミドを線形化されたREとPCRは20bpの修飾オリゴを用いて増幅したそれは、リーディング鎖保護されたベクトルを生成した。 PCR産物をDpnIは、治療を精製し、有能なDnttip1 BAC E.をコンビに同時エレクトロポレーションした大腸菌細胞ならびに非誘導対照細胞。 SPI反応は、寒天プレート（ 図3B）を含むゼオシン（ゼオ）とカナマイシン（カン）上にプレーティングした。 SPIは、分析12組換え体のすべてで正しく修正されたDnttip1ノックインベクター（ 図3C）を生成する。 DNA配列決定は、オリゴ合成またはPCR増幅に起因するエラーがないことを確認した。
SPIの別の例はP2rx1遺伝子に選択カセットに連結強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）のインフレーム挿入を含んだ。 P2rx1遺伝子は、ATP感受性イオンチャンネル29として機能するGタンパク質共役型受容体をコードする。 YFP蛍光への結合は、vaの細胞表面上のP2X1受容体の追跡を可能にするrious機能アッセイ。P2rx1従来のコンビ手法で重大な問題を提示している別の困難な遺伝子座である（データは示さず）。 SPIを使用して、ターミナルエクソン（エクソン12）を包含しP2rx1遺伝子の12キロバイトセグメントは、p15A不和合ZEOベクターにサブクローニングし、構築するためにエクソン12に終止コドンを交換するのeYFP -loxP挟まれneoカセットの協調した挿入に変更されましたP2rx1-のeYFPノックインベクトル（ 図3D）。この例では、ラギング鎖保護をp15Aベクター（1.7キロバイト）は230bpのHAとのeYFPカセットを含有していた50 bpのHAを含有し、また、未修飾のままにした。 のEYFP挿入カセット（2.7キロバイト）はスプライシング重複pEYFP-C1から増幅のeYFP遺伝子のPCR、PCR、およびLoxP- PGK-EM7 -ネオBGhpA-のLoxPカセットを組み立てた、PCRは、pL452（NCI、フレデリック）から増幅。 SPI反応はコロニー数百の生産（データは示さず）。 DNAの分析RE11個のクローンから調製したミニプレップは大半が正しく組み立てP2rx1-のeYFPノックインベクトル（ 図3E）を含むことを示した。 DNA配列決定によって追加の検証はのeYFPカセットのエラーフリーの挿入を示した。しかし、クローンの一部を修理タグなしギャップのプロファイルと同じセル内のタグ付けされたギャップ修復プラスミド（レーン6-9）を示した。いくつかのサンプルはまた、不正確に含まれるギャップ修復（レーン2）またはmistargetedプラスミド（レーン4および5）。短いHAを使用した場合、または長いDNA断片30のレッドシビ上の制約から起こる大カセット（> 3キロバイト）を、使用時に同時サブクローニングおよび一部のSPI換え体ターゲティングの失敗は、効率的なSPIクローニングの限界を強調しています。実際に、200 bpのにのeYFPカセットのHAを増加させることはSPI効率とカセットの正確なターゲティングを（データは示さず）増加した。 JM8.N4でのEYFPノックインベクター- P2rx1で遺伝子ターゲティングマウスES細胞（C57BL / 6株）を正確に標的P2rx1-のeYFP配列 （ 図3F）を含有する、96のうち6個の陽性クローンを生成した。
BACのレポーターベクター
標的遺伝子のBACクローンは、多くの場合、すべての必要な上流及び下流の調節エレメント、例えば、エンハンサー、等のUTRが含まれ、並びに天然のレベル31での遺伝子発現を駆動するための内因性プロモーター。 BACレポーターベクターは、従って、遺伝子32の内因性発現パターンを再現するための好ましいビヒクルである。しかし、（200キロバイトまで）BACプラスミドのサイズが大きいセル33に無傷BACをトランスフェクトすると有意な実用的な問題を提示する。遺伝子の必要な調節エレメントを保持しながら、34,35トリミング BACを通してBACゲノム挿入のサイズを縮小する、より効率的なtransfectiにおけるBAC、結果のより容易な取り扱いを可能にする上。現在のBAC工学技術は、この目標35を達成するためにコンビの複数のラウンドを伴う。 BACにおけるSPIの有用トリミングを実証するために、pBeloBAC11 BACベクターはP2rx1遺伝子 （ 図中で一緒のeYFPカセットの同時挿入を168キロバイトP2rx1 BACから全長P2rx1遺伝子を含む30キロバイトゲノム配列をサブクローニングするために使用された図4（a））。 180 bpのHAを含むpBeloBAC11 ZEOベクターバックボーン（6.5キロバイト）をPCRラギング鎖保護されたベクトルを生成した修飾オリゴを用いて増幅した。以前P2rx1ノックインベクター構築に使用したのと同じのeYFPネオカセット（3キロバイト）は、PCRは、180bpのHAを含むラギング鎖保護されたオリゴを用いて増幅し、終止コドンを置換P2rx1エクソン 12を標的とした。 P2rx1 BAC細胞へのEYFPカセットとpBeloBAC11のZEOベクトルのに続いて結合されたエレクトロポレーションはexprgbaAのコンビタンパク質ディエッサー、文化はBACプラスミドを分離する37℃で3時間10ミリリットルのLB pH8の中に回収された。純粋な組換え体は、寒天プレートゼオと菅に選択し、2×10 -6の頻度で観察された。コロニーPCR遺伝子型解析は、（ 図4B）で分析した6個のクローンの3にトリミング成功したBACを明らかにした。 のeYFP挿入部位を横切っロングレンジPCR増幅は3つの正のクローン（ 図4B）で正しいカセットの組み込みを確認した。 BACエンド」これらのクローンでのeYFPカセットのミスターゲティングの原因は5の正しい閉鎖への個別のかもしれませんが、 '末端のEYFPのインサートを欠いた3つのクローンはまた5で修理間違ってギャップた。 3 のeYFP陽性のBACクローンは、さらにREダイジェストを用いて分析し、正しくトリミングのeYFP組換えBAC（ 図4C <予想されるパターンを示した。/強い>）。配列分析は、3陽性のうちわずか1クローンのeYFPカセットにエラーがないことを明らかにした。
コンディショナルノックアウト（CKO）ベクトル
遺伝子発現の条件的アブレーションは発生過程を調査するため、または特定の時点における生物学的システムを研究するための重要なツールである。条件付きの遺伝子ノックアウト戦略は、一般的に重要なエクソン（CE）の周囲のLoxP組み換え部位の配置を伴う。 Cre発現または活性化の際にCEの削除が原因ナンセンス仲介崩壊（NMD）のmRNAの分解、その結果、フレームシフトと未成熟終止コドンを生成します。条件付き遺伝子ターゲティングベクターの構築は複雑な作業であり、いくつかのサブクローニングの段階、ターゲットと変態22を伴う。 SPIは、このプロセスを簡素化するための便利なルートを提供しています。テストケースとして、Zrsr2遺伝子の条件付き対立遺伝子を構築したSPI方法（ 図5A）を使用して。 Zrsr2遺伝子は、スプライシング因子をコードし、単一のコピーがX染色体上に位置している。遺伝子欠失の条件状態は、恒常的な遺伝子欠失ターゲティング戦略でES細胞の選択中にZrsr2の欠如に適応する細胞の可能性を制御するためにこの例では特に重要である。 SPIは、2つの異なるのLoxPが隣接選択カセットの同時挿入にZrSr2遺伝子 10 kbの部分をサブクローニングするために行った。 FRT-PGK-EM7-NEO-FRT-のLoxPカセット（2キロバイト）REから増幅PCRはZrSr2イントロン2ロックス-PGK-em7-を含む第二のカセットをターゲットに180 bpのHAを含まラギング鎖保護されたオリゴを使用してpL451を消化し 、ブラストサイ（BSD）-Rox-のLoxP（2キロバイト）をPCRイントロン3の下流領域に同一の隣接した2つのloxP部位を180 bpのHAを含むラギング鎖保護されたオリゴエクソン3、D CEとR6Kプラスミドから増幅したフレームシフトの条件のCre活性化の結果にeletionとは、未成熟終止コドンを導入しています。 Zrsr2サブクローニングプラスミド（1.6キロバイト）をPCR REから増幅した10キロバイトZrsr2配列の末端にマッチする180 bpのHAを含むラギング鎖保護されたオリゴを使用して、p15A不和合ZEOプラスミドを直線化。前に説明したゼオ+ネオ+ Bsdをプレート上にプレートとしてSPI反応を行った。 ZrSr2条件付きターゲティングベクターは、成功した（ 図5B）を調べ12組換え体のほとんどで組み立てた。さらに、DNA配列決定分析はZrSr2 CKOベクターにおける選択マーカーの両方の正確な挿入を示した。
図1。SPIクローニング。単一のステップでカセット挿入およびサブクローニングを組み合わせたSPIクローニング·プロセスの概要。 （A）BACクローンは、トランはpSC101 BADgbaAプラスミドでsformedと30℃で増殖させた。レッドタンパク質を発現するアラビノース誘導後（B）は、非対称の修正された挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドは、BACクローンに導入し、最終ベクターを生成するための挿入およびサブクローニングマーカーの両方で選択されている。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。
SPIのリコンビオリゴの設計を示 す図2の回路図。サブクローニングプラスミドおよび挿入カセットが両末端PTOおよびリン酸修飾されたオリゴの組み合わせを用いてPCRによって生成される。 生体内でのレッド消化時のPCR断片を、複製フォークのラギング鎖にアニールする、一本鎖DNA中間体を生成します。ジェン示すように、50〜180塩基対の電子特定のHAが各オリゴに組み込まれている。矢印は、候補遺伝子を横切るDNA複製の方向を示す。破線は、PCR産物に取り込まれないサブクローニングプラスミド配列を表す。 REサイト、最終ベクターの線形化の制限酵素部位; F、サブクローニングプラスミドまたは挿入カセットに特異的なフォワードシーケンス（20 bp）を。 R、プラスミドまたはカセットの逆相補配列（20塩基対）; SM、選択マーカー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. SPIは難しいノックインベクターの構築を可能にします。Dnttip1デュアルの構築に使用されるSPI戦略の（A）は概略がベクトルをタグ付け。アローINDIBACクローンのレプリケーションの方向をケイツ。Dnttip1 SPI実験の非誘導および誘導サンプルの（B）めっき結果。Dnttip1 SPIクローンの（C）のEcoRI消化物。 M、1キロバイトラダー（NEB）; C、をp15A Dnttip1ギャップがデュアルタグカセットを欠いたプラスミドを修理した。フラグメントサイズは、次のとおりです。タグ付き、9.2 + 4.4 + 2.2キロバイト。コントロール; 9.2 + 4.6キロバイトP2rx1-のeYFP SPIクローンの（D）SPIベースP2rx1-のeYFPノックインベクターの構築。（E）EcoRI消化。 M、1キロバイト+ラダー（Invitrogen社）; C、をp15A P2rx1ギャップがのeYFPカセットを欠いたプラスミドを修理した。フラグメントサイズは、次のとおりです。タグ付き、8.3 + 4.4 + 3.1 + 0.03キロバイト。コントロール; 8.3 + 3.1 + 1.8 + 0.03 KB（F）P2rx1のサザンブロット分析- 。JM8.N4 ES細胞の細胞内標的にのeYFP遺伝子 。トップパネル、PshAIダイジェストを使用して、3 '末端プローブとサザンブロット。 5つのクローンのスクリーニング結果が示されている。底板、サザンブロットを用いてエンドスクリーニング5 '3から識別陽性のエンドプローブおよびSpeIダイジェスト」。 PshAI RE部位; S、SpeIのREサイト。破線は、ベクトルHAの終了を表す。ブラックボックスは南のプローブを示している。予想される制限フラグメントは、PshAIです; のeYFP-ネオ 、11.5キロバイトWT、8.9キロバイト。 SpeIで：WT、6.9キロバイト、 のeYFP-ネオ 、7.6キロバイトは、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4。簡体BACがSPIを使用してトリミング。（A）は概略BACは、SPIを使用してトリミングの概念を説明する。シンボルへのキーは、 図1に記載されている5 'および3'両端の（B）PCR増幅はサブクローン挿入物の端部とP2rx1-のeYFPの insertioまたがっn個のサイト。スクリーニング戦略は、PCRの種類ごとに示している。 M（上のパネル）、Hyperladder 25 BP、（下のパネル）、1キロバイト+; P、P2rx1 BAC。 S、プラスミドサブクローニングpBeloBAC11のゼオ （C）（B）から三のeYFP正SPI BACクローンのHindIII消化物。 E、トリミングのeYFP BACのHindIII制限パターンと予想。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SPIクローニングを使用して図5.条件付きノックアウトベクトル生成。Zrsr2 対立遺伝子のサブクローニング中に2つの異なるのLoxP挟まれた選択カセットの同時挿入の（A）は概略。シンボルへのキーは、 図1に記載されている（B）<Zrsr2 SPIクローンの/ strong>のEcoRIで消化。 L、1キロバイトラダー（NEB）; C1、プラスミドを修理しをp15A ZrSr2ギャップ 、C2、p15A不ZrSr2ギャップがネオインサートを含むプラスミドを修理し、 C3は、p15A不ZrSr2ギャップはbsdのインサートを含有するプラスミドを修理。フラグメントサイズは、次のとおりです。CKO、7.7 + 2.9 + 2.6 + 1.6キロバイト。 C1、7.7 + 4.0キロバイト。 C2、7.7 + 4.3 + 1.6キロバイト。 C3、7.7 + 2.9 + 2.3キロバイトこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| ステップなし | 従来のコンビのパイプラインA | 多重コンビのB |
| ステップ1 | BACホストへのリコンビプラスミドの形質転換 | BACホストへのリコンビプラスミドの形質転換。ターゲッティングカセットおよびサブクローニングベクターの調製。 |
| ステップ2 | R1 / R2ゲートウェイカセットの挿入 | 多重ギャップ修復クローニング |
| ステップ3 | フロックス菅カセットの挿入 | 単一コロニーからO / N培養 |
| ステップ4 | R3 / R4プラスミドへのギャップ修復 | プラスミド調製と検証 |
| ステップ5 | のCre + E.への転換大腸菌の | |
| ステップ6 | プラスミド調製と検証 | |
| ステップ7 | O / N三方ゲートウェイ反応 | |
| ステップ8 | DH10B E.に三方ゲートウェイ反応の変容大腸菌細胞 | |
| ステップ9 | 単一コロニーから一晩培養 | |
| ステップ10 | プラスミド調製および配列確認 | |
| 検証されたクローンと4日のBの平均時間 | ||
表1：条件付きノックアウトベクターの構築にSPIを有する従来のコンビニアリングの比較。
| REバッファ | 5μL |
| DNA | 1μgのプラスミドまたは精製したPCR産物 |
| RE | 1μL（5単位以上） |
| TE | 最大50μL |
| 少なくとも1時間37℃でインキュベートする。製造者の指示に従ってinacitvate加熱 | |
表2：REダイジェスト。
| PCR材料 | 最終濃度 |
| PCRバッファ | 1X |
| のdNTP | 200 nMの |
| MgSO 4を | 1.5 mMの |
| ベタイン | 1.3 M |
| DMSO | 1％ |
| フォワードプライマー | 200 nMの |
| リバースプライマー | 200 nMの |
| DNAポリメラーゼ | 1 U |
| テンプレート | マルチコピープラスミドまたはジェノタイピングPCRのためのミニプレップDNA2.5μlの10ngの |
| 水 | 最大50μL |
| マルチコピープラスミドと標準50μlのPCR反応のために。ロングレンジジェノタイピングPCRは25μlのPCR反応に設定した。 | |
| PCR条件 | |
| 95°C | 2分 |
| 92℃ | 10秒 |
| 55°C | 30秒 |
| 72°C | 30秒 |
| 30サイクルのB | |
| BサイクルはBACのPCR遺伝子型判定のために35に拡張することはできません | |
表3：PCRセットアップ規約。
| 抗生物質 | 濃度（μgのmlの-1） |
| Ampicllin | 50 |
| ブラストサイB | 40 |
| クロラムフェニコール | 12.5 |
| ゲンタマイシン | 2 |
| ハイグロC | 30 |
| カナマイシンB | 15 |
| テトラサイクリン | 4 |
| トリメトプリムC | 10 |
| ゼオシン | 5 |
| マルチプレックスコンビに組み合わせて使用する場合のBACおよびマルチコピープラスミドでの使用を推奨 | |
| ブラストサイジン（35μgのmlの-1）およびカナマイシン（6μgのmlの-1）の組み合わせで一緒に使用B | |
| ハイグロとトリメトプリムC単コピーのBACとの選択に推奨されていません。 | |
表4。SPI実験で使用するための抗生物質濃度を推奨。
Discussion
ES細胞株およびマウスモデルの構築は、歴史的に修飾された対立遺伝子4を含むプラスミド構築物を用いて標的化遺伝子を含んでいた。しかし、これらの複雑な遺伝子ターゲティングベクターの構築は、このようなモデルのタイムリーな生産の大幅なボトルネックであることが判明した。コンビ基づくベクター構築戦略の開発は、改良されたベクターの設計と、より効率的なベクターの組み立てを可能にした。それにもかかわらず、現在のコンビニアリングプロトコルはまだ、複数のステップを伴う中間プラスミド精製を必要とし、別の細菌の菌株を使用しています。プラスの挿入をサブクローニングすることは常駐BAC宿主株で1エレクトロポレーションイベントで実行することができるベクターの構築への新しいアプローチを提供しています。遺伝子ターゲティングにおけるSPIの有用性は、ベクター構築のさまざまなアプリケーションで、ここで試験した。ここで調べたすべての場合において、SPIは、効率的であることが証明され、正しい組み換えプラスミドを作製した。多くの場合、複数の異なるカセットを正しくターゲティングベクターに挿入した。大きなDNAカセットおよびベクターを容易SPIプロトコルに収容し、このシステムの柔軟性を実証した。
SPIは、直鎖DNAカセットの長い相同性配列、およびホスホロチオエート（PTO）保護の使用に依存している。 PTO修飾は、線形DNA 20,21にエキソヌクレアーゼに対する保護を与え、長いHAの多重化を可能にするために再結合効率を増加させる。しかし、より長いオリゴ配列の合成は、エラーを特に欠失を蓄積する可能性を増大させる。それらはタンパク質コード領域をカバーしている場合、オリゴ中の変異は、特に有害である。 DNAのHA全体のシーケンシングおよび挿入されたカセットの全長をカバーするには非常にすべての配列変化を有するクローンを排除することをお勧めします。高忠実度DNAポリメラーゼシステムの使用はまた、導入を回避することが提案されているY PCRエラー。サブクローニングプラスミドのHAの長さおよび組成は、挿入カセット（データは示していない）のものと比較してより重要である。エクソン領域内の任意の変異が許容されていないノックインベクターの構築などの特に敏感なアプリケーションでは、挿入カセットのHAは、長いオリゴに伴う問題を回避するために、（50〜120 bp）を短縮することができる。 （複製の方向の知識が利用できない場合）、挿入カセットはまた、ホスホロチオエート修飾されていないまたはデュアル残すことができる。しかし、これらの場合の多重化はまだ長いHAサブクローニングプラスミドが保護された必要があります。この特定の戦略の注意点は、潜在的に異なる遺伝子座でのSPIクローニングに影響を与える可能性が多重化効率の低下である。
挿入カセットおよびサブクローニングプラスミドの長さは、SPIクローニングにおける別の重要なパラメータである。より大きなDNA分子が少なく効率的にエレクトロポレーションおよび効果は、再指定された、累積され同じセル内のすべてのカセットを導入するquirement（データは示さず）。多重化は、より小さな挿入カセットと最も効率的です。 DNAは3キロバイト30までの最も効率的であるのssDNA処理を、仲介3キロバイトより大きく、また赤に制限を置く断片化します。 3キロバイトを超える挿入カセットを切除デュアルであり、ベータ独立した経路20を介して、より少ない効率的に再結合する。したがって、正しいクローンを同定するのに十分なコロニーのスクリーニングは、これらの場合に重要になる。組み換えポストエレクトロポレーションの長い持続時間も難しいのSPI演習で正しいクローンの回復の可能性が高くなります。四つの小カセット（<1.5キロバイト）多重化効率は、各追加のカセットと共に減少するものの、SPI処理と同時に挿入することができるまで（データは示さず）。しかしながら、これは最適なSPIの実験の結果を反映し、多くの大規模なカセットを使用する場合には、多重化の限界を考慮することが望ましい。 クラスタ化された定期的にinterspaced短い回文反復（CRISPR）のようなゲノム編集ツール-cas9エンドヌクレアーゼシステムの開発は、新規ゲノム修飾の作成 を可能にした、より効率的なゲノム工学36につながっている。しかし、これらの新しい技術は、遺伝子ターゲッティングベクターを補完するのではなく、それらに取って代わっている。これは、CRISPR-casのシステムは、抗生物質選択を交換し、さらに多重コンビプロトコルを絞り込むことが想定される。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
| Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
| C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
| KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
| L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
| Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
| QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
| Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |
References
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