Introduction
Gen hedefleme teknolojilerin geliştirilmesi, farklı biyolojik sistemlerin 1-3 araştırmak için hücre hatları ve fare modellerinin yapımını sağladı. Genomik dizisinin değişimiyle anahtar ilk aşama 4 vektörü hedef gen tasarım ve yapı. Hedefleme vektörler, bir seçim işaretleyici (örn, neomisin) tarafından kapatılması istenen bir değişiklik (ler) i ihtiva eden ilgi aleli taşıyan plazmit ve memeli hücrelerinde 5 verimli homolog rekombinasyon için gerekli olan uzun genomik bölgelerdir. Hassas gen modifikasyonu embriyonik kök hedefleme Vektörün sokulmasıyla (ES) hücreleri üretilmiş 6 ya da somatik hücreler 7 ile elde edilir ve böylece hedef vektör DNA dizisinin aynı uzanan arasında homolog rekombinasyon ve amaçlanan modifikasyon transferinde genomik lokus sonuçları Gen dönüşümü 8 ile genomuna. Bu modifiEd ES hücreleri daha sonra germlin 9 vasıtasıyla modifiye edilmiş bu allel iletebilir yavrular (Khimaira'da) üretilmesi için fare blastokistlerine enjekte edilebilir. Transjenik farelerin üretilmesi için alternatif bir yol, fare genomu 10 vektörün rastlantısal bir bütünleşmesine yol açan tek hücreli fare zigot bir gen ifade vektörü, mikroenjeksiyon içerir. Vektör inşaat Geleneksel yöntemler konvansiyonel yararlanmıştır bir vektör omurgasına farklı seçim işaretleyici ve genomik fragmanları klonlamak için sınırlama enzimleri ve DNA ligaz kullanılarak klonlama 'kes ve yapıştır'. Ancak, geleneksel klonlama içsel bir sınırlayıcı faktör konumlandırma ve sınırlama sitelerinin seçimi özellikle uzun DNA dizileri ile vardır. Bu genellikle birden fazla alt klonlama adımları gerektirir ve aynı zamanda sık sık hedef geninin daha düşük bir etkinliğe yol vektörü içine yabancı DNA dizilerini sunmaktadır.
Recombineering (rekombinojenik engineering) E. faj rekombinasyon proteinleri aracılığı ile homolog rekombinasyon (HR) kullanarak bu kısıtlamaların üstesinden bir DNA mühendisliği teknolojisi E. coli hücreleri, 11,12. Homolog bir dizinin herhangi bir bölge recombineering bir alt-tabaka olarak hizmet için, restriksiyon siteleri mevcudiyetine kısıtlamaları kaldırılır. Büyük DNA dizileri sorunsuz dolayısıyla yapısal bütünlüğünü 13 koruyarak, doğrudan in vivo modifiye edilebilir. Recombineering kısa bir homoloji (50 bp), 14 ve bu nedenle homoloji kolları (HA), uygun sentetik oligo dizileri dahil edilebilir çok etkilidir. Tipik Recombineering deney, bir oligo veya bir HA ihtiva eden bir çift şeritli DNA (dsDNA) fragmanı olarak Recombineering yetkili E. elektropore edildi kromozom üzerinde veya bir plazmid 15 ya yer alan hedef içeren coli hücreleri. rekombinasyon potansiyeli Kırmızı rec indüklenebilir ifade tarafından verilmektedirombination faj 16,17 proteinler veya rac profajından 18 RecET proteinleri. Kırmızı / rece eksonükleaz sonra ortağı, Kırmızı / Rect, tek damarlı bir tavlama protein (SSAP) 19 ile bağlı olan ara ürün olarak tek kordonlu bir DNA (ssDNA), lineer dsDNA dönüştürür. Uzun bir ssDNA ya da tamamlayıcı bir hedef sekansın kısa bir oligo tavlama replikasyon çatal gecikmeli şeridi üzerinde meydana gelir ve hedef bölgede dizisinin dahil edilmesine yol açar. Strand ssDNA rekombinasyon kalmış recombineering yüksek verimlilik temeli olan ve 'beta' rekombinasyon modeli 20,21 ile tarif edilebilir.
Tipik bir Recombineering iş akışı bir gen hedefleme vektör aşağıdaki iki yolların birini içerir inşa etmek. Bir yol LoxP rekombinasyon siteleri sıralı ekleme, bir işaretleyici tarafından izlenen bir plasmid içine bir fare BAC klon istenen genomik bölge alt klonlama içerir
Protocol
Tasarım Hedefleme 1. Gen
- Ilgi genomik bölgeyi kapsayan uygun bir BAC klonu Sipariş. Bu, örneğin değiştirilebilir ES hücre tipine izogenik olduğundan emin olun, gen için RPCI-23 ve RPCI-24 BAC klonları, C57BL / 6 ES hücreleri hedefleme.
- Hedefleme vektör tasarımı hedefleme ölçütlerini geleneksel geni uygulayın. Anahtar parametreler değişiklik intronik kasetleri bir gen nakavt stratejisi ve aralık ve yerleştirme silinmek üzere kritik eksonları (CE) tanımlayan, kurucu veya koşullu olarak gerekli olup olmadığını içerir.
NOT: Bu her yerde, 10 ayrıntılı olarak ele alınmıştır. - Hedef modifikasyon sitesi kuşatan 5-6 kb Her genomik bölgeleri seçin.
NOT: Üst limit p15A gibi plazmid subklonlama düşük kopya ile 80 kb gibi yüksek olabilir, ancak alt klonlanmış insert büyüklüğü, bu nedenle genellikle 10-12 kb, pBR322 vb bir BAC ile 200 kbVektör.
2. Multiplex Recombineering Oligolar
- Plazmid omurgasından (alt klonlama plazmid) ve seçilebilir bir marker (yerleştirme kaset) için tasarım oligolar. 180 bp'lik bir HA yan genomik hedef alan ve ekleme kaset ya da alt-klonlama plazmid (Şekil 2) spesifik hazırlama dizisinin 20 bp içerir, öyle ki her bir oligo tasarlar.
Not: Homoloji kolları herhangi bir tekrar eden elemanları içermemelidir, tekrar eden elemanın varlığı, yanlış hedefleme ve alt-klonlama neden olur. Tekrarlanan unsurlar gibi '' Masker tekrarlayın 'gibi web tabanlı araçları kullanılarak tespit edilebilir. - ES hücresi (Şekil 2) hedefleme için gen hedefleme vektörü lineer bir vektör oligo biri benzersiz bir sınır enzimi (RE) sitesi içerir.
- Bir oligo analizör programı kullanılarak oligo parametrelerini kontrol edin. Hazırlama bölgede ikincil yapıları önlemek için özens.
- Ekleme kasetinin kısa HA (50 bp), tolere edilen ve yeniden bileşenler alt numarasını verir, ancak alt-klonlama plazmid HA daha uzun (180 bp), her zaman temin edilmektedir.
- '' CloneDB '' gibi web tabanlı araçları kullanarak belirli BAC klonu genomik DNA ucun yönünü belirleyin. BAC kütüphane yapımında kullanılan BAC plazmid omurgası haritasını kontrol ederek Oris gelen çoğaltma yönünü oluşturulması.
Not: ORIS yaygın olarak kullanılan tüm BAC plasmidler için Kloramfenikol (Chl) marker transkripsiyon yönüne zıt genellikle. - BAC klonu üzerinde replikasyon yönüne zıt olan oligo 5 'ucuna iki uç fosforotioat (PTO) bağlar ekleyin. Ters oligo (Şekil 2) bir 5 'fosfat modifikasyonu ekleyin.
NOT: Kırmızı sindirim üzerine asimetrik phosphorothioated PCR kaset ki can başbakan kalmış iplik bir ssDNA ara üretirreplikasyon çatalının.
NOT: Maksimum multipleks rekombinasyon frekansı gecikmeli iplikçik korumalı kasetleri ile görülmektedir. Lider iplik korumalı veya çift korumalı kasetleri bazı loci eşdeğer rekombinasyon verimliliği üretmek olmayabilir. - PAGE veya HPLC saflaştırma ile oligoları Sipariş.
PSC101 BADgbaA Recombineering Plazmid 3. BAC klon dönüştürülmesi.
- E. yapmak için yetkin BAC Recombineering taşıyan E. coli suşu, Kırmızı genlerini içeren 16 pSC101 BADgbaA plazmid ile dönüşümü.
Not: pSC101 BADgbaA plazmid arabinoz uyanlabilir araC'nin p kötü promoteri, bir tetrasiklin, seçim işaretleyicisi ve sıcaklığa duyarlı pSC101 replikon kontrolü altında kırmızı ve RecA gen içermektedir.- BAC Agar kültür içinde bir steril pipet bıçakla ve lizojeni suyu 5.0 mi inoküle (LB) 12,5 ihtiva eden, pH 8.056 g mi -1 Chl. 5 saat 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de büyütülmüştür.
- % 10 (h / h) gliserol çözeltisi, mikrosantrifüj tüpleri ve buz üzerinde elektroporasyon küvetler soğutun. 4 ° C'ye kadar soğutulmuş bir büyük santrifüj ve mikrosantrifüj soğutun.
- Bir spektrofotometre kullanılarak, kültürün optik yoğunluğu (OD) tespit edilmesi ve 600 nm'de absorbans ölçümü. 0,3-0,8 olan bir OD 600 okuma ulaşıldığında (aşağıda tarif edildiği gibi), elektro-hücre hazırlayın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1216 x g'de büyük santrifüj içinde bir 50 mL santrifüj tüpüne hücreleri dönerler.
- Soğutulmuş% 10 gliserol, 1 ml hücre yıkayın ve 4 ° C'de 20 saniye 17949 x g'de hücreleri aşağı dönerler. Yıkama 3 kez toplam adım gerçekleştirin.
- % 10 gliserol, 50 ul toplam hacim içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve pSC101 BADgbaA Recombineering plazmid 10-200 ng ekleyin. Pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu elde ediliryukarı ve birkaç kez aşağı ve daha sonra önceden soğutulmuş 1 mm'lik bir açıklık elektroporasyon küvetine hücreleri aktarın.
- 1.8 kv, 25 jxF ve 200 Ω bir ortamda hücreleri electroporate.
NOT: elektroporatörü her marka için doğru ayarları kontrol edin. En az 4 elektroporasyon bir zaman sabiti tuz ve diğer yabancı maddelerin varlığına işaret etmektedir. - Hemen LB 1 ml hücreleri kurtarma ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın.
- 2 saat 200 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de BAC gbaA kültür büyütün.
Not: hücreler, sıcaklığa duyarlı REPE çoğaltma faktörünün etkinliğinin durdurulmasına 37 ° C'de büyütüldüğünde elde pSC101 BADgbaA plazmid kaybolur. Recombineering fonksiyonlarını korumak için 30 ° C'de gbaA hücreleri büyütün. - 12.5 mikrogram ml -1 Chl ve 4 mg ml -1 Tetrasiklin (Tet) kazanılan BAC gbaA kültürüne içeren LB 9 ml ekleyin. BüyümekBAC gbaA kültür O / N 30 de ° C, 200 rpm 'de çalkalanarak.
Not: süper sarılmış gbaA plazmidi elektroporasyon bir dönüşüm etkinliği, sıvı ortamda doyma büyüme O / N olanak sağlamak üzere yeterince yüksektir.
Yerleştirme Kasetleri ve Altklonlaması Plazmidlerinin 4. Hazırlık
- Aşağıda tarif edildiği gibi, uzun modifiye oligolar kullanılarak (PCR), ekleme kaset (ler) ve alt-klonlama plazmid içine HA dahil polimeraz zincir reaksiyonu yapmak.
- İsteğe bağlı: Recombineering reaksiyonu içine plazmid taşınmasını önlemek için, ekleme kasetini yükseltmek için R6K kökeni veya benzeri dar ana aralığı plazmid şablonu kullanın.
- Seçenek olarak ise, bir RE digest (Tablo 2) kullanılarak plazmid şablonu linearize. PCR amplifikasyon bölge dışındaki keser ve ısı inaktive bir RE seçin. Manuf tarafından tavsiye edilen ısı RE inaktiveacturer.
- Yüksek sadakat sıcak başlama DNA polimeraz sistemi kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ayarlayın. (Tablo 3) ayrıntılı olarak bir PCR ana karışımı hazırlayın. (Tablo 3) gösterildiği gibi termal bisiklet gerçekleştirin.
- Agaroz jel elektroforezi ile, PCR ürünlerini analiz edin. Yük 1-5% 1 üzerine her PCR ul, 0.5 mg mi -1 etidiyum bromür (EtBr) içeren agaroz jeli (w / v).
Not: spesifik olmayan amplifikasyon ürünlerinin varlığı Recombineering reaksiyonunda karışmaz. Bununla birlikte, bazı durumlarda, astar dimerler Recombineering verimliliğini düşürür. - PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünleri saflaştırılır.
- İsteğe bağlı PCR, temizlenmesi ve ardından DpnI ile muamele ile PCR'den gelen plazmid şablonu kaldırmak. (Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi), steril iyondan arındırılmış sudan oluşan bir minimal hacimde Elute DNA.
Not: DpnI ilavesi th bölünme düşük verimlilik PCR reaksiyonları sonucu saflaştırılmamış içinE metillenmiş plazmid DNA şablonu.
- İsteğe bağlı PCR, temizlenmesi ve ardından DpnI ile muamele ile PCR'den gelen plazmid şablonu kaldırmak. (Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi), steril iyondan arındırılmış sudan oluşan bir minimal hacimde Elute DNA.
- DNA standartları, örneğin, λ Hindlll ile sindirilmiş, bilinen bir dizi karşı veya NanoDrop spektrofotometre kullanılarak, agaroz jel analizi ile PCR ile amplifiye edilmiş DNA miktarı belirlenir.
5. Altklonlaması Artı Yerleştirme
- 10 ml LB + Chl + Tet 200 ul ekleyerek O / N BAC gbaA kültürü 50 kat sulandırmak. 30 büyüyecek ° C de 1 saat 50 dakika süre ile, 200 rpm'de çalkalanarak. Bir örnek dahil negatif kontrol olarak kullanılır.
- Aşama 3.1.2 tarif edildiği gibi, 4 ° C, tüm Recombineering malzeme ve ekipmanlar soğutun.
- LB agar pH alt klonlama vektörü (Tablo 4) seçimi için hem de eklenir DNA fragmanının seçimine olanak tanır uygun seçici antibiyotik (ler) doğru bir konsantrasyonunu ihtiva eden 8 plakaları dökün.
Not: bazı antibiyotikler, pH duyarlıdır. Kullanım LBBir kural olarak, agar, pH 8. - L-Arabinoz çözeltisi (ağırlık / hacim), 10% hazırlayın. 0.2 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek sterilize filtre.
Not: Arabinoz gbaA plazmidinden Recombineering proteinlerinin ekspresyonuna neden olur. - Bir spektrofotometre kullanılarak BAC gbaA kültürünün OD kontrol edin. Takip eden aşamada tarif edildiği gibi 0,25-0,3 600 ulaşıldığında bir OD sonra, Recombineering proteinleri neden olur.
- % 0.2 Arabinoz bir son konsantrasyon elde etmek için BAC kültürü, 10 ml% 10 arabinoz çözeltisi 200 ul ekle. (Arabinoz olmadan) indüklenmemiş kültürü dahil negatif kontrol olarak kullanılır.
- Bir 37 BAC kültürü aktarın Cı çalkalanarak kuluçka ° ve 45 dakika 230 rpm 'de çalkalanarak Red ifadesini teşvik eder.
Not: Kırmızı proteinlerin sentezlenmesi, 30 ° C 'de verimsizdir. - Hücreleri Spin ve aşama 3.1.5 tarif edildiği gibi,% 10 gliserol ile 3 kez yıkayın.
- , 600-1 ekle000 alt-klonlama plazmid ve Recombineering reaksiyona sokma kaset (ler) inin her ng. Vektör ve kaset rekombinasyon yeterlilik ve bütünlüğünü kontrol etmek için sadece vektör ve vektör artı tek ekleme kontrolleri ekleyin.
- Yukarı ve aşağı pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu elde edilir. BAC vektörleri için 3 saat boyunca 37 ° C 'de, çok kopya plazmid ya da LB 10 ml, 1 saat boyunca 37 ° C' de, 1 ml LB içinde aşama 3.1.7 ve geri kazanılması tarif edildiği gibi elektroporasyon yapın.
- Geri kazanılan kültür, örneğin,% 90,% 10, 1 çift seçme agar plakaları üzerinde% ve 37 ° C'de büyümeye Levha farklı seyreltme 16 saat boyunca ° C.
Rekombinantlarının 6. Analizi
- İsteğe bağlı: 6 ila 12 koloniler seçin ve bir HA komşu astar ve bir ekleme spesifik primer kullanarak koloni PCR gerçekleştirin. Alt klonlama plazmid ve ekleme cas dahilsette plazmid hem de negatif kontroller olarak ana BAC klonu.
- Koloni PCR'ler agaroz jel analizi yapın. Beklenen boyutta parlak bir bant mevcudiyeti ile pozitif klonların belirlenmesi.
NOT: SPI klonlama sürecinin yüksek verimlilik çoğunlukla doğru rekombinantlarını üretir.
- Koloni PCR'ler agaroz jel analizi yapın. Beklenen boyutta parlak bir bant mevcudiyeti ile pozitif klonların belirlenmesi.
- Seçici antibiyotik içeren 5 ml LB, pH 8 içinde koloniler 37 ° C'de O / N büyür.
- Üreticinin talimatlarına göre bir sütun saflaştırma kiti kullanılarak DNA miniprepleri hazırlayın.
- Standart bir fenol-kloroform izolasyon veya benzer bir protokol kullanılarak BAC miniprep DNA'sının hazırlanması.
- Miniprep DNA üzerindeki RE digests gerçekleştirin. Agaroz jel elektroforezi ile ayrı bir DNA. Doğru hedefleme vektörü beklenen fragmanları boyutları içeren klonları tanımlamak için RE kalıplarını analiz. Açıkça vektör eksik parçanın (ler) ve eki (ler) içeren vektör arasındaki ayrımcılık bir RE seçin.
- Optional: hala E. mevcut BAC, yoksun hücreleri elde etmek coli recombineering sonra, DH5alpha veya DH10B E. dönüştürmek için miniprep plazmid DNA kullanımı E. coli hücreleri.
- Oligo sentezi hataları kontrol etmek HA ve yerleştirme kaset üzerinde DNA dizi gerçekleştirin.
Representative Results
Knockin Vektörler
Knock hedefleme vektörleri tek bir baz çifti, bir protein kodlama bölgesi içinde yer değiştirme, bir fluoresan işaretleyici füzyonu ya da bir protein için bir afinite etiketi veya bir gen sentezleme kasetinin entegre içeren genom içindeki yeni bir dizi özelliği tanıtmak için ihtiyaç göstermektedir. Çaldığımı vektör inşaat stratejileri SPI uygulamasını test etmek için, iki farklı test durumları incelendi. Dnttip1 protein 1A (TDIF1) birlikte sınıf I deasetilaz (HDAC) sübstrat olarak histon bir mitotik deasetilaz kompleks oluşturur etkileşim, deoxynucleotidyltransferase, terminali kodlar (MiDAC) 28. Hücre bölünmesi Dnttip1 rolünü araştırmak için, bir tandem afinite etiketleme yaklaşımı proteinleri etkileşim TDIF1 izole götürüldü. Uzun homoloji bölümlerini ihtiva eden bir p15A vektörü kullanılarak Dnttip1 geninin bir bölümünü alt klonlamak için yapılan önceki denemeler, düşük boşluk onarım verimliliği ile sonuçlanmıştırnd sık olarak anormal rekombinasyon ürünleri (veriler gösterilmemiştir). Böylece, Dnttip1 lokustaki bir çaldığımı vektör inşaat zorlu Recombineering egzersiz sağladı. Bir SPI stratejisi (Şekil 3A durdurma kodonu değiştirilmesi, düşük kopya p15A vektörüne Dnttip1 geninin son ekson kapsayan (ekzon 13) bir 12 kb bölüm alt klonlamak üzere ve aynı zamanda, ekson 13 içindeki çift afinite etiketi seçme kaseti yerleştirmek için tasarlanmıştır ). 2X BAYRAK-kalmodülin bağlayıcı protein (CBP) FRT-PGK-EM7-Neomisin (Neo) -BGhpA-FRT kaset (2.0 kb) 120 bp HA Dnttip1 kuşatan bulunan çift PTO modifiye oligolar kullanarak plazmid linearize bir RE büyütüldü bağlantılı kodon dur. Bir p15A Zeo Dnttip1 alt klonlama vektörü (1.7 kb), Dnttip1 dizinin uçlarında homolog 200 bp bölgesi alt-klonlanmıştır içermek üzere oluşturulmuştur. Dnttip1 alt klonlama plazmid doğrusallaştırılmış RE ve PCR 20 bp'lik modifiye oligolar kullanılarak amplifiyebir lider şerit korumalı vektörü oluşturulur. PCR ürünleri DpnI saflaştırılmış, muamele edilmiş ve Recombineering yetkili Dnttip1 BAC E. eş-elktroporatlandı E. coli hücrelerinin yanısıra indüklenmemiş kontrol hücrelerini göstermektedir. SPI reaksiyonları agar (Şekil 3B) içeren bir Zeosin (Zeo) ve kanamisin (Kan) ekildi. SPI analiz 12 yeniden bileşenler (Şekil 3C), tüm doğru modifiye Dnttip1 knock vektör üretilebilir. DNA dizileme oligo sentezi ya da PCR amplifikasyon kaynaklanan herhangi bir hata olmadığını doğrulandı.
SPI başka bir örneği P2rx1 geni de seçme kasetinin bağlantılı gelişmiş bir sarı floresan proteini (EYFP) olarak çerçeve içi yerleştirilmesini içeren. P2rx1 geni, bir G-proteinine bağlı reseptör kodlayan bir ATP-kapılı iyon kanalı 29 olarak işlev görmektedir. YFP floresan Bağlantı va da hücre yüzeyi üzerinde P2x1 reseptörünün izleme sağlarrious fonksiyonel testler. P2rx1 geleneksel Recombineering metodolojileri ile ilgili önemli sorunları sunmuştur başka zor odağı olan (veriler gösterilmemiştir). SPI terminal ekson kapsayan P2rx1 geni (ekson 12) 'in bir 12 kb kesimi kullanarak p15A Zeo vektörü içerisine alt klonlanmış ve oluşturmak için ekson 12, durdurma kodonu yerini alan bir EYFP -LoxP çevrili Yeni kasetin uyumlu yerleştirilmesi ile değiştirilmiş P2rx1-EYFP knock vektörü (Şekil 3D). Bu örnekte, kaplama şerit korumalı p15A vektörü (1.7 kb), 230 bp'lik bir HA içeren ve EYFP kaseti 50 bp HA içerir ve aynı zamanda, modifiye edilmemiş bırakıldı. EYFP ekleme kaseti (2.7 kb), ekleme örtüşme pEYFP-C1 amplifiye EYFP geninin PCR, PCR ve LoxP- PGK-EM7-neo-BGhpA-loxP kaset tarafından meydana getirildiği, PCR pL452 (NCI Frederick) amplifiye . SPI Reaksiyon koloniler yüzlerce üretti (veriler gösterilmemiştir). DNA analizi RE11 klondan hazırlanmıştır miniprepleri çoğunluğu doğru monte P2rx1-EYFP knock vektörü (Şekil 3E) ihtiva göstermiştir. DNA dizilimi tarafından ek doğrulama EYFP kasetinin hatasız yerleştirilmesini gösterdi. Ancak, klonların bazı tamir etiketsiz boşluğu ve aynı hücre (şerit 6-9) etiketlendi boşluk tamir plazmidlerden profilleri gösterdi. Birkaç örnekleri de hatalı bulunan boşluk tamir (şerit 2) veya yanlış yönlendirilmiştir plazmidler (kulvarlar 4 ve 5). Kısa HA kullanarak veya eğer uzun DNA parçalarının 30 Red Processivity üzerindeki kısıtlamaları kaynaklanan büyük kasetleri (> 3 kb), kullanırken eşzamanlı alt-klonlama ve bazı SPI rekombinantlar hedefleme başarısızlığı verimli SPI klonlama sınırlarını vurgular. Gerçekten de, 200 bp kadar EYFP kasetinin HA artan SPI verimlilik ve kaset doğru bir şekilde hedefleme (veriler gösterilmemiştir) artmıştır. JM8.N4 içinde EYFP çaldığımı vektör - P2rx1 ile gen hedeflemefare ES hücreleri (C57BL / 6 suşu) doğru hedeflenen P2rx1-EYFP dizisini (Şekil 3F) içerdiği 96 üzerinden 6 pozitif klonlar, oluşturulan.
BAC Muhabir Vektörler
Hedef genin bir BAC klonu genellikle tüm de UTRs gibi gerekli yukarı akış ve aşağı akış düzenleyici elemanları, örneğin arttırıcılar, doğal seviyelerde, 31 gen sentezlenmesini tahrik etmek için, endojen promotör içerir. KAK raportör vektörü, bu nedenle, bir gen 32 endojen sentezleme modelini özetlemek için tercih edilen bir araçtır. Bununla birlikte, (200 kb'ye kadar) BAC plazmid büyüklüğü hücreleri 33 içine sağlam bir BAC transfekte olan önemli bir pratik sorunlar yaratır. Bir genin gerekli düzenleme öğeleri koruyarak BAC 34,35 kesme yoluyla BAC genomik insertin boyutu azaltılması, daha verimli bir transfecti olarak BAC ve sonuçların daha kolay kullanım sağlayanüzerine. Güncel BAC mühendisliği teknolojisi bu hedefe ulaşmak için 35 Recombineering birden mermi içerir. (Şekil BAC bir pBeloBAC11 BAC vektörü P2rx1 geninde bir EYFP kasetinin aynı anda yerleştirilmesi ile birlikte 168 kb P2rx1 BAC tam uzunlukta P2rx1 gen dahil olmak üzere, 30 kb genomik sekans alt klonlamak üzere kullanılan kırpma SPI yararlılığını göstermek için, 4A). 180 bp'lik bir HA içeren pBeloBAC11 Zeo vektör omurgası (6.5 kb), PCR, geri kalmış şerit korumalı vektör üretilen tadil edilmiş oligo ile büyütülmüştür. Önceki P2rx1 çaldığımı vektör yapımında kullanılan aynı EYFP Neo kaseti (3 kb), PCR 180 bp HA içeren gecikmeli iplikçik korumalı oligolar kullanılarak amplifiye ve stop kodonu değiştirilmesi P2rx1 ekson 12 hedefli idi. Birleştirilen EYFP kasetinin elektroporasyonu ve P2rx1 BAC hücreleri İfade içine pBeloBAC11 Zeo vektör aşağıdakıgbaA Recombineering proteinleri essing, kültür BAC plazmidler ayırmak için 37 ° C'de 3 saat süre ile, 10 ml LB pH 8 elde edildi. Saf rekombinantlar agar plakaları Zeo ve Kan üzerinde seçilmiştir ve 2 x 10 -6 frekansında gözlenmiştir. Koloni PCR genotipleme analizi analiz edildi 3 6 dışarı klonlar (Şekil 4B) kırparak başarılı BAC saptandı. EYFP ekleme site genelinde uzun menzilli PCR amplifikasyonu üç pozitif klonlar (Şekil 4B) doğru kaset birleşmesini doğruladı. BAC sonunda 'bu klonlar içinde EYFP kasetinin mistargeting nedeni 5 doğru kapanması ayrı olabilir ama, sonunda' EYFP ekleme eksik üç klon da 5 tamir yanlış boşluk vardı. Üç EYFP pozitif BAC klonları daha RE sindirmelerinde ile analiz ve doğru kesilmiş EYFP rekombinant BAC (Şekil 4C <beklenen desen gösterdi/ Strong>). Dizi analizi 3 pozitif tek çıkış 1 klon EYFP kasetinin hatalardan olmadığını ortaya koymuştur.
Koşullu Nakavt (cko) Vektörler
Gen ifadesinin Şartlı ablasyon gelişimsel süreçleri araştırmak veya belirli bir zaman noktasında biyolojik sistemlerin çalışma önemli bir araçtır. Bir koşullu gen nakavt stratejisi genellikle kritik ekson (CE), Çevre LoxP rekombinasyon siteleri yerleşimini içerir. Cre ifade veya aktivasyon üzerine CE silinmesi nedeniyle saçma aracılı çürüme (UFS) mRNA bozulması ile sonuçlanan bir çerçeve kayması ve bir erken durdurma kodonu, üretir. Bir koşullu gen hedefleme vektörünün yapımı, karmaşık bir iştir ve çeşitli alt-klonlama aşamaları, hedef ve dönüşümü 22 içerir. SPI bu süreci kolaylaştırmak için uygun bir yol sunar. Bir test case olarak, Zrsr2 geninin bir koşullu alel inşa edildiSPI metodoloji (Şekil 5A) ile. Zrsr2 geni, bir raptetme faktörünü kodlayan ve bir tek X kromozomu üzerinde yer almaktadır. gen silinmesi koşullu durum teşkil eden bir gen silinmesi hedefleme stratejisinin ES hücresi seçimi sırasında Zrsr2 eksikliği adapte hücrelerin olasılığı kontrol etmek için, bu durumda özellikle önemlidir. SPI iki farklı LoxP çevrili seçme kasetleri aynı anda yerleştirilmesi ile ZrSr2 geninin bir 10 kb kısmı alt klonlamak üzere gerçekleştirilmiştir. FRT-PGK-EM7-Neo-FRT-LoxP kaset (2 kb) PCR RE amplifiye edildi 180 bp HA 2. intron Rox-PGK-em7- içeren ikinci bir kaset ZrSr2 hedef alan iplik korumalı oligolar kalmış kullanarak pL451 sindirilmiş Blasticidin (Bsd) -Rox-LoxP (2 kb) PCR intron 3. bir alt bölgeye aynı çevrili iki LoxP siteleri 180 bp HA içeren gecikmeli iplikçik korumalı oligolar ekson 3 d CE ile R6K plazmid amplifiye edildiBir çerçeve kayması koşullu Cre aktivasyon sonuçları üzerine eletion ve bir erken durdurma kodonu tanıttı. Zrsr2 alt klonlama plazmid (1.6 kb), PCR ile 10 kb Zrsr2 dizisinin uçları doğrultusunda 180 bp'lik HA ihtiva eden şerit korumalı oligolar kalmış kullanılarak RE lineer p15A Zeo plazmidden büyütüldü. Zeo + Neo + BSD plakalar daha önce açıklanan ve kaplama gibi SPI reaksiyonlar yapıldı. ZrSr2 koşullu hedefleme vektörü başarıyla incelenmiş 12 yeniden bileşenler (Şekil 5B) en toplandı. Daha fazla DNA sekans analizi ZrSr2 cko vektöründe seçim belirteçlerinin her ikisi de doğru takılmasını göstermektedir.
Şekil 1. SPI klonlama. Tek bir adımda kaset ekleme ve subklonlama birleştirerek SPI klonlama işlemine genel bakış. (A) BAC klonu tranpSC101 BADgbaA plasmidi ile sformed ve 30 ° C'de büyütülür. Kırmızı proteinleri ifade etmek arabinoz indüksiyon sonrasında (B), asimetrik modifiye ekleme kaset ve alt klonlama plazmid BAC klonu sokulan ve son vektörü oluşturmak için ekleme ve alt klonlama belirteçleri hem de seçilir. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.
Şekil 2 şematik SPI Recombineering oligo tasarımını örnekleyen. Alt klonlama plazmid ve ekleme kaset iki terminal PTO ve fosfat modifiye oligolar bir kombinasyonu kullanılarak PCR ile üretilmiştir. In vivo Kırmızı sindirim üzerine PCR fragmanı, replikasyon çatalının gecikmeli sarmalına yumuşayan hangi bir ssDNA ara üretir. Gengösterildiği gibi 50-180 bp e özgü HA her oligodan içine dahil edilir. ok aday gen üzerinde DNA replikasyonu yönünü gösterir. Kesikli çizgi, PCR ürün içine dahil olmayan alt-klonlama plazmid dizisini göstermektedir. RE sitesi, son vektör lineerleştirmede kısıtlayıcı enzim sitesi; K, alt-klonlama plazmid veya ekleme kasetine özgü ileri dizisi (20 bp); R, plazmid veya kaset ters tamamlayıcı dizisi (20 bp); sm, seçim işaretleyici. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. SPI zor knock vektörlerinin yapımı sağlar. Dnttip1 Dual yapımında kullanılan SPI stratejisi (A) şematik vektörü etiketli. Indi OkBAC klonu üzerinde çoğaltma yönünü cates. Dnttip1 SPI deney, uyarılmamış ve uyarılmış örnekleri (B) Kaplama neden olur. Dnttip1 SPI klonlarının (C), EcoRI ile sindirilmiş. M, 1 kb merdiveni (NEB); C p15A Dnttip1 boşluk plazmid çift etiket kaseti eksik onarıldı. Fragman boyutları şunlardır: etiketli, 9.2 + 4.4 + 2.2 kb; Kontrol; 9.2 + 4.6 kb olacaktır. P2rx1-EYFP SPI klonlarının (D) SPI göre P2rx1-EYFP knock vektör oluşturulması. (E) EcoRI ile sindirilmiş. M, 1 kb + merdiven (Invitrogen); C p15A P2rx1 boşluk plazmid EYFP kaseti eksik onarıldı. Fragman boyutları şunlardır: etiketli, 8.3 + 4.4 + 3.1 + 0.03 kb; Kontrol; 8.3 ± 3.1 + 1.8 ± 0.03 kb (F) P2rx1 Southern blot analizi -. JM8.N4 ES hücre hücrelerinde hedef EYFP gen. Üst panel, PshAI özet kullanarak 3 'ucu Sondası ile Southern-Blot. Gösterildiği 5 klonun taranması sonucudur. Alt paneli, Güney kullanarak lekeSon tarama 5 '3 den belirlenen pozitif uç prob ve Spel sindirimi'. PshAI RE sitesi; S Spel RE sitesi. Kesikli çizgi vektör HA sonunu temsil eder. Kara kutu güney prob gösterir. Beklenen kısıtlama fragmanları, PshAI şunlardır:; EYFP-neo, 11.5 kb WT, 8.9 kb; Spel:. WT, 6.9 kb, EYFP-neo, 7.6 kb bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 4. Basitleştirilmiş BAC SPI kullanarak süsleme BAC kavramını gösteren SPI. (A) şematik kullanarak kırpma. Semboller anahtarı Şekil 1 'de tarif edilmiştir. 5' ve 3 'arasında (B), PCR amplifikasyonu, alt klonlanmış ekin sona erer ve P2rx1-EYFP yapışma yeri boyuncan sitesi. tarama stratejisi PCR her türü için gösterilmiştir. M (üst panel), Hyperladder 25 bp (alt paneller), 1kb +; P P2rx1 BAC; . S pBeloBAC11 Zeo alt klonlama plazmid (C), (B) üç EYFP pozitif SPI BAC klonlarının sindirimi Hindlll; E, kesilmiş EYFP BAC Hind kısıtlama desen beklenen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SPI klonlama Şekil 5. Koşullu nakavt vektör üretimi. Zrsr2 alel alt-klonlama sırasında iki farklı LoxP çevrili seçme kasetleri aynı anda yerleştirilmesi (A) şematik. Semboller anahtarı Şekil 1 'de tarif edilmektedir. (B)' </ Zrsr2 SPI klonlarının strong> EcoRI çözünüklerinin. L, 1 kb merdiveni (NEB); C1 p15A ZrSr2 boşluk tamir plazmid, C2, p15A ZrSr2 boşluk plazmid yeni ekleme içeren tamir; C3, p15A ZrSr2 boşluk bsd parçasını içeren plazmid onarıldı. Fragman boyutları şunlardır: cko, 7.7 + 2.9 + 2.6 + 1.6 kb; C1, 7.7 + 4.0 kb; C2, 7.7 + 4.3 + 1.6 kb'lik; C3, 7,7 + 2,9 + 2.3 kb. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Adımların Resim | Geleneksel Recombineering boru hattı | Multiplex Recombineering b |
| Aşama 1 | BAC konakçıya Recombineering plazmid transformasyonu | BAC konakçıya Recombineering plazmid transformasyonu. Kasetleri hedefleme ve alt klonlama vektörlerinin hazırlanması. |
| Adım2 | R1 / R2 Ağ Geçidi kasetinin yerleştirilmesi | Multiplex boşluk onarım klonlama |
| Aşama 3 | Floxed Kan kasetinin yerleştirilmesi | Tek kolonilerden O / N kültürü |
| Aşama 4 | R3 / R4 plazmid içine boşluk onarım | Plazmid hazırlık ve doğrulama |
| Aşama 5 | Cre + E. içine Dönüşüm coli | |
| Aşama 6 | Plazmid hazırlık ve doğrulama | |
| Aşama 7 | O / N üç-yollu Geçidi reaksiyonu | |
| Aşama 8 | DH10B E. içine üç-yollu Geçidi reaksiyon Dönüşüm coli hücreleri | |
| Aşama 9 | Tek kolonilerden gecede kültür | |
| Aşama 10 | Plazmid hazırlık ve dizi doğrulama | |
| doğrulanmış klon 4 gün b ortalama süre | ||
Tablo 1: Koşullu nakavt vektörlerin yapımında SPI ile geleneksel recombineering karşılaştırılması.
| RE tampon | 5 ul |
| DNA | 1 ug plazmid ya da saflaştırılmış PCR ürünleri, |
| RE | 1 ul (5 tane ya da daha fazla) |
| TE | kadar 50 ul |
| En az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Üreticinin talimatlarına göre inacitvate Isı | |
Tablo 2: sindirmek RE.
| PCR malzemeleri | Nihai konsantrasyon |
| PCR tamponu | 1x |
| dNTP | 200 nM |
| MgSO 4 | 1.5 mM |
| Betain | 1.3 M |
| DMSO | % 1 |
| İleri astar | 200 nM |
| Ters astar | 200 nM |
| DNA polimeraz | 1 u |
| Şablon | Çok kopyalı plasmidlerin 10 ng veya genotipleme PCR'ler için miniprep DNA 2.5 ul |
| Su | kadar 50 ul |
| Çok kopyalı plazmid ile standart 50 ul PCR reaksiyonu için bir. Uzun menzilli genotipleme PCR'ler 25 ul PCR reaksiyonlarında kuruldu. | |
| PCR koşulları, | |
| 95 ° C | 2 dakika |
| 92 ° C | 10 sn |
| 55 ° C | 30 sn |
| 72 ° C | 30 sn |
| 30 döngü b | |
| b Döngüsü hiçbir BAC PCR genotipleme için 35 uzatılabilir | |
Tablo 3: PCR Set-up ve Koşullar.
| Antibiyotikler | Konsantrasyonun ardından, (ug mi-1) |
| Ampicllin | 50 |
| Blasticidin b | 40 |
| Kloramfenikol | 12.5 |
| Gentamisin | 2 |
| Higromisin c | 30 |
| Kanamisin b | 15 |
| Tetrasiklin | 4 |
| Trimetoprim c | 10 |
| Zeocin | 5 |
| Multipleks recombineering olarak kombinasyonlarda kullanıldığında BACler ve multikopya plazmidlerle kullanılması önerilmektedir | |
| b Blastisidin (35 ug mi-1) ve kanamisin (6 ug mi-1) kombinasyon halinde birlikte kullanıldıklarında | |
| c Higramisin ve Trimetoprim tek kopya BACler ile seçimi için tavsiye edilmez. | |
SPI deneylerinde kullanılmak üzere Tablo 4. Tavsiye edilen antibiyotik konsantrasyonları.
Discussion
ES hücre hatları ve fare modellerinin yapımı tarihsel değiştirilmiş alel 4 içerdiği plazmid yapıları kullanarak hedef geni dahil etmiştir. Bununla birlikte, bu karmaşık gen hedefleme vektörlerinin yapılışı bu modellerin zamanında üretiminde önemli bir engel olduğu kanıtlanmıştır. Recombineering tabanlı vektör inşaat stratejilerinin geliştirilmesi gelişmiş vektör tasarımları ve daha verimli vektör düzeneğini sağladı. Bununla birlikte, mevcut Recombineering protokolleri hala çok adımları içerir ara plazmid saflaştırmayı gerektirir ve farklı bakteriyel soyları kullanılır. Artı sokulmasını alt-klonlanması yerleşik BAC konakçı suşu bir elektroporasyon durumunda gerçekleştirilebilir vektör yapımı için yeni bir yaklaşım sağlar. Gen hedefleme SPI yarar vektör inşaat çeşitli uygulamalar burada test edilmiştir. Burada incelenen tüm durumlarda, SPI etkili olduğu ve doğru rekombinant plazmidi üretilmiştir.Olguların çoğunluğunda, çok sayıda farklı kasetleri doğru hedefleme vektörüne sokulmuştur. Büyük DNA kasetleri ve vektörleri kolayca SPI protokolü ağırladı ve bu sistemin esnekliği saptandı.
SPI uzun homoloji dizileri ve lineer DNA kasetlerinin fosforotioat (PTO) koruma kullanımına dayanır. PTO değişiklik lineer DNA 20,21 ile egzonükleazlardan karşı koruma sağladığını ve uzun HA çoğullamayı izin rekombinasyon verimliliğini artırır. Ancak, uzun oligo dizilerinin sentezi hataları özellikle silmeler biriken şansını artırır. Ancak, protein kodlama bölgelerini kapsar halinde oligo mutasyonlar, özellikle zararlı olabilir. DNA, HA boyunca sıralama ve eklenen kasetin tam uzunlukta kapsayan yüksek bir sekansı değiştirmelerine sahip klonların elimine edilmesi tavsiye edilir. Yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı sisteminin kullanılması da oluşumundan önerilmektediry PCR hataları. alt-klonlama plazmid HA uzunluğu bileşimi ekleme kasetinin bu göre daha kritiktir (veriler gösterilmemiştir). Ekson bölgesinde bir mutasyon tolere edilmez knock vektörleri yapımı gibi özellikle hassas uygulamaları için, ekleme kasetinin HA uzun oligo ile ilgili problemleri önlemek için (50-120 bp), kısaltılabilir. Ekleme kaset de (replikasyon yönünde bilgi mevcut değildir) değiştirilmemiş veya çift phosphorothioated bırakılabilir. Ancak bu durumda çoklayıcı hala uzun HA alt klonlama plasmidlerini korumalı gerektirir. Bu özel stratejinin bir uyarı potansiyel farklı noktalarda SPI klonlama etkileyebilir çoğullama verimlilik düşürücü olduğunu.
Ekleme kaseti ve alt klonlama plazmid uzunluğu SPI klonlama başka önemli parametredir. Büyük DNA molekülleri daha az verimli electroporate ve efekt yeniden verilen, birikimliaynı hücrede her kasetleri tanıtmak için gereksinimi (veriler gösterilmemiştir). Çoğullama küçük ekleme kasetleri ile en verimli. DNA, daha büyük 3 kb de 3 kb 30 kadar en verimli Kırmızı aracılı ssDNA işleme bir sınır, yer parçalanır. 3 kb aşan Yerleştirme kasetleri rezeke ikili ve beta bağımsız yolunun 20 üzerinden az verimli recombine. Bu nedenle, doğru klon tanımlamak için yeterli kolonilerin taranmasının, bu durumlarda önemli hale gelmektedir. Rekombinasyon sonrası elektroporasyon daha uzun bir süre de zor SPI egzersizleri doğru klon kurtarma şansını artırır. Dört küçük kasetler (<1.5 kb), çoklayıcı etkinliği her bir ek kaseti ile azalır olsa da, SPI işlemi ile eş zamanlı olarak eklenebilir kadar (veriler gösterilmemiştir). Ancak, bu optimal SPI deney sonucunu yansıtmaktadır ve birçok büyük kasetleri kullanırken çoğullama sınırlarını dikkate önerilir. kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar gibi genom düzenleme araçları geliştirilmesi (CRISPR) -cas9 endonükleaz sistemi yeni genom değişikliklerinin oluşturulmasını sağladı ve daha verimli genom mühendisliği 36 yol açmıştır. Ancak, bu yeni teknolojiler gen hedefleme vektörleri tamamlanmaktadır yerine onları supplanted var. Bu CRISPR-cas sistemi antibiyotik seçimi yerini ve daha multipleks Recombineering protokolü rafine ki öngörülmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
| Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
| C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
| KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
| L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
| Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
| QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
| Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |
References
- Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
- Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
- Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
- Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
- Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
- Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
- Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
- Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
- Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
- Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
- Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
- Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
- Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).
- Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
- Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
- Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).
- Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
- Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
- Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
- Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
- Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
- Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).
- Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
- Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).
