Introduction
Udviklingen af gen-targeting teknologier har muliggjort konstruktionen af cellelinjer og musemodeller at undersøge forskellige biologiske systemer 1-3. En vigtig første etape i ændringen af en genomisk sekvens er design og konstruktion af et gen targeting vektor 4. Targeting vektorer er plasmidkonstruktioner der bærer allel af interesse, der indeholder de ønskede ændringer (s) flankeret af en selektionsmarkør (fx neomycin), og lange genomiske regioner nødvendige for effektiv homolog rekombination i pattedyrceller 5. Præcis genetiske modifikation opnås ved indførelse af targeting vektoren ind i embryonale stamceller (ES-celler) 6 eller somatiske celler 7, hvorved homolog rekombination mellem identiske strækninger af DNA-sekvens på targeting vektoren og genomiske locus resulterer i overførsel af den tilsigtede ændring til genomet ved genomdannelse 8. Sådanne modified ES-celler kan injiceres i museblastocyster at producere afkom (kimærer), som så kan overføre disse modificerede alleler via kimcellelinje 9. En alternativ vej til at producere transgene mus involverer mikroinjektion af en genekspressionsvektor i encellede mus zygoter, der fører til tilfældig integration af vektoren i musegenomet 10. Traditionelle metoder til vektor konstruktion har påberåbt sig konventionelle "klippe og klistre" kloning ved hjælp af restriktionsenzymer og DNA-ligaser at klone de forskellige valg markør og genomiske fragmenter i en vektor rygrad. Imidlertid en iboende begrænsende faktor af traditionel kloning er positioneringen og valget af restriktionssteder, især med længere DNA-sekvenser. Dette nødvendiggør ofte flere subkloningstrin og også indfører fremmede DNA-sekvenser i vektoren, hvilket ofte fører til en lavere effektivitet af gen-targeting.
Recombineering (rekombinogen engineering) er en DNA-teknik teknologi, der overvinder disse begrænsninger ved hjælp af homolog rekombination (HR) medieret ved fag rekombinationsproteiner i E. coli-celler 11,12. Eftersom enhver region af en homolog sekvens kan tjene som et substrat for recombineering er de begrænsninger, tilgængeligheden af restriktionssteder fjernet. Store DNA-sekvenser kan problemfrit ændres direkte in vivo, således også bevare deres strukturelle integritet 13. Recombineering er meget effektiv med korte homologier (50 bp) 14 og derfor homologiarme (HA) kan nemt inkorporeres i syntetiske oligo-sekvenser. I et typisk recombineering eksperiment, et oligo- eller et dobbeltstrenget DNA (dsDNA) fragment indeholdende HA elektroporeret ind recombineering kompetente E. coli-celler indeholdende målet placeret enten på kromosomet eller på et plasmid 15. Den rekombination potentiale tillægges ved inducerbar ekspression af den røde recombination proteiner af fagen 16,17 eller RecET proteiner af rac profag 18. The Red / RecE exonuclease konverterer lineære dsDNA til en enkeltstrenget DNA (ssDNA) mellemprodukt, som derefter bundet af sin partner, rød / RecT, en enkeltstrenget annealing protein (SSAP) 19. Indtræder annealing af en lang ssDNA eller en kort oligo til dens komplementære målsekvens på tilbagestående streng af replikationsgaflen og fører til inkorporering af sekvensen ved målstedet. Halter streng ssDNA rekombination er grundlaget for den høje effektivitet af recombineering og kan beskrives ved den "beta" rekombination model 20,21.
En typisk recombineering arbejdsgang at opbygge en målrettet gen vektor omfatter en af de to følgende ruter. En rute involverer subkloning den ønskede genomiske region fra en mus BAC klon i et plasmid efterfulgt af sekventiel insertion af LoxP rekombinationssteder, en selektionsmarkør
Protocol
1. Gene Targeting Design
- Bestil en passende BAC klon, der dækker den genomiske region af interesse. Sikre, at dette er isogene med den type af ES-celler, der skal ændres f.eks RPCI-23 og RPCI-24 BAC kloner for gen-targeting med C57BL / 6 ES-celler.
- Anvend konventionel gen målretningskriterier ved udformningen af targeting vektor. Væsentlige parametre er, om ændringen er nødvendig for at være konstitutiv eller betinget, definition af kritiske exons (CE) til sletning i et gen knockout strategi og afstand og placering af introniske kassetter.
BEMÆRK: Hver af disse er blevet diskuteret i detaljer andetsteds 10. - Vælg genomiske regioner hver af 5-6 kb, der flankerer mål modifikation site.
BEMÆRK: Størrelsen af subklonede insert er derfor typisk 10-12 kb, selvom den øvre grænse kan være så høj som 80 kb med en lav kopi subkloning plasmid som p15A, pBR322 etc. og op til 200 kb med et BACvektor.
2. Multiplex Recombineering oliqoer
- Design oligoer til plasmidskelettet (subkloning plasmid) og den selekterbare markør (indsættelse kassette). Design hver oligo, således at det indeholder 180 bp HA flankerer det genomiske målsted og 20 bp af specifik priming sekvens af insertionen kassette eller subkloning plasmidet (figur 2).
BEMÆRK: homologiarmene må ikke indeholde repetitive elementer, vil tilstedeværelsen af repetitive elementer resultere i ukorrekt målretning og subkloning. Gentagne elementer kan påvises ved hjælp af web-baserede værktøjer som '' Repeat Masker ''. - Omfatter et unikt restriktionsenzym (RE) site på en af vektor oligoer at linearisere genmålretningsvektor for ES-celle målretning (figur 2).
- Kontroller oligo parametre ved hjælp af en oligo analysator program. Sørg for at undgå sekundære strukturer i priming regions.
- Kortere HA (50 bp) af indsættelsen kassetten tolereres og giver lavere antal rekombinanter men sikre, at subkloningen plasmidet HA er altid længere (180 bp).
- Bestem orienteringen af det genomiske DNA insert af den særlige BAC klon ved hjælp af web-baserede værktøjer som '' cloneDB ''. Etablering retning af replikation fra oris ved at kontrollere kort over BAC plasmidskelet anvendes i BAC bibliotek konstruktion.
BEMÆRK: Oris er normalt modsat transkriptionel retning chloramphenicol (Chl) markør for alle almindeligt anvendte BAC plasmider. - Tilføj to terminale phosphorothioat (PTO) bindinger til 5'-enden af det oligo, der er modsat til retningen af replikation på BAC-klonen. Tilføj en 5'-phosphat ændring reverse oligo (figur 2).
BEMÆRK: Den asymmetriske phosphorothioated PCR kassette på Red fordøjelse genererer et ssDNA mellemprodukt, kan prime halter strengreplikationsgaflen.
BEMÆRK: Maksimal multiplex rekombinationsfrekvens observeres med de tilbagestående streng beskyttede kassetter. Førende streng beskyttet eller dobbelt beskyttede kassetter kan ikke producere tilsvarende rekombinations effektivitetsgevinster på nogle loci. - Bestil oligos med SIDE eller HPLC-oprensning.
3. BAC klon Transformation med pSC101 BADgbaA Recombineering plasmid.
- For at gøre det E. coli-stamme bærer BAC recombineering dygtige, omdanne det med pSC101 BADgbaA plasmid, der indeholder de røde gener 16.
BEMÆRK: pSC101 BADgbaA plasmid indeholder de røde og RecA-gener under kontrol af arabinose inducerbar araC-P BAD promotor, en tetracyklin selektionsmarkør og temperaturfølsomt pSC101-replikon.- Stikke en steril pipettespids i BAC agar kultur og pode 5,0 ml lysogeni bouillon (LB) pH 8,0 indeholdende 12,556 g ml -1 Chl. Vokse ved 37 ° C i 5 timer under omrystning ved 200 rpm.
- Chill 10% (v / v) glycerolopløsning, mikrocentrifugerør og elektroporation kuvetter på is. Afkøl en nedkølet stor centrifuge og mikrocentrifuge til 4 ° C.
- Bestem den optiske densitet (OD) for kulturen ved hjælp af et spektrofotometer og måle absorbansen ved 600 nm. Forbered elektrokompetente celler (som beskrevet nedenfor), når en OD600 aflæsning på 0,3 til 0,8 nået.
- Spin down celler i et 50 ml centrifugerør i et stort centrifuge ved 1.216 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Vask cellerne med 1 ml afkølet 10% glycerol og spin ned celler ved 17.949 xg i 20 sekunder ved 4 ° C. Udfør vasketrinnet i alt 3 gange.
- Resuspender cellerne i et totalt volumen på 50 pi af 10% glycerol og tilsættes 10-200 ng af pSC101 BADgbaA recombineering plasmid. Opnå en enkelt cellesuspension ved pipetteringop og ned flere gange, og derefter overføre cellerne til en præ-afkølet 1 mm hul elektroporation cuvette.
- Elektroporere cellerne med en indstilling på 1,8 kV, 25 uF og 200 Ω.
BEMÆRK: Kontroller de korrekte indstillinger for hvert mærke af elektroporator. En tidskonstant på elektroporering mindre end 4 indikerer tilstedeværelsen af salt og andre urenheder. - Umiddelbart inddrive cellerne i 1 ml LB og overføre cellerne til et 50 ml centrifugerør.
- Grow BAC gbaA kultur ved 30 ° C i 2 timer under omrystning ved 200 rpm.
BEMÆRK: pSC101 BADgbaA plasmid går tabt, når cellerne dyrkes ved 37 ° C på grund af inaktivering af temperaturfølsomt repE replikation faktor. Grow gbaA celler ved 30 ° C for at opretholde recombineering funktioner. - Tilføj 9 ml LB indeholdende 12,5 ug ml -1 Chl- og 4 ug ml -1 tetracyclin (Tet) til den genvundne BAC gbaA kultur. GrowBAC gbaA kultur O / N ved 30 ° C under omrystning ved 200 rpm.
BEMÆRK: transformationseffektivitet af elektroporering det supersnoede gbaA plasmid er tilstrækkelig høj til at tillade mætning vækst O / N i flydende medier.
4. Fremstilling af Indsættelse Kassetter og Subkloning plasmider
- At indarbejde HA i indsættelsen kassette (r) og subkloning plasmid udføre polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af den lange modificerede oligoer som beskrevet nedenfor.
- Valgfrit: at forhindre plasmid overførsel i recombineering reaktion, skal du bruge en R6K oprindelse eller lignende smal værtsområde plasmidtemplate at forstærke indsættelsen kassette.
- Alternativt linearisere plasmidet skabelon ved hjælp af en RE Digest (tabel 2). Vælg en RE, der skærer uden for PCR-opformering regionen og er varme inaktiveret. Varmeinaktiveres RE som anbefalet af manufacturer.
- Opsætning polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af en high-fidelity Hotstart DNA polymerase system. Forbered en PCR mester mix som beskrevet (tabel 3). Udfør termisk cykling som vist (tabel 3).
- Analyser af PCR-produkter efter agarosegelelektroforese. Load 1-5 pi af hver PCR på en 1% (w / v) agarosegel indeholdende 0,5 mg ml -1 ethidiumbromid (EtBr).
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af ikke-specifikke amplifikationsprodukter interfererer ikke i recombineering reaktion. I nogle tilfælde kan dog primerdimerer falde recombineering effektivitet. - Oprens PCR-produkter under anvendelse af en PCR-oprensningskit.
- Valgfrit: Fjern plasmidet skabelon fra PCR'er ved behandling med Dpnl efterfulgt af PCR oprydning. Elute DNA i et minimalt volumen af sterilt deioniseret vand (som anbefalet af producenten).
BEMÆRK: Tilsætning af Dpnl til urensede PCR-reaktioner resulterer i reduceret effektivitet af spaltning af the methyleret plasmid-DNA template.
- Valgfrit: Fjern plasmidet skabelon fra PCR'er ved behandling med Dpnl efterfulgt af PCR oprydning. Elute DNA i et minimalt volumen af sterilt deioniseret vand (som anbefalet af producenten).
- Kvantificer PCR-amplificeret DNA ved agarosegel-analyse mod en kendt sæt af DNA-standarder f.eks, λ Hindlll digest eller ved hjælp af en NanoDrop spektrofotometer.
5. Subkloning Plus Indsættelse
- Fortynd O / N BAC gbaA kultur 50 gange ved tilsætning af 200 pi i 10 ml LB + Chl + Tet. Grow 30 ° C under omrystning ved 200 rpm i 1 time 50 min. Omfatter en prøve, der skal anvendes som negativ kontrol.
- Chill alle recombineering materialer og udstyr til 4 ° C som beskrevet i trin 3.1.2.
- Hæld LB agar pH 8 plader indeholdende korrekt koncentration af passende selektive antibiotika (r), der vil tillade selektion af DNA-fragmentet, der er indsat, samt til udvælgelse af subkloningsvektoren (tabel 4).
BEMÆRK: Nogle antibiotika er pH-følsomme. Brug LBagar pH 8 som regel. - Der fremstilles en 10% (w / v) opløsning af L-arabinose. Filtersteriliser gennem en 0,2 um sprøjtefilter.
BEMÆRK: Arabinose inducerer ekspressionen af recombineering proteiner fra gbaA plasmidet. - Tjek OD af BAC gbaA kultur ved hjælp af et spektrofotometer. Når en OD600 på 0,25-0,3 er nået, inducere recombineering proteiner som beskrevet i det følgende trin.
- Tilsæt 200 pi af arabinoseopløsning 10% til 10 ml af BAC kultur for at opnå en slutkoncentration på Arabinose på 0,2%. Omfatter en induceret kultur (uden Arabinose), der skal anvendes som negativ kontrol.
- Overfør BAC kultur til et 37 ° C rysteinkubator og inducere Red ekspression i 45 minutter under omrystning ved 230 rpm.
BEMÆRK: Expression of Red proteiner er ineffektiv ved 30 ° C. - Spin down celler og vask med 10% glycerol 3 gange som beskrevet i trin 3.1.5.
- Tilføj 600-1,000 ng hver af subkloning plasmid og indsættelse kassette (r) til recombineering reaktionen. Kun indeholder en vektor og vektor plus enkelt insert kontrol for at kontrollere rekombination duelighed og integriteten af vektor og kassetterne.
- Opnå en enkelt cellesuspension ved at pipettere op og ned. Udfør elektroporering som beskrevet i trin 3.1.7 og efterfølgende genvinding i 1 ml LB ved 37 ° C i 1 time for multi-kopi plasmider eller i 10 ml LB ved 37 ° C i 3 timer for BAC vektorer.
- Plate forskellige fortyndinger af den udvundne kultur f.eks, 90%, 10%, 1% på de dobbelte udvælgelse agarplader og vokse ved 37 ° C i 16 timer.
6. Analyse af rekombinanter
- Valgfrit: Vælg 6 til 12 kolonier og udfører koloni PCR med en HA flankerende primer og en indsats specifik primer. Inklusive subkloning plasmid og indsættelse cassette plasmid samt moder- BAC klon som negative kontroller.
- Udfør agarosegelanalyse af kolonien PCRs. Identificer positive kloner ved tilstedeværelsen af et lyst bånd ved den forventede størrelse.
BEMÆRK: Den høje effektivitet SPI kloning processen genererer det meste korrekte rekombinanter.
- Udfør agarosegelanalyse af kolonien PCRs. Identificer positive kloner ved tilstedeværelsen af et lyst bånd ved den forventede størrelse.
- Pick kolonier i 5 ml LB pH 8 indeholdende det selektive antibiotikum og vokse O / N ved 37 ° C.
- Forbered DNA minipreps anvendelse af en søjle oprensning kit i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Forbered BAC miniprep DNA under anvendelse af standard phenol-chloroform isolation eller en lignende protokol.
- Udfør VE fordøjelser på miniprep DNA. Separat DNA ved agarosegelelektroforese. Analyser VE mønstre til at identificere de kloner, der indeholder de forventede fragmenter størrelser af den korrekte targeting vektor. Vælg en RE, der klart skelner mellem vektoren mangler indsatsen (r), og vektoren indeholdende insert (s).
- Optioudg: at opnå celler, der er blottet for BAC, som stadig er til stede i E. coli efter recombineering bruge miniprep plasmid-DNA til at transformere DH5alpha eller DH10B E. coli-celler.
- Udfør DNA-sekventering over HA og indsættelse kassette til at kontrollere oligo syntese fejl.
Representative Results
Knockin Vektorer
Knockin targeting vektorer afspejle behovet for at indføre et hidtil ukendt sekvens funktion i genomet, herunder enkelt basepar substitution i et protein-kodende region, fusion af en fluorescerende markør eller et affinitetsmærke til et protein eller integrationen af et genekspressionskassette. For at teste anvendelsen af SPI i Knockin vektor byggeri strategier blev to forskellige testcases undersøgt. Dnttip1 koder deoxynucleotidyltransferase, terminal, interagerende protein 1A (TDIF1), der sammen med klasse I histondeacetylase (HDAC) danner et mitotisk deacetylase kompleks (Midac) 28. For at undersøge den rolle, Dnttip1 i celledeling blev en tandem-affinitet tagging tilgang at isolere TDIF1 interagerende proteiner. Tidligere forsøg på at subklone en portion af Dnttip1 genet ved hjælp af en p15A vektor indeholdende lange homologiregioner resulterede i lav hul reparation effektivitet ennd hyppige afvigende rekombinationsprodukter (data ikke vist). Således opførelse af et Knockin vektor på Dnttip1 locus forudsat en udfordrende recombineering øvelse. En SPI strategi blev designet til at subklone et 12 kb del af Dnttip1 genet spænder over sidste exon (exon 13) i en lav kopi p15A vektor og til samtidigt at indsætte et dobbelt affinitetsmærke selektionskassette i exon 13, som erstatter stopkodonen (figur 3A ). Den 2X FLAG-calmodulin-bindende protein (CBP) bundet FRT-PGK-EM7-neomycin (Neo) -BGhpA-FRT kassette (2,0 kb) blev amplificeret fra en RE lineariseret plasmid hjælp dobbelt PTO modificerede oligoer, der indeholdt 120 bp HA flankerer Dnttip1 stopkodon. En p15A zeo Dnttip1 subkloningsvektor (1,7 kb) blev konstrueret, som indeholdt 200 bp-regioner er homologe til enderne af Dnttip1 sekvens, subklones. Den Dnttip1 subkloning plasmid blev RE lineariseret og PCR-amplificeret under anvendelse af 20 bp modificerede oligoerder genererede en ledende streng beskyttet vektor. PCR-produkterne blev Dpnl behandlet, renset og co-elektroporeret ind recombineering kompetente Dnttip1 BAC E. coli-celler samt ikke-inducerede kontrolceller. SPI reaktioner blev udpladet på Zeocin (Zeo) og kanamycin (Kan) agarplader (figur 3B). SPI producerede korrekt modificeret Dnttip1 Knockin vektor i alle de 12 rekombinanter blev analyseret (figur 3C). DNA-sekventering verificerede mangel af fejl som følge af oligo syntese eller PCR-amplifikation.
Et andet eksempel på SPI involveret i ramme indsætning af et forstærket gult fluorescerende protein (EYFP) bundet selektionskassette på P2rx1 genet. Den P2rx1 genet koder for et G-protein-koblet receptor, der fungerer som en ATP-ionkanal 29. Forbindelse til YFP fluorescens tillader sporing af P2x1 receptoren på celleoverfladen i VArious funktionelle assays. P2rx1 er endnu et vanskeligt sted, der har fremlagt store problemer med konventionelle recombineering metoder (data ikke vist). Ved hjælp af SPI, et 12 kb segment af P2rx1 genet omfatter det terminale exon (exon 12) blev subklonet ind i et p15A zeo vektor og modificeret med den samordnede indsættelse af en EYFP -LoxP flankeret neo-kassetten erstatter stopkodonen i exon 12 at konstruere P2rx1-EYFP Knockin vektor (figur 3D). I dette eksempel, den tilbagestående streng beskyttede p15A vektor (1,7 kb) indeholdt 230 bp HA og EYFP kassetten indeholdt 50 bp HA og blev også efterladt umodificeret. Den EYFP indsættelse kassette (2,7 kb) blev samlet ved splejsning overlap PCR af EYFP genet, PCR amplificeret fra pEYFP-C1 og LoxP- PGK-EM7-Neo-BGHpA-LoxP kassette, PCR amplificeret fra pL452 (NCI, Frederick) . SPI reaktion producerede flere hundrede kolonier (data ikke vist). RE analyse af DNAminipreps fremstillet ud fra 11 kloner viste flertallet indeholdt korrekt monteret P2rx1-EYFP Knockin vektor (figur 3E). Yderligere validering ved DNA-sekventering viste fejlfri indsættelse af EYFP kassetten. Men nogle af klonerne viste profiler af umærkede hul repareret og de mærkede gap repareret plasmider i den samme celle (bane 6-9). Et par prøver indeholdt også forkert kampen repareret (bane 2) eller mistargeted plasmider (bane 4 og 5). Den manglende af samtidige subkloning og målretning i nogle SPI rekombinanter fremhæver grænserne for effektiv SPI kloning ved brug af store kassetter (> 3 kb), som stammer fra de begrænsninger på Red processivitet af lange DNA-fragmenter 30, eller hvis du bruger kort HA. Faktisk øger HA af EYFP kassette til 200 bp øget SPI effektivitet og korrekt målretning af kassetten (data ikke vist). Gene målretning med P2rx1 - EYFP Knockin vektor i JM8.N4muse ES-celler (C57BL / 6 stamme) genereret 6 positive kloner ud af 96, som indeholdt den korrekt målrettet P2rx1-EYFP sekvens (figur 3F).
BAC Reporter vektorer
En BAC klon af målgenet ofte indeholder alle de nødvendige opstrøms og nedstrøms regulatoriske elementer f.eks, forstærkere, UTR'er mv samt den endogene promotor til at drive genekspression på naturlige indhold 31. En BAC reporter vektor er derfor det foretrukne køretøj rekapitulere den endogene ekspressionsmønster af et gen 32. Men den store størrelse af en BAC plasmid (op til 200 kb) præsenterer betydelige praktiske problemer med at transficere en intakt BAC i celler 33. Reduktion af størrelsen af BAC genomisk insert gennem BAC trimning 34,35, samtidig med at de nødvendige regulatoriske elementer af et gen, gør det lettere håndtering af BAC og resulterer i en mere effektiv transfectipå. Aktuelle BAC teknik teknologi involverer flere runder af recombineering at nå dette mål 35. For at demonstrere anvendeligheden af SPI i BAC trimning blev en pBeloBAC11 BAC vektor, der anvendes til at subklone en 30 kb genomisk sekvens herunder den fulde længde P2rx1 gen fra 168 kb P2rx1 BAC sammen med den samtidige indsættelse af en EYFP kassette i P2rx1 genet (figur 4A). Den pBeloBAC11 zeo vektor rygrad (6,5 kb) indeholdende 180 bp HA blev PCR-amplificeret med modificerede oligoer, der genererede en tilbagestående streng beskyttet vektor. Den samme EYFP Neo kassette (3 kb), der anvendes i den tidligere P2rx1 Knockin vektor konstruktion, var PCR-amplificeret ved hjælp halter streng beskyttede oligo'er indeholdende 180 bp HA og målrettet den P2rx1 exon 12 erstatter stopkodonen. Efter kombineret elektroporation af EYFP kassetten og pBeloBAC11 zeo vektoren i P2rx1 BAC celler exprEssing de gbaA recombineering proteiner blev kulturen udvundet i 10 ml LB pH 8 i 3 timer ved 37 ° C for at adskille BAC plasmider. Rene rekombinanter blev udvalgt på Zeo og Kan agarplader og blev observeret ved en frekvens på 2 x 10 -6. Colony PCR genotyping analyse afslørede vellykket BAC trimning i 3 ud af 6 kloner, der blev analyseret (figur 4B). Long række PCR-amplifikation på tværs af EYFP insertionsstedet bekræftede den korrekte kassette inkorporering i de tre positive kloner (figur 4B). De tre kloner, der mangler EYFP insertet var også forkert hul repareret ved 5'-enden, selvom årsagen mistargeting af EYFP kassette i disse kloner kan være adskilt til korrekt afslutning af 5'BAC ende. De tre EYFP positive BAC-kloner blev yderligere analyseret med VE fordøjelser og viste det forventede mønster af korrekt trimmet EYFP rekombinant BAC (figur 4C </ Strong>). Sekvensanalyse afslørede fravær af fejl i EYFP kassette i kun 1 klon ud af 3 positive.
Betinget Knockout (CKO) vektorer
Betinget ablation af genekspression er et vigtigt redskab til at undersøge udviklingsprocesser eller studere biologiske systemer på et bestemt tidspunkt. En betinget gen knockout strategi indebærer typisk placeringen af LoxP rekombinationssites omkring en kritisk exon (CE). Udeladelsen af en CE på Cre-ekspression eller aktivering producerer en læserammeforskydning og en for tidlig stopkodon, hvilket resulterer i nedbrydning af mRNA grund nonsens medieret henfald (NMD). Opførelsen af en betinget targeting gen vektor er en kompleks opgave, og omfatter flere trin af subkloning, målretning og transformation 22. SPI tilbyder en bekvem vej til at forenkle denne proces. Som en prøvesag blev en betinget allel af Zrsr2 genet konstrueretved hjælp af SPI metode (figur 5A). Den Zrsr2 genet koder for et splejsning faktor og en enkelt kopi er placeret på X-kromosomet. Den betingede status gendeletion er særlig vigtigt i dette tilfælde at styre mulighed for celler tilpasning af manglende Zrsr2 under ES celleselektion på en konstitutiv målretning gendeletion strategi. SPI blev udført for at subklone en 10 kb del af ZrSr2 genet med samtidig indsættelse af to forskellige LoxP flankeret udvælgelse kassetter. FRT-PGK-EM7-Neo-FRT-LoxP kassette (2 kb) blev PCR-amplificeret fra RE fordøjet pL451 ved hjælp halter streng beskyttede oligoer, der indeholdt 180 bp HA rettet mod ZrSr2 intron 2. En anden kassette indeholdende Rox-PGK-em7- Blasticidin (BSD) -Rox-LoxP (2 kb) blev PCR-amplificeret fra en R6K plasmid med tilbagestående streng beskyttede oligo'er indeholdende 180 bp HA identisk med en nedstrøms region i intron 3. De to loxP-sites flankeret exon 3, CE, hvis deletion ved betingede Cre aktivering resulterer i et rammeskift og indfører en tidlig stopkodon. Den Zrsr2 subkloning plasmid (1,6 kb) blev PCR-amplificeret fra en RE lineariseret p15A zeo plasmid hjælp halter streng beskyttet oligoer indeholdende 180 bp HA matcher enderne af 10 kb Zrsr2 sekvens. SPI reaktioner blev udført som beskrevet før og udpladet på Zeo + Neo + BSD plader. Den ZrSr2 betinget targeting vektor blev succesfuldt samles i de fleste af de 12 undersøgte rekombinanter (figur 5B). Yderligere DNA-sekventering analyse viste korrekt isætning af både selektionsmarkører i ZrSr2 CKO vektoren.
Figur 1. SPI kloning. Oversigt over SPI kloning proces, der kombinerer kassette indsætning og subkloning i et enkelt trin. (A) BAC klon er transformed med pSC101 BADgbaA plasmid og dyrket ved 30 ° C. (B) Efter arabinose induktion til at udtrykke de røde proteiner, er den asymmetriske modificerede indsættelse kassette og subkloning plasmid indføres i BAC klon og udvalgt med både indsættelse og subkloningstrin markører til at generere det endelige vektor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk illustrerer udformningen af SPI recombineering oligoer. Subkloning plasmid og insertion kassette er begge dannet ved PCR ved anvendelse af en kombination af terminal PTO og fosfat modificerede oligoer. PCR-fragmentet på Red fordøjelse in vivo, producerer et ssDNA mellemprodukt, som annealer til tilbagestående streng af replikationsgaflen. Gene specifik ha 50-180 bp er inkorporeret i hver oligo som vist. Pilen angiver retningen af DNA-replikation over et kandidat-gen. Stiplede linie repræsenterer subkloning plasmidsekvens ikke er indarbejdet i PCR-produktet. RE site, restriktionsenzymsted af linearisering af den endelige vektor; F, fremad sekvens (20 bp) specifikke for subkloning plasmid eller insertion kassette; R, reverse komplement-sekvens (20 bp) af plasmidet eller kassette; sm, selektionsmarkør. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. SPI muliggør konstruktion af vanskelige Knockin vektorer. (A) Skematisk af SPI strategi, der anvendes i konstruktionen af Dnttip1 dobbelt mærkede vektor. Arrow indiCates retning replikation på BAC-klonen. (B) Plating resultaterne af de ikke-inducerede og inducerede prøver af Dnttip1 SPI eksperimentet. (C) EcoRI fordøjelse af Dnttip1 SPI kloner. M, 1 kb stige (NEB); C, p15A Dnttip1 kampen repareret plasmid mangler den dobbelte tag kassetten. Fragmentstørrelser er: tagget, 9,2 + 4,4 + 2,2 kb; kontrol; 9.2 + 4.6 kb. (D) SPI baseret P2rx1-EYFP Knockin vektor konstruktion. (E) EcoRI fordøjelse af P2rx1-EYFP SPI-kloner. M, 1 kb + ladder (Invitrogen); C, p15A P2rx1 kampen repareret plasmid mangler EYFP kassetten. Fragmentstørrelser er: tagget, 8,3 + 4,4 + 3,1 + 0,03 kb; kontrol; 8,3 + 3,1 + 1,8 + 0,03 kb (F) Southern blot-analyse af P2rx1 -. EYFP genmålretning i JM8.N4 ES-celle-celler. Topplade, Southern blot med 3'-enden probe under anvendelse PshAI Digest. Vist er screening resultat af 5 kloner. Bundplade, Southern blot under anvendelse af5'-enden probe og Spel fordøjelse af positiver identificeret fra 3'-enden screening. PshAI RE sted; S, SpeI RE site. Stiplede linje repræsenterer enden af vektoren HA. Sort boks betegner sydlige probe. Forventede restriktionsfragmenter er PshAI: WT, 8,9 kb; EYFP-neo, 11,5 kb; Spel:. WT, 6,9 kb; EYFP-neo, 7,6 kb Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Forenklet BAC trimning ved hjælp af SPI. (A) Skematisk illustrerer begrebet BAC trimning ved hjælp af SPI. Nøgle til symboler er beskrevet i figur 1. (B) PCR-amplifikation over 5 'og 3' enderne af subklonede indsatsen og på tværs af P2rx1-EYFP insertion site. Screeningen strategi er vist for hver type af PCR. M (øverste panel), Hyperladder 25 bp, (nederste paneler), 1 KB +; P, P2rx1 BAC; . S, pBeloBAC11 zeo subkloning plasmid (C) HindIII fordøje de tre EYFP positive SPI BAC-kloner fra (B); E, forventes HindIII begrænsning mønster af trimmede EYFP BAC. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Betinget knockout vektor generation ved hjælp SPI kloning. (A) Skematisk af samtidig indsættelse af to forskellige LoxP flankeret udvælgelse kassetter under subkloning af Zrsr2 allelen. Nøgle til symboler er beskrevet i figur 1. (B) </ Strong> EcoRI fordøjelser af Zrsr2 SPI kloner. L 1 kb stige (NEB); C1, p15A ZrSr2 hul repareret plasmid, C2, p15A ZrSr2 hul repareret plasmid indeholdende neo insert; C3, p15A ZrSr2 hul repareret plasmid indeholdende BSD indsatsen. Fragmentstørrelser er: CKO, 7,7 + 2,9 + 2,6 + 1,6 kb; C1, 7,7 + 4,0 kb; C2, 7,7 + 4,3 + 1,6 kb; C3, 7,7 + 2,9 + 2,3 kb. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Nr trin | Konventionel recombineering pipeline a | Multiplex recombineering B |
| Trin 1 | Transformation af recombineering plasmidet i BAC vært | Transformation af recombineering plasmidet i BAC vært. Fremstilling af targeting kassetter og subkloning vektorer. |
| Step2 | Indsættelse af R1 / R2 Gateway kassette | Multiplex hul reparation kloning |
| Trin 3 | Indsættelse af floxet Kan kassette | O / N-kulturen fra enkelte kolonier |
| Trin 4 | Gap reparation i R3 / R4 plasmid | Plasmidfremstilling og verifikation |
| Trin 5 | Transformation i Cre + E. coli | |
| Trin 6 | Plasmidfremstilling og verifikation | |
| Trin 7 | O / N tre-vejs Gateway reaktion | |
| Trin 8 | Transformation af det tre-vejs Gateway reaktion i DH10B E. coli-celler | |
| Trin 9 | Overnight kultur fra enkelte kolonier | |
| Trin 10 | Plasmidfremstilling og sekvensverificering | |
| b Gennemsnitlig tid på 4 dage til verificerede klon | ||
Tabel 1: Sammenligning af konventionel recombineering med SPI i konstruktionen af betingede knockout vektorer.
| RE buffer | 5 pi |
| DNA | 1 ug plasmid eller oprensede PCR-produkter |
| RE | 1 pi (5 enheder eller mere) |
| TE | op til 50 pi |
| Der inkuberes ved 37 ° C i mindst 1 time. Varm inacitvate ifølge producentens instruktioner | |
Tabel 2: RE Digest.
| PCR materialer | Slutkoncentration |
| PCR-buffer | 1x |
| dNTP | 200 nM |
| MgSO4 | 1,5 mM |
| Betain | 1,3 M |
| DMSO | 1% |
| Forward primer | 200 nM |
| Reverse primer | 200 nM |
| DNA-polymerase | 1 U |
| Skabelon | 10 ng af multikopiplasmider eller 2,5 pi miniprep DNA til genotypebestemmelse PCR'er |
| Vand | op til 50 pi en |
| A for en standard 50 pi PCR-reaktion med multikopiplasmider. Lang rækkevidde genotype PCR'er blev sat op i 25 pi PCR-reaktioner. | |
| PCR-betingelser | |
| 95 ° C | 2 min |
| 92 ° C | 10 sek |
| 55 ° C | 30 sek |
| 72 ° C | 30 sek |
| 30 cykler b | |
| B Cycle ikke kan forlænges til 35 for BAC PCR genotypebestemmelse | |
Tabel 3: PCR Opstilling og betingelser.
| Antibiotika | Koncentration a (ug ml-1) |
| Ampicllin | 50 |
| Blasticidin B | 40 |
| Chloramphenicol | 12.5 |
| Gentamicin | 2 |
| Hygromycin c | 30 |
| Kanamycin B | 15 |
| Tetracyklin | 4 |
| Trimethoprim c | 10 |
| Zeocin | 5 |
| en Anbefales til brug med AKB og multikopiplasmider når de anvendes i kombinationer i multiplex recombineering | |
| b Blasticidin (35 ug ml -1) og kanamycin (6 ug ml -1), når de anvendes sammen i kombination | |
| c Hygromycin og Trimethoprim anbefales ikke til udvælgelse med enkelt kopi BAC'er. | |
Tabel 4. Anbefalet antibiotiske koncentrationer til anvendelse i SPI forsøg.
Discussion
Konstruktion af ES-cellelinier og musemodeller har historisk involveret genmålretning hjælp plasmidkonstruktioner der indeholdt den modificerede allel 4. Imidlertid har konstruktionen af disse komplekse genmålretning vektorer viste sig at være en betydelig flaskehals i rettidig produktion af sådanne modeller. Udviklingen af recombineering baseret vektor byggeri strategier har givet forbedrede vektor design og mere effektiv vektor samling. Ikke desto mindre aktuelle recombineering protokoller stadig involverer flere trin, kræver mellemliggende plasmid oprensning og bruge forskellige bakteriestammer. Subkloning plus insertion tilbyder en ny tilgang til vektorkonstruktion, der kan udføres i én elektroporation begivenhed i resident BAC værtsstammen. Anvendeligheden af SPI i targeting-genet blev testet her i en række vektorkonstruktion applikationer. I alle her undersøgte tilfælde SPI vist sig at være effektive, og det korrekte rekombinante plasmid blev fremstillet.I de fleste tilfælde blev flere forskellige kassetter isat korrekt i targeting vektor. Store DNA kassetter og vektorer blev let rummes i SPI protokollen og demonstreret fleksibiliteten i dette system.
SPI bygger på anvendelsen af lange homologi sekvenser og phosphorthioat (PTO) beskyttelse af det lineære DNA-kassetter. PTO modifikation giver beskyttelse mod exonukleaser til det lineære DNA 20,21 og den lange HA øger rekombination effektivitet at tillade multiplexing. Men syntese af længere oligo-sekvenser øger chancerne for at akkumulere fejl især sletninger. Mutationer i oligo kan være særlig skadeligt, hvis de omfatter proteinkodende regioner. DNA-sekventering over HA og dækker den fulde længde af den indsatte kassette anbefales at fjerne kloner med eventuelle sekvensændringer. Anvendelse af en high-fidelity DNA polymerase system er også foreslået at undgå indførelsen af eny PCR-fejl. Længden og sammensætningen af HA af subkloning plasmidet er mere kritisk i forhold til den af indsættelsen kassetten (data ikke vist). For særligt følsomme applikationer som konstruktion af Knockin vektorer, hvor eventuelle mutationer i exon regioner ikke tolereres, kan ha indsættelsen kassetten afkortes (50-120 bp) for at undgå problemer i forbindelse med lange oligoer. Indsættelsen kassette kan også stå umodificeret eller dual phosphorothioated (hvor viden om retningen af replikation er ikke tilgængelig). Men multiplexing i disse tilfælde stadig kræver lang beskyttet HA subkloning plasmider. En advarsel af denne strategi er en sænkning af multiplexing effektivitet, som potentielt kan påvirke SPI kloning på forskellige loci.
Længden af insertionen kassetten og subkloning plasmid er en anden vigtig parameter i SPI kloning. Større DNA-molekyler elektroporere mindre effektivt og effekten er kumulative, givet reminimum skal udgøre at indføre alle kassetterne i den samme celle (data ikke vist). Multiplexing er mest effektiv med mindre indsættelse kassetter. DNA-fragmenter større end 3 kb placere også en grænse for Red medieret ssDNA behandling, som er mest effektive til 3 kb 30. Indsætningspunkter kassetter end 3 kb er dobbelt resekterede og kombinere mindre effektivt via en beta uafhængig vej 20. Derfor screening af tilstrækkelige kolonier for at identificere den korrekte klon bliver vigtigt i disse tilfælde. En længere varighed af rekombination efter elektroporation også øger chancerne for inddrivelse af den korrekte klon i vanskelige SPI øvelser. Op til fire små kassetter (<1,5 kb) kan indsættes samtidigt med SPI-processen, selvom multiplexing effektivitet aftager med hver ekstra kassette (data ikke vist). Men det afspejler resultatet af en optimal SPI eksperiment, og det er tilrådeligt at overveje grænserne for multiplexing, når du bruger mange store kassetter. Udviklingen af genom redigeringsværktøjer som klynger regelmæssigt spatierede korte palindromiske gentagelser (CRISPR) -cas9 endonuklease systemet har gjort det muligt at skabe nye genom ændringer og har ført til en mere effektiv genom engineering 36. Imidlertid har disse nyere teknologier suppleret gen-targeting vektorer i stedet erstattet dem. Det forventes, at CRISPR-cas system kan erstatte antibiotika udvælgelse og yderligere at forfine multiplex recombineering protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
| Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
| C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
| KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
| L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
| Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
| QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
| Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |
References
- Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
- Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
- Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
- Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
- Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
- Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
- Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
- Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
- Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
- Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
- Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
- Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
- Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).
- Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
- Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
- Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).
- Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
- Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
- Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
- Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
- Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
- Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).
- Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
- Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).
