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Biology

Subcloning प्लस निवेशन (एसपीआई) - जीन लक्ष्य निर्धारण वैक्टर का तेजी से निर्माण के लिए एक उपन्यास Recombineering विधि

Published: January 8, 2015 doi: 10.3791/52155
* These authors contributed equally

Introduction

जीन को लक्षित प्रौद्योगिकियों के विकास के विभिन्न जैविक प्रणालियों 1-3 की जांच के लिए सेल लाइनों और माउस मॉडल के निर्माण के लिए सक्षम है। एक जीनोमिक अनुक्रम के संशोधन में एक महत्वपूर्ण पहला चरण वेक्टर 4 को लक्षित एक जीन का डिजाइन और निर्माण है। लक्ष्य निर्धारण वैक्टर एक चयन मार्कर (जैसे, neomycin) द्वारा flanked वांछित संशोधनों (एस) युक्त हित के एलील ले कि प्लाज्मिड निर्माणों, और स्तनधारी कोशिकाओं 5 में कुशल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक लंबे जीनोमिक क्षेत्रों के हैं। सटीक जीन संशोधन भ्रूण स्टेम में लक्षित कर वेक्टर की शुरूआत (ते) कोशिकाओं 6 या दैहिक कोशिकाओं 7, द्वारा हासिल की है जिससे लक्षित कर वेक्टर पर डीएनए अनुक्रम का समान हिस्सों के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन और इच्छित संशोधन के हस्तांतरण में जीनोमिक ठिकाना परिणाम जीन रूपांतरण 8 से जीनोम के लिए। इस तरह के modifiएड ES कोशिकाओं तो germline 9 के माध्यम से इन संशोधित एलील हस्तांतरित कर सकते हैं कि वंश (chimaeras) का उत्पादन करने के लिए माउस blastocysts में इंजेक्ट किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक चूहों का उत्पादन करने के लिए एक वैकल्पिक मार्ग माउस जीनोम 10 में वेक्टर के यादृच्छिक एकीकरण की ओर जाता है जो एक कोशिकीय माउस युग्मनजों में एक जीन की अभिव्यक्ति वेक्टर, के microinjection शामिल है। वेक्टर निर्माण के पारंपरिक तरीकों पारंपरिक पर भरोसा किया है एक वेक्टर रीढ़ की हड्डी में विभिन्न चयन मार्कर और जीनोमिक टुकड़े क्लोन करने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों और डीएनए ligases का उपयोग कर क्लोनिंग 'कट और पेस्ट'। हालांकि, पारंपरिक क्लोनिंग का एक अंतर्निहित सीमित कारक स्थिति और प्रतिबंध साइटों के चुनाव को विशेष रूप से लंबे समय तक डीएनए दृश्यों के साथ है। यह अक्सर कई subcloning चरणों जरूरी है और यह भी अक्सर को लक्षित जीन की एक कम क्षमता की ओर जाता है जो वेक्टर, में बाहरी डीएनए दृश्यों का परिचय।

Recombineering (recombinogenic Engineering) में फेज पुनर्संयोजन प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) का उपयोग करके इन सीमाओं पर काबू पा कि एक डीएनए इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी है कोलाई कोशिकाओं 11,12। एक मुताबिक़ अनुक्रम के किसी भी क्षेत्र recombineering का एक सब्सट्रेट के रूप में काम कर सकते हैं, प्रतिबंध साइटों की उपलब्धता की कमी को हटा रहे हैं। बड़े डीएनए दृश्यों को मूल इस प्रकार भी उनके संरचनात्मक अखंडता 13 के संरक्षण, विवो में सीधे रूप से संशोधित किया जा सकता है। Recombineering कम homologies (50 बीपी) 14 और इसलिए अनुरूपता हथियार (हेक्टेयर) आसानी से सिंथेटिक oligo दृश्यों में शामिल किया जा सकता है के साथ बहुत ही कुशल है। एक ठेठ recombineering प्रयोग, एक oligo या हा युक्त एक डबल असहाय डीएनए (dsDNA) टुकड़ा में recombineering सक्षम में electroporated है गुणसूत्र पर या एक प्लाज्मिड 15 पर या तो स्थित लक्ष्य युक्त कोलाई कोशिकाओं। पुनर्संयोजन संभावित लाल आरईसी की inducible अभिव्यक्ति द्वारा प्रदत्त हैombination फेज 16,17 के प्रोटीन या आरएसी prophage 18 की RecET प्रोटीन। लाल / rece exonuclease तो इसकी सहयोगी, लाल / रंगरूट, एक एकल असहाय annealing के प्रोटीन (SSAP) 19 से बाध्य है जो मध्यवर्ती एक एकल असहाय डीएनए (ssDNA), रैखिक dsDNA धर्मान्तरित। एक लंबे ssDNA या उसके पूरक लक्ष्य अनुक्रम के लिए एक छोटी oligo के annealing के प्रतिकृति कांटा की ठंड कतरा पर होता है और लक्ष्य साइट पर अनुक्रम का समावेश होता है। कतरा ssDNA पुनर्संयोजन ठंड recombineering की उच्च क्षमता का आधार है और 'बीटा' पुनर्संयोजन मॉडल 20,21 द्वारा वर्णित किया जा सकता है।

एक ठेठ recombineering कार्यप्रवाह एक जीन को लक्षित वेक्टर दो निम्नलिखित मार्गों के दोनों शामिल है का निर्माण करने के लिए। एक मार्ग LoxP पुनर्संयोजन साइटों की अनुक्रमिक प्रविष्टि, एक चयन मार्कर द्वारा पीछा एक प्लाज्मिड में एक माउस बीएसी क्लोन से वांछित जीनोमिक क्षेत्र subcloning शामिल 10,23 recombineering और फिर 24,25 क्लोनिंग की खाई को मरम्मत के द्वारा एक प्लाज्मिड में संशोधित ठिकाना subcloning के कई दौर से अलग लक्ष्यीकरण वेक्टर तत्वों के साथ बीएसी जीनोमिक ठिकाना को लक्षित करना शामिल है। इस विषय पर रूपांतरों बड़ी माउस उत्पादन कार्यक्रमों 26,27 के हिस्से के रूप में विभिन्न उच्च throughput recombineering पाइपलाइनों में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन प्रक्रियाओं, जटिल और लंबा चरणों को शामिल विशेष वैक्टर और के उपयोग की आवश्यकता कोलाई उपभेदों के लिए (जैसे, रचनात्मक व्यक्त कोशिकाओं) और वेक्टर डीएनए शुद्धि और फिर से परिवर्तन (1 टेबल) के एक या एक से अधिक मध्यवर्ती चरणों का उपयोग। प्लस प्रविष्टि (एसपीआई) subcloning बीटा पुनर्संयोजन और एक ही प्रक्रिया में क्लोनिंग की खाई मरम्मत (चित्रा 1) को जोड़ती है एक उपन्यास recombineering तकनीक है। एसपीआई वेक्टर विधानसभा सरल, जल्दी और लचीला और मानक recombi पर महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता हैneering (तालिका 1) दृष्टिकोण। यहाँ, हम आसानी और गैर मानक और चुनौतीपूर्ण वेक्टर डिजाइन के निर्माण पर एक विशेष जोर देने के साथ विभिन्न वेक्टर निर्माण अनुप्रयोगों के लिए SPI का उपयोग करने का उपयोगिता प्रदर्शित करता है। परीक्षण के मामलों में एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर Knockin वेक्टर का निर्माण, एक दोहरी टैग प्रोटीन अभिव्यक्ति Knockin वेक्टर, एक बीएसी फ्लोरोसेंट संवाददाता वेक्टर और एक सशर्त पीटकर वेक्टर शामिल थे। ये विभिन्न एक परमाणु प्रोटीन जटिल, एक कोशिका की सतह रिसेप्टर स्थानीयकरण शुद्ध करने के लिए आवश्यकता की जांच या सशर्त एक जीन की अभिव्यक्ति काटकर अलग करना।

Protocol

डिजाइन लक्ष्य निर्धारण 1. जीन

  1. ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र को कवर करने के लिए एक उपयुक्त बीएसी क्लोन आदेश। इस उदाहरण के लिए संशोधित किया जा ES कोशिकाओं के प्रकार के isogenic है कि यह सुनिश्चित करें, जीन के लिए RPCI-23 और RPCI-24 बीएसी क्लोन C57BL 6 / ES कोशिकाओं के साथ लक्षित।
  2. लक्षित कर वेक्टर जब डिजाइनिंग मापदंड को लक्षित पारंपरिक जीन लागू करें। मुख्य मापदंडों संशोधन intronic कैसेट की एक जीन पीटा रणनीति और रिक्ति और प्लेसमेंट में हटाने के लिए महत्वपूर्ण एक्सॉनों (सीई) को परिभाषित करने, विधान या सशर्त होने के लिए आवश्यक है कि क्या शामिल है।
    नोट: इनमें से प्रत्येक कहीं और 10 विस्तार से चर्चा की गई है।
  3. लक्ष्य संशोधन साइट flanking 5-6 केबी के प्रत्येक जीनोमिक क्षेत्रों चुनें।
    नोट: ऊपरी सीमा p15A तरह प्लाज्मिड subcloning एक कम प्रति के साथ 80 केबी के रूप में उच्च किया जा सकता है, हालांकि subcloned डालने के आकार, इसलिए आम तौर पर 10-12 केबी है, pBR322 आदि और एक बीएसी के साथ अप करने के लिए 200 KBवेक्टर।

2. मल्टीप्लेक्स Recombineering oligos

  1. प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी (subcloning प्लाज्मिड) और चयन मार्कर (सम्मिलन कैसेट) के लिए डिजाइन oligos। यह 180 बीपी हा flanking जीनोमिक लक्ष्य साइट और सम्मिलन कैसेट या subcloning प्लाज्मिड (चित्रा 2) के विशिष्ट भड़काना अनुक्रम 20 बीपी होता है कि इस तरह के प्रत्येक oligo डिजाइन।
    नोट: अनुरूपता हथियार किसी भी दोहराए तत्वों को शामिल नहीं किया जाना चाहिए, दोहराए तत्वों की उपस्थिति गलत लक्ष्यीकरण और subcloning में परिणाम होगा। दोहराए तत्वों जैसे कि '' 'masker दोहराएँ' के रूप में वेब आधारित उपकरणों का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है।
  2. ES सेल (चित्रा 2) को लक्षित करने के लिए जीन को लक्षित वेक्टर linearize करने के लिए वेक्टर oligos में से एक पर एक अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम (आरई) साइट शामिल करें।
  3. एक oligo विश्लेषक प्रोग्राम का उपयोग कर oligo मापदंडों की जाँच करें। भड़काना क्षेत्र में माध्यमिक संरचनाओं से बचने के लिए ध्यान रखनाएस।
  4. सम्मिलन कैसेट के छोटे हा (50 बीपी) सहन और रिकोम्बिनेंट्स की कम संख्या पैदावार लेकिन subcloning प्लाज्मिड हा अब (180 बीपी) हमेशा होता है कि यह सुनिश्चित किया जाता है।
  5. '' CloneDB '' की तरह वेब आधारित उपकरणों का उपयोग विशेष बीएसी क्लोन के जीनोमिक डीएनए डालने के उन्मुखीकरण का निर्धारण करते हैं। बीएसी पुस्तकालय निर्माण में इस्तेमाल किया बीएसी प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी के नक्शे की जाँच करके श्वास से प्रतिकृति की दिशा स्थापित करना।
    नोट: श्वास सभी आमतौर पर इस्तेमाल किया बीएसी प्लास्मिड के लिए chloramphenicol (Chl) मार्कर की ट्रांसक्रिप्शनल दिशा के विपरीत आम तौर पर है।
  6. बीएसी क्लोन पर प्रतिकृति की दिशा के विपरीत है कि oligo के 5 'अंत करने के लिए दो टर्मिनल phosphorothioate (PTO) बांड जोड़ें। रिवर्स oligo (चित्रा 2) के लिए एक 5 'फॉस्फेट संशोधन जोड़ें।
    नोट: लाल पाचन पर असममित phosphorothioated पीसीआर कैसेट कर सकते हैं कि प्रधानमंत्री ठंड कतरा एक ssDNA मध्यवर्ती उत्पन्न करता हैप्रतिकृति कांटा की।
    नोट: अधिकतम मल्टीप्लेक्स पुनर्संयोजन आवृत्ति ठंड कतरा संरक्षित कैसेट के साथ मनाया जाता है। अग्रणी कतरा संरक्षित या दोहरी संरक्षित कैसेट कुछ loci में बराबर पुनर्संयोजन क्षमता का उत्पादन नहीं हो सकता है।
  7. पेज या HPLC शोधन के साथ oligos आदेश।

PSC101 BADgbaA Recombineering प्लाज्मिड के साथ 3. बीएसी क्लोन परिवर्तन।

  1. बनाने के लिए प्रवीण बीएसी recombineering असर कोलाई तनाव, लाल जीन 16 से युक्त pSC101 BADgbaA प्लाज्मिड के साथ इसे बदलना।
    नोट: pSC101 BADgbaA प्लाज्मिड arabinose inducible ARAC-पी खराब प्रमोटर, एक टेट्रासाइक्लिन चयन मार्कर और तापमान संवेदनशील pSC101 replicon के नियंत्रण के तहत लाल और RECA जीन होता है।
    1. बीएसी अगर संस्कृति में एक बाँझ विंदुक टिप वार और lysogeny शोरबा के 5.0 मिलीलीटर टीका लगाना (पौंड) 12.5 युक्त 8.0 पीएच56, जी मिलीलीटर -1 Chl। 5 घंटा 200 rpm पर झटकों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें।
    2. 10% (वी / वी) ग्लिसरॉल समाधान, microcentrifuge ट्यूब और बर्फ पर electroporation के cuvettes टेंशन मत लो। 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक प्रशीतित बड़े सेंट्रीफ्यूज और microcentrifuge शांत।
    3. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को निर्धारित और 600 एनएम पर absorbance के उपाय। 0.3-0.8 के एक आयुध डिपो 600 पठन पहुँच जाता है जब (नीचे वर्णित) electrocompetent कोशिकाओं को तैयार।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1216 XG पर एक बड़े अपकेंद्रित्र में एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में कोशिकाओं नीचे स्पिन।
    5. ठंडा 10% ग्लिसरॉल के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड के लिए 17,949 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन। धोने तीन बार की कुल कदम प्रदर्शन।
    6. 10% ग्लिसरॉल के 50 μl की कुल मात्रा में कोशिकाओं Resuspend और pSC101 BADgbaA recombineering प्लाज्मिड की 10-200 एनजी जोड़ें। Pipetting द्वारा एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्तऊपर और कई बार नीचे और फिर एक पूर्व ठंडा 1 मिमी अंतराल electroporation क्युवेट कोशिकाओं हस्तांतरण।
    7. 1.8 केवी, 25 μF और 200 Ω की स्थापना के साथ कोशिकाओं Electroporate।
      नोट: electroporator के प्रत्येक ब्रांड के लिए सही सेटिंग्स की जाँच करें। कम से कम 4 electroporation की एक समय लगातार नमक और अन्य अशुद्धियों की उपस्थिति इंगित करता है।
    8. इसके तत्काल बाद पौंड के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं की वसूली और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण।
    9. 2 घंटा 200 rpm पर झटकों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बीएसी gbaA संस्कृति विकसित।
      नोट: कोशिकाओं की वजह से तापमान संवेदनशील repe प्रतिकृति कारक की निष्क्रियता के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बड़े हो रहे हैं जब pSC101 BADgbaA प्लाज्मिड खो दिया है। Recombineering कार्यों को बनाए रखने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर gbaA कोशिकाओं को विकसित।
    10. 12.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 Chl और चार माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 टेट्रासाइक्लिन (TET) बरामद बीएसी gbaA संस्कृति से युक्त लेग के 9 मिलीलीटर जोड़ें। बढ़ोबीएसी gbaA संस्कृति ओ / एन 30 में   डिग्री सेल्सियस 200 rpm पर मिलाते हुए।
      नोट: supercoiled gbaA प्लाज्मिड electroporating के परिवर्तन दक्षता तरल मीडिया में संतृप्ति वृद्धि हे / एन की अनुमति के लिए पर्याप्त रूप से उच्च है।

निवेशन कैसेट्स और subcloning plasmids के 4. तैयारी

  1. नीचे वर्णित के रूप में लंबे समय से संशोधित oligos का उपयोग कर (पीसीआर), सम्मिलन कैसेट (एस) और subcloning प्लाज्मिड में हा शामिल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन को करने के लिए।
    1. वैकल्पिक: recombineering प्रतिक्रिया में प्लाज्मिड भार को रोकने के लिए, सम्मिलन कैसेट बढ़ाना एक R6K मूल या इसी तरह की संकीर्ण मेजबान रेंज प्लाज्मिड टेम्पलेट का उपयोग करें।
    2. वैकल्पिक रूप से, एक आरई डाइजेस्ट (तालिका 2) का उपयोग प्लाज्मिड टेम्पलेट linearize। पीसीआर प्रवर्धन क्षेत्र से बाहर कटौती और गर्मी निष्क्रिय है कि फिर से एक को चुनें। Manuf द्वारा सिफारिश के रूप में गर्मी आरई निष्क्रियacturer।
    3. एक उच्च निष्ठा HotStart डीएनए पोलीमरेज़ प्रणाली का उपयोग कर पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) की स्थापना की। (3 टेबल) विस्तृत रूप में एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें। (3 टेबल) के रूप में दिखाया थर्मल साइकिल प्रदर्शन करते हैं।
  2. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें। लोड 1-5 एक 1% पर प्रत्येक पीसीआर की μl 0.5 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 ethidium ब्रोमाइड (EtBR) युक्त agarose जेल (w / v)।
    नोट: गैर विशिष्ट प्रवर्धन उत्पादों की उपस्थिति recombineering प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप नहीं करता है। हालांकि कुछ मामलों में, किताब-dimers recombineering दक्षता कम हो सकती है।
  3. एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग पीसीआर उत्पादों शुद्ध।
    1. वैकल्पिक: पीसीआर क्लीन-अप के द्वारा पीछा DpnI साथ इलाज के द्वारा PCRs से प्लाज्मिड टेम्पलेट को हटा दें। (निर्माता से सिफारिश के रूप में) बाँझ विआयनीकृत पानी की एक न्यूनतम मात्रा में Elute डीएनए।
      नोट: DpnI के अलावा वीं की दरार की कम दक्षता में पीसीआर प्रतिक्रियाओं परिणाम unpurified कोई methylated प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट।
  4. डीएनए मानकों जैसे, λ HindIII डाइजेस्ट के एक ज्ञात सेट के खिलाफ या एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके agarose जेल विश्लेषण द्वारा पीसीआर प्रवर्धित डीएनए यों।

5. subcloning प्लस निवेशन

  1. 10 मिलीलीटर लेग + Chl + Tet में 200 μl जोड़कर हे / एन बीएसी gbaA संस्कृति 50 गुना पतला। 30 पर आगे बढ़ें   डिग्री सेल्सियस 1 घंटा 50 मिनट के लिए 200 rpm पर मिलाते हुए। एक नमूना शामिल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. कदम 3.1.2 में वर्णित के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सभी recombineering सामग्री और उपकरणों की टेंशन मत लो।
  3. लेग अगर पीएच subcloning वेक्टर (तालिका 4) के चयन के लिए के रूप में अच्छी तरह से डाला जाता है कि डीएनए टुकड़ा के चयन की अनुमति देगा कि उपयुक्त चयनात्मक एंटीबायोटिक (एस) की सही एकाग्रता युक्त आठ प्लेटों डालो।
    नोट: कुछ एंटीबायोटिक दवाओं पीएच के प्रति संवेदनशील हैं। इस्तेमाल की पौंडएक नियम के रूप में अगर 8 पीएच।
  4. एल arabinose का समाधान (वी / डब्ल्यू) एक 10% की तैयारी। 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर।
    नोट: arabinose gbaA प्लाज्मिड से recombineering प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है।
  5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग बीएसी gbaA संस्कृति के आयुध डिपो की जाँच करें। निम्नलिखित कदम में वर्णित के रूप में 0.25-0.3 के 600 तक पहुँच जाता है एक आयुध डिपो एक बार, recombineering प्रोटीन प्रेरित।
  6. 0.2% की arabinose के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए बीएसी संस्कृति के 10 एमएल के लिए 10% arabinose समाधान के 200 μl जोड़ें। (Arabinose के बिना) एक uninduced संस्कृति को शामिल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
  7. एक 37 बीएसी संस्कृति स्थानांतरण   सी मिलाते इनक्यूबेटर ° और 45 मिनट में 230 rpm पर झटकों के लिए लाल अभिव्यक्ति प्रेरित।
    नोट: लाल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर अक्षम है।
  8. कोशिकाओं नीचे स्पिन और कदम 3.1.5 में वर्णित के रूप में 10% ग्लिसरॉल के साथ 3 बार धोएं।
  9. , 600-1 जोड़ें000 subcloning प्लाज्मिड और recombineering प्रतिक्रिया के लिए सम्मिलन कैसेट (एस) के प्रत्येक एनजी। वेक्टर और कैसेट के पुनर्संयोजन प्रवीणता और अखंडता की जाँच करने के लिए एक ही वेक्टर और वेक्टर प्लस एकल डालने नियंत्रण शामिल हैं।
  10. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करते हैं। बीएसी वैक्टर के लिए तीन घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बहु ​​प्रतिलिपि प्लास्मिड के लिए या पौंड के 10 एमएल में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर लेग में कदम 3.1.7 और बाद में वसूली में वर्णित के रूप में electroporation प्रदर्शन करते हैं।
  11. बरामद संस्कृति जैसे, 90%, 10%, एक दोहरी चयन अगर प्लेटों पर% और 37 से बढ़ने की प्लेट अलग dilutions   16 घंटे के लिए सी °।

रिकोम्बिनेंट्स 6. विश्लेषण

  1. वैकल्पिक: 6 से 12 कालोनियों उठाओ और एक हा flanking किताब और एक डालने विशिष्ट प्राइमर का उपयोग कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। Subcloning प्लाज्मिड और सम्मिलन कैस शामिलSette प्लाज्मिड के रूप में अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण के रूप में माता पिता बीएसी क्लोन।
    1. कॉलोनी PCRs के agarose जेल विश्लेषण करते हैं। उम्मीद है और आकार में एक उज्ज्वल बैंड की उपस्थिति से सकारात्मक क्लोन को पहचानें।
      नोट: एसपीआई क्लोनिंग की प्रक्रिया की उच्च क्षमता ज्यादातर सही रिकोम्बिनेंट्स उत्पन्न करता है।
  2. चयनात्मक एंटीबायोटिक युक्त 5 मिलीलीटर लेग पीएच 8 में कालोनियों उठाओ और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन बढ़ता है।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक स्तंभ शुद्धि किट का उपयोग डीएनए minipreps तैयार करें।
  4. मानक फिनोल-क्लोरोफॉर्म अलगाव या एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग बीएसी Miniprep डीएनए तैयार करें।
  5. Miniprep डीएनए पर फिर हज़म प्रदर्शन करते हैं। Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग डीएनए। सही लक्ष्यीकरण वेक्टर की उम्मीद टुकड़े आकार युक्त क्लोन की पहचान करने के आरई पैटर्न का विश्लेषण करें। स्पष्ट रूप से वेक्टर कमी डालने (एस) और डालने (एस) युक्त वेक्टर के बीच भेदभाव है कि एक आरई चुनें।
  6. OPTIOएनएएल: अभी भी में मौजूद है जो बीएसी, से रहित हैं कि कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कोलाई recombineering के बाद, DH5alpha या DH10B परिणत करने के लिए Miniprep प्लास्मिड डीएनए का उपयोग कोलाई कोशिकाओं।
  7. Oligo संश्लेषण त्रुटियों की जांच करने के लिए हा और सम्मिलन कैसेट भर में डीएनए अनुक्रमण प्रदर्शन करते हैं।

Representative Results

Knockin वैक्टर

Knockin को लक्षित वैक्टर एकल आधार जोड़ी एक प्रोटीन कोडिंग क्षेत्र में प्रतिस्थापन, एक फ्लोरोसेंट मार्कर के विलय या एक प्रोटीन के लिए एक आकर्षण टैग या एक जीन की अभिव्यक्ति कैसेट के एकीकरण सहित जीनोम में एक उपन्यास अनुक्रम सुविधा शुरू करने की जरूरत को दर्शाते हैं। Knockin वेक्टर निर्माण रणनीतियों में SPI के आवेदन का परीक्षण करने के लिए, दो अलग-अलग परीक्षण मामलों की जांच की गई। Dnttip1 प्रोटीन 1 ए (TDIF1) एक साथ वर्ग के साथ मैं deacetylase (HDAC) हिस्टोन कि एक mitotic deacetylase जटिल फार्म बातचीत, deoxynucleotidyltransferase, टर्मिनल encodes (MiDAC) 28। कोशिका विभाजन में Dnttip1 की भूमिका की जांच करने के लिए, एक मिलकर आत्मीयता टैगिंग दृष्टिकोण प्रोटीन बातचीत TDIF1 अलग करने के लिए लिया गया था। लंबे अनुरूपता क्षेत्रों युक्त p15A सदिश का उपयोग Dnttip1 जीन के एक हिस्से subclone को पिछले प्रयास कम अंतराल के मरम्मत दक्षता एक में हुईएन डी अक्सर न्यायपालिका पुनर्संयोजन उत्पादों (डेटा) नहीं दिखाया। इस प्रकार, Dnttip1 ठिकाना पर एक Knockin वेक्टर के निर्माण के लिए एक चुनौतीपूर्ण recombineering व्यायाम प्रदान की है। एक SPI रणनीति (चित्रा 3 ए स्टॉप कोडोन की जगह, एक कम प्रतिलिपि p15A वेक्टर में Dnttip1 जीन पिछले एक्सॉन फैले (एक्सॉन 13) की एक 12 केबी खंड subclone करने के लिए और साथ ही साथ एक्सॉन 13 में एक दोहरी आत्मीयता टैग चयन कैसेट सम्मिलित करने के लिए डिजाइन किया गया था )। 2X झंडा Calmodulin बाध्यकारी प्रोटीन (सीबीपी) FRT-PGK-em7-Neomycin (नव) -BGhpA-FRT कैसेट (2.0 KB) 120 बीपी हा Dnttip1 flanking निहित है कि दोहरी PTO संशोधित oligos का उपयोग कर प्लाज्मिड linearized एक आरई से परिलक्षित किया गया था जुड़ा हुआ कोडोन बंद करो। एक p15A Zeo Dnttip1 subcloning वेक्टर (1.7 Kb) Dnttip1 अनुक्रम के छोर तक मुताबिक़ 200 बीपी क्षेत्रों subcloned होने के लिए निहित है कि निर्माण किया गया था। Dnttip1 subcloning प्लाज्मिड linearized पुनः था और पीसीआर 20 बीपी संशोधित oligos का उपयोग कर प्रवर्धितकि एक प्रमुख कतरा संरक्षित वेक्टर जनित। पीसीआर उत्पादों DpnI शुद्ध, इलाज और recombineering सक्षम Dnttip1 बीएसी में सह electroporated गया कोलाई कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से uninduced नियंत्रण कोशिकाओं। एसपीआई प्रतिक्रियाओं अगर प्लेट (3B चित्रा) से युक्त Zeocin (Zeo) और kanamycin (कान) पर चढ़ाया गया था। एसपीआई का विश्लेषण किया 12 रिकोम्बिनेंट्स (चित्रा -3 सी) के सभी में सही ढंग से संशोधित Dnttip1 Knockin वेक्टर का उत्पादन किया। डीएनए अनुक्रमण oligo संश्लेषण या पीसीआर प्रवर्धन से उत्पन्न किसी भी त्रुटि के अभाव सत्यापित।

एसपीआई का एक और उदाहरण P2rx1 जीन पर चयन कैसेट से जुड़ा हुआ एक बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) के में फ्रेम प्रविष्टि शामिल किया गया। P2rx1 जीन एक जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर encodes कि एक एटीपी-गेटेड आयन चैनल 29 के रूप में कार्य करता है। YFP प्रतिदीप्ति के लिए लिंकेज VA में कोशिका की सतह पर P2x1 रिसेप्टर की ट्रैकिंग परमिटकुख्यात कार्यात्मक assays। P2rx1 पारंपरिक recombineering के तरीके के साथ महत्वपूर्ण समस्याओं को प्रस्तुत किया गया है कि एक और मुश्किल ठिकाना है (डेटा) नहीं दिखाया। एसपीआई, टर्मिनल एक्सॉन को शामिल P2rx1 जीन (एक्सॉन 12) की एक 12 केबी खंड का प्रयोग एक p15A Zeo वेक्टर में subcloned और निर्माण करने के लिए एक्सॉन 12 में स्टॉप कोडोन की जगह एक EYFP -LoxP flanked नव कैसेट के ठोस प्रविष्टि के साथ संशोधित किया गया था P2rx1-EYFP Knockin वेक्टर (चित्रा 3 डी)। इस उदाहरण में, ठंड कतरा संरक्षित p15A वेक्टर (1.7 KB) 230 बीपी हा रखी जाती है और EYFP कैसेट 50 बीपी हा निहित है और यह भी असंशोधित छोड़ दिया गया था। EYFP प्रविष्टि कैसेट (2.7 Kb) splicing के ओवरलैप pEYFP-सी 1 से परिलक्षित EYFP जीन की पीसीआर, पीसीआर, और LoxP- PGK-em7-नव BGhpA-LoxP कैसेट द्वारा इकट्ठा किया गया था, पीसीआर pL452 (NCI, फ्रेडरिक) से परिलक्षित । एसपीआई प्रतिक्रिया कालोनियों के सैकड़ों का उत्पादन (डेटा) नहीं दिखाया। डीएनए के विश्लेषण के आरई11 क्लोन से तैयार minipreps बहुमत सही ढंग से इकट्ठा P2rx1-EYFP Knockin वेक्टर (चित्रा 3E) निहित दिखाया। डीएनए अनुक्रमण द्वारा अतिरिक्त सत्यापन EYFP कैसेट की त्रुटि मुक्त प्रविष्टि दिखाया। हालांकि, क्लोन के कुछ मरम्मत untagged खाई और एक ही सेल (गलियों 6-9) में टैग की खाई मरम्मत plasmids के प्रोफाइल को दिखाया। कुछ नमूने भी गलत तरीके से निहित खाई मरम्मत (2 लेन) या mistargeted प्लास्मिड (गलियों 4 और 5)। कम हा का उपयोग कर, या अगर लंबे समय तक डीएनए टुकड़े 30 की रेड processivity पर बाधाओं से उत्पन्न होती हैं जो बड़े कैसेट (> 3 KB), का उपयोग करते समय समवर्ती subcloning और कुछ एसपीआई रिकोम्बिनेंट्स में निशाना बनाने का विफलता कुशल एसपीआई क्लोनिंग की सीमा पर प्रकाश डाला गया। दरअसल, 200 बीपी को EYFP कैसेट की हा बढ़ रही एसपीआई दक्षता और कैसेट का सही लक्ष्य-निर्धारण (नहीं दिखाया डेटा) की वृद्धि हुई। JM8.N4 में EYFP Knockin वेक्टर - P2rx1 साथ लक्षित जीनमाउस ES कोशिकाओं (C57BL 6 / तनाव) सही ढंग से लक्षित P2rx1-EYFP अनुक्रम (चित्रा 3F) जिसमें 96 में से 6 सकारात्मक क्लोन उत्पन्न।

बीएसी रिपोर्टर वैक्टर

लक्ष्य जीन की एक बीएसी क्लोन अक्सर सभी के रूप में अच्छी तरह से UTRs आदि अपेक्षित नदी के ऊपर और नीचे की ओर नियामक तत्व जैसे, enhancers, प्राकृतिक स्तर 31 पर जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए अंतर्जात प्रमोटर शामिल हैं। एक बीएसी संवाददाता वेक्टर इसलिए एक जीन 32 की अंतर्जात अभिव्यक्ति पैटर्न पुनरावृत्ति करने के लिए पसंदीदा वाहन है। हालांकि, (200 KB तक) एक बीएसी प्लाज्मिड के बड़े आकार की कोशिकाओं को 33 में एक अक्षुण्ण बीएसी transfecting के साथ महत्वपूर्ण व्यावहारिक समस्याओं प्रस्तुत करता है। एक जीन की आवश्यक नियामक तत्वों को बनाए रखना है, जबकि बीएसी, 34,35 trimming के माध्यम से बीएसी जीनोमिक डालने के आकार को कम करने, एक अधिक कुशल transfecti में बीएसी और परिणामों की आसान से निपटने में सक्षम बनाता हैपर। वर्तमान बीएसी इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी के इस लक्ष्य को 35 प्राप्त करने के लिए recombineering के कई दौर शामिल है। (चित्रा बीएसी, एक pBeloBAC11 बीएसी वेक्टर P2rx1 जीन में एक EYFP कैसेट के एक साथ प्रविष्टि के साथ मिलकर 168 KB P2rx1 बीएसी से पूरी लंबाई P2rx1 जीन सहित एक 30 केबी जीनोमिक अनुक्रम subclone करने के लिए इस्तेमाल किया गया था trimming में SPI की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए 4 ए)। 180 बीपी हा युक्त pBeloBAC11 Zeo वेक्टर रीढ़ की हड्डी (6.5 Kb) पीसीआर एक ठंड कतरा संरक्षित वेक्टर उत्पन्न कि संशोधित oligos साथ परिलक्षित किया गया था। पिछले P2rx1 Knockin वेक्टर निर्माण में इस्तेमाल एक ही EYFP नव कैसेट (3 KB), पीसीआर 180 बीपी हा युक्त ठंड कतरा संरक्षित oligos का उपयोग कर प्रवर्धित और स्टॉप कोडोन की जगह P2rx1 एक्सॉन 12 निशाना बनाया गया। संयुक्त EYFP कैसेट की electroporation और P2rx1 बीएसी कोशिकाओं expr में pBeloBAC11 Zeo वेक्टर के बादgbaA recombineering प्रोटीन essing, संस्कृति बीएसी प्लास्मिड अलग करने के लिए 37C में तीन घंटे के लिए 10 मिलीलीटर लेग पीएच 8 में बरामद किया गया था। शुद्ध रिकोम्बिनेंट्स प्लेटें अगर Zeo और कान पर चयन किया गया था और 2 एक्स 10 -6 की एक आवृत्ति पर मनाया गया। कॉलोनी पीसीआर जीनोटाइपिंग विश्लेषण विश्लेषण किया गया है कि 3 से 6 से बाहर क्लोन (4B चित्रा) में trimming सफल बीएसी का पता चला। EYFP प्रविष्टि साइट भर में लांग रेंज पीसीआर प्रवर्धन तीन सकारात्मक क्लोन (4B चित्रा) में सही कैसेट समावेश की पुष्टि की। बीएसी अंत 'इन क्लोन में EYFP कैसेट की mistargeting के कारण 5 की सही बंद करने के लिए अलग-अलग हो सकता है, हालांकि अंत' EYFP डालने की कमी तीन क्लोन भी 5 पर मरम्मत गलत तरीके से खाई थे। तीन EYFP सकारात्मक बीएसी क्लोन आगे आरई हज़म के साथ विश्लेषण किया और सही ढंग से छंटनी की EYFP पुनः संयोजक बीएसी (चित्रा 4C <की उम्मीद पैटर्न दिखाया गया/ Strong>)। अनुक्रम विश्लेषण 3 सकारात्मक में से केवल एक क्लोन में EYFP कैसेट में त्रुटियों के अभाव का पता चला।

सशर्त नॉकआउट (cko) वैक्टर

जीन अभिव्यक्ति की शर्तों को पृथक विकास की प्रक्रिया की जांच करने के लिए या किसी विशेष समय बिंदु पर जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। एक सशर्त जीन पीटा रणनीति आमतौर पर एक महत्वपूर्ण एक्सॉन (सीई) के आसपास के LoxP पुनर्संयोजन साइटों की नियुक्ति शामिल है। रचनात्मक अभिव्यक्ति या सक्रियण पर एक सीई का विलोपन की वजह से बकवास मध्यस्थता क्षय (एनएमडी) को mRNA की गिरावट में जिसके परिणामस्वरूप एक frameshift और समय से पहले रोक कोडोन, पैदा करता है। एक सशर्त जीन लक्ष्यीकरण वेक्टर के निर्माण के लिए एक जटिल काम है और कई subcloning के इस कदम को लक्षित और परिवर्तन 22 शामिल है। एसपीआई इस प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए एक सुविधाजनक मार्ग प्रदान करता है। एक परीक्षण के मामले के रूप में, Zrsr2 जीन की एक सशर्त एलील निर्माण किया गया थाएसपीआई कार्यप्रणाली (चित्रा 5A) का उपयोग। Zrsr2 जीन एक splicing के कारक encodes और एक भी कॉपी एक्स गुणसूत्र पर स्थित है। जीन विलोपन की सशर्त स्थिति एक विधान जीन विलोपन को लक्षित रणनीति में ES सेल चयन के दौरान Zrsr2 की कमी के लिए अनुकूल कोशिकाओं की संभावना के लिए नियंत्रित करने के लिए इस उदाहरण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एसपीआई दो अलग LoxP flanked चयन कैसेट की समवर्ती प्रविष्टि के साथ ZrSr2 जीन की एक 10 केबी भाग subclone करने के लिए प्रदर्शन किया था। FRT-PGK-em7-नव FRT-LoxP कैसेट (2 KB) पीसीआर आरई से परिलक्षित किया गया था 180 बीपी हा 2. Intron Rox-PGK-em7- युक्त एक दूसरा कैसेट ZrSr2 को लक्षित है कि निहित कतरा संरक्षित oligos ठंड का उपयोग कर pL451 पच Blasticidin (बीएसडी) -Rox-LoxP (2 KB) पीसीआर Intron 3 में एक बहाव क्षेत्र के लिए समान flanked दो LoxP साइटों 180 बीपी हा युक्त ठंड कतरा संरक्षित oligos एक्सॉन 3, जिसका डी सीई के साथ एक R6K प्लाज्मिड से परिलक्षित किया गया थाएक frameshift में सशर्त Cre सक्रियण परिणामों पर eletion और समय से पहले रोक कोडोन का परिचय। Zrsr2 subcloning प्लाज्मिड (1.6 Kb) पीसीआर 10 केबी Zrsr2 अनुक्रम के सिरों मिलान 180 बीपी हा युक्त कतरा संरक्षित oligos ठंड का उपयोग कर एक आरई linearised p15A Zeo प्लाज्मिड से परिलक्षित किया गया था। Zeo + नव + Bsd प्लेटों पर पहले वर्णित है और चढ़ाया रूप एसपीआई प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन किया गया। ZrSr2 सशर्त लक्ष्यीकरण वेक्टर सफलतापूर्वक जांच 12 रिकोम्बिनेंट्स (चित्रा 5 ब) के अधिकांश में इकट्ठा किया गया था। इसके अलावा डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण ZrSr2 cko वेक्टर में चयन मार्करों दोनों का सही प्रविष्टि दिखाया।

चित्रा 1
चित्रा 1। एसपीआई क्लोनिंग। एक भी कदम में कैसेट प्रविष्टि और subcloning संयोजन एसपीआई क्लोनिंग की प्रक्रिया का अवलोकन। (ए) बीएसी क्लोन है ट्रॅनpSC101 BADgbaA प्लाज्मिड के साथ sformed और 30C से बढ़ी। रेड प्रोटीन व्यक्त करने के लिए arabinose प्रेरण के बाद (बी), असममित संशोधित प्रविष्टि कैसेट और subcloning प्लाज्मिड बीएसी क्लोन में पेश किया और अंतिम वेक्टर उत्पन्न करने के लिए प्रविष्टि और subcloning मार्करों दोनों के साथ चुना जाता है। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।

चित्रा 2
चित्रा 2. योजनाबद्ध एसपीआई recombineering oligos के डिजाइन illustrating। Subcloning प्लाज्मिड और सम्मिलन कैसेट दोनों टर्मिनल PTO और फॉस्फेट संशोधित oligos के संयोजन का उपयोग पीसीआर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। Vivo में लाल पाचन पर पीसीआर टुकड़ा, प्रतिकृति कांटा की ठंड किनारा करने anneals है, जो एक ssDNA मध्यवर्ती पैदा करता है। जनरलके रूप में दिखाया 50-180 बीपी के ई विशिष्ट हा प्रत्येक oligo में शामिल किया है। तीर एक उम्मीदवार जीन भर में डीएनए प्रतिकृति की दिशा इंगित करता है। धराशायी लाइन पीसीआर उत्पाद में शामिल नहीं subcloning प्लाज्मिड अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है। आरई साइट, अंतिम वेक्टर के linearization का प्रतिबंध एंजाइम साइट; एफ, subcloning प्लाज्मिड या सम्मिलन कैसेट के लिए विशिष्ट आगे अनुक्रम (20 बीपी); आर, प्लाज्मिड या कैसेट के रिवर्स पूरक अनुक्रम (20 बीपी); एसएम, चयन मार्कर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3. एसपीआई मुश्किल Knockin वैक्टर के निर्माण में सक्षम बनाता है। Dnttip1 दोहरी के निर्माण में इस्तेमाल एसपीआई रणनीति की (ए) योजनाबद्ध वेक्टर टैग किया। भारतीयों तीरबीएसी क्लोन पर प्रतिकृति की दिशा मोहनभोग। Dnttip1 एसपीआई प्रयोग के uninduced और प्रेरित नमूनों की (बी) चढ़ाना परिणाम है। Dnttip1 एसपीआई क्लोन (सी) EcoRI डाइजेस्ट। एम, 1 केबी सीढ़ी (चंचु); सी, p15A Dnttip1 खाई प्लाज्मिड दोहरी टैग कैसेट कमी मरम्मत की। टुकड़ा आकारों हैं: टैग, 9.2 + 4.4 + 2.2 केबी; नियंत्रण; 9.2 + 4.6 केबी। P2rx1-EYFP एसपीआई क्लोन (डी) एसपीआई आधारित P2rx1-EYFP Knockin वेक्टर निर्माण। (ई) EcoRI डाइजेस्ट। एम, 1 केबी + सीढ़ी (Invitrogen); सी, p15A P2rx1 खाई प्लाज्मिड EYFP कैसेट कमी मरम्मत की। टुकड़ा आकारों हैं: टैग, 8.3 + 4.4 + 3.1 + 0.03 KB; नियंत्रण; 8.3 + 3.1 + 1.8 + 0.03 KB (एफ) P2rx1 के दक्षिणी धब्बा विश्लेषण -। JM8.N4 ES सेल कोशिकाओं में लक्षित EYFP जीन। शीर्ष पैनल, PshAI डाइजेस्ट का उपयोग करते हुए 3 'के अंत जांच के साथ दक्षिणी धब्बा। दिखाया 5 क्लोन की स्क्रीनिंग परिणाम है। नीचे पैनल, दक्षिणी का उपयोग कर दागअंत स्क्रीनिंग 5 '3 से पहचान सकारात्मक का अंत जांच और SpeI डाइजेस्ट'। PshAI आरई साइट; एस, SpeI आरई साइट। धराशायी लाइन वेक्टर हा के अंत का प्रतिनिधित्व करता है। ब्लैक बॉक्स दक्षिणी जांच अर्थ। अपेक्षित प्रतिबंध टुकड़े, PshAI हैं:; EYFP-नव, 11.5 केबी गुम्मट, 8.9 केबी; SpeI:। गुम्मट, 6.9 केबी; EYFP-नव, 7.6 केबी इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4। सरलीकृत बीएसी एसपीआई का उपयोग कर trimming बीएसी की अवधारणा को दर्शाता हुआ एसपीआई। (ए) योजनाबद्ध का उपयोग कर trimming। प्रतीकों की कुंजी चित्र 1 में वर्णित है। 5 'और' 3 भर में (बी) पीसीआर प्रवर्धन subcloned डालने के समाप्त हो जाती है और P2rx1-EYFP insertio भर मेंएन साइट। स्क्रीनिंग रणनीति पीसीआर के प्रत्येक प्रकार के लिए दिखाया गया है। एम (शीर्ष पैनल), Hyperladder 25 बीपी, (नीचे पैनल), 1KB +; पी, P2rx1 बीएसी; । एस, pBeloBAC11 Zeo subcloning प्लाज्मिड (सी) (बी) से तीन EYFP सकारात्मक एसपीआई बीएसी क्लोन के पचाने HindIII; ई, छंटनी की EYFP बीएसी की HindIII प्रतिबंध पैटर्न की उम्मीद है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
एसपीआई क्लोनिंग का उपयोग कर चित्रा 5. शर्तों को पीटकर वेक्टर पीढ़ी। Zrsr2 एलील की subcloning के दौरान दो अलग अलग LoxP flanked चयन कैसेट के एक साथ सम्मिलन की (ए) योजनाबद्ध। प्रतीकों की कुंजी चित्र 1 में वर्णित है। (बी) </ Zrsr2 एसपीआई क्लोन की मजबूत> EcoRI हज़म। एल, 1 केबी सीढ़ी (चंचु); सी 1, p15A ZrSr2 खाई मरम्मत प्लाज्मिड, सी 2, p15A ZrSr2 खाई प्लाज्मिड नव डालने युक्त मरम्मत; सी 3, p15A ZrSr2 खाई बीएसडी डालने युक्त प्लाज्मिड मरम्मत की। टुकड़ा आकारों हैं: cko, 7.7 + 2.9 + 2.6 + 1.6 केबी; सी 1, 7.7 + 4.0 केबी; सी 2, 7.7 + 4.3 + 1.6 केबी; सी 3, 7.7 + 2.9 + 2.3 केबी। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एक पीटकर माउस कार्यक्रम (KOMP) उच्च throughput वेक्टर निर्माण पाइपलाइन। 3 सप्ताह का औसत समय क्लोन 26 सत्यापित करने के लिए।
कदम की कोई परम्परागत recombineering पाइपलाइन एक मल्टीप्लेक्स recombineering बी
चरण 1 बीएसी मेजबान में recombineering प्लाज्मिड की परिवर्तन बीएसी मेजबान में recombineering प्लाज्मिड का परिवर्तन। कैसेट को लक्षित और subcloning वैक्टर की तैयारी।
चरण2 आर 1 / R2 के गेटवे कैसेट की प्रविष्टि मल्टीप्लेक्स की खाई मरम्मत क्लोनिंग
चरण 3 Floxed कान कैसेट की प्रविष्टि एकल कालोनियों से हे / एन संस्कृति
चरण 4 R3 / R4 के प्लाज्मिड में गैप मरम्मत प्लाज्मिड तैयारी और सत्यापन
चरण 5 Cre + में परिवर्तन कोलाई
6. प्लाज्मिड तैयारी और सत्यापन
चरण 7 हे / एन तीन तरह गेटवे प्रतिक्रिया
चरण 8 DH10B में तीन तरह गेटवे प्रतिक्रिया की परिवर्तन कोलाई कोशिकाओं
9. एकल कालोनियों से रातोंरात संस्कृति
चरण 10 प्लाज्मिड तैयारी और अनुक्रम सत्यापन
सत्यापित क्लोन करने के लिए चार दिनों की बी औसत समय

तालिका 1: सशर्त पीटकर वैक्टर के निर्माण में SPI के साथ पारंपरिक recombineering की तुलना।

आरई बफर 5 μl
डीएनए एक माइक्रोग्राम प्रति प्लाज्मिड या शुद्ध पीसीआर उत्पादों
आरई 1 μl (5 इकाइयों या अधिक)
ते अप करने के लिए 50 μl
कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार inacitvate गर्मी

तालिका 2: डाइजेस्ट रहे हैं।

पीसीआर सामग्री अंतिम एकाग्रता
पीसीआर बफर 1x
dNTP 200 एनएम
MgSO 4 1.5 मिमी
Betaine 1.3 एम
DMSO के 1%
आगे प्राइमर 200 एनएम
रिवर्स प्राइमर 200 एनएम
डीएनए पोलीमरेज़ एक यू
खाका Multicopy plasmids के 10 एनजी या जीनोटाइपिंग PCRs के लिए Miniprep डीएनए के 2.5 μl
वाटर अप करने के लिए 50 μl एक
multicopy plasmids के साथ एक मानक 50 μl पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक। लांग रेंज जीनोटाइपिंग PCRs 25 μl पीसीआर प्रतिक्रियाओं में स्थापित किया गया था।
पीसीआर स्थितियों
95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट
92 डिग्री सेल्सियस 10 सेकंड
55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
30 चक्रों
बी साइकिल कोई बीएसी पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए 35 के लिए बढ़ाया जा सकता है

तालिका 3: पीसीआर सेट अप और शर्तें।

एंटीबायोटिक्स एकाग्रता एक (g मिलीलीटर -1)
Ampicllin 50
Blasticidin बी 40
Chloramphenicol 12.5
जेंटामाइसिन 2
Hygromycin 30
Kanamycin बी 15
टेट्रासाइक्लिन 4
Trimethoprim 10
Zeocin 5
मल्टीप्लेक्स recombineering में संयोजन में उपयोग किया जाता है जब एक BACS और multicopy plasmids के साथ प्रयोग के लिए अनुशंसित
बी Blasticidin (35 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1) और kanamycin (6 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1) संयोजन में एक साथ इस्तेमाल किया जब
सी hygromycin और Trimethoprim भी कॉपी BACS के साथ चयन के लिए सिफारिश नहीं कर रहे।

एसपीआई प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए तालिका 4। अनुशंसित एंटीबायोटिक सांद्रता।

Discussion

ES सेल लाइनों और माउस मॉडल का निर्माण ऐतिहासिक संशोधित एलील 4 निहित है कि प्लाज्मिड निर्माणों का उपयोग कर को लक्षित जीन शामिल किया गया है। हालांकि, इन जटिल जीन को लक्षित वैक्टर का निर्माण इस तरह के मॉडल का समय पर उत्पादन में एक महत्वपूर्ण अड़चन साबित हुई है। recombineering आधारित वेक्टर निर्माण रणनीतियों के विकास में सुधार वेक्टर डिजाइन और अधिक कुशल वेक्टर विधानसभा अनुमति दी गई है। बहरहाल, वर्तमान recombineering प्रोटोकॉल अभी भी कई कदम शामिल मध्यवर्ती प्लाज्मिड शोधन की आवश्यकता होती है और विभिन्न जीवाणु उपभेदों का उपयोग करें। प्लस प्रविष्टि subcloning निवासी बीएसी मेजबान तनाव में एक इलेक्ट्रोपोरेशन घटना में प्रदर्शन किया जा सकता है कि वेक्टर निर्माण करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रदान करता है। जीन लक्ष्यीकरण में SPI की उपयोगिता वेक्टर निर्माण आवेदनों की एक किस्म में यहाँ परीक्षण किया गया था। यहां जांच की सभी उदाहरणों में, SPI कुशल साबित हुई और सही पुनः संयोजक प्लाज्मिड उत्पादन किया गया था।अधिकांश मामलों में, कई विभिन्न कैसेट सही ढंग से लक्षित कर सदिश में डाला गया था। बड़े डीएनए कैसेट और वैक्टर आसानी से SPI प्रोटोकॉल में शामिल किया है और इस प्रणाली के लचीलेपन का प्रदर्शन किया गया।

एसपीआई लंबे अनुरूपता दृश्यों और रैखिक डीएनए कैसेट की phosphorothioate (PTO) संरक्षण के उपयोग पर निर्भर करता है। PTO संशोधन रैखिक डीएनए 20,21 को exonucleases के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने और लंबे समय हा बहुसंकेतन की अनुमति के लिए पुनर्संयोजन क्षमता बढ़ जाती है। हालांकि, अब oligo दृश्यों के संश्लेषण त्रुटियों विशेष रूप से हटाए गए जमते की संभावना बढ़ जाती है। वे प्रोटीन कोडिंग क्षेत्रों को कवर अगर oligo में उत्परिवर्तन विशेष रूप से हानिकारक हो सकता है। डीएनए हा भर अनुक्रमण और डाला कैसेट की पूरी लंबाई को कवर अत्यधिक किसी भी क्रम परिवर्तन के साथ क्लोन को खत्म करने की सिफारिश की है। एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ प्रणाली का उपयोग भी एक की शुरूआत से बचने के लिए सुझाव दिया हैY पीसीआर त्रुटियों। subcloning प्लाज्मिड हा की लंबाई और संरचना प्रविष्टि कैसेट के सापेक्ष अधिक महत्वपूर्ण है (डेटा) नहीं दिखाया। एक्सॉन क्षेत्रों में किसी भी म्यूटेशन सहन नहीं कर रहे हैं, जहां Knockin वैक्टर, के निर्माण की तरह विशेष रूप से संवेदनशील अनुप्रयोगों के लिए, सम्मिलन कैसेट की हा लंबी oligos से जुड़ी समस्याओं से बचने के लिए (50-120 बीपी) को छोटा किया जा सकता है। सम्मिलन कैसेट भी (प्रतिकृति की दिशा का ज्ञान उपलब्ध नहीं है) असंशोधित या दोहरी phosphorothioated छोड़ा जा सकता है। लेकिन इन मामलों में बहुसंकेतन अभी भी लंबी हा subcloning प्लास्मिड संरक्षित करने की आवश्यकता है। इस विशेष रणनीति का एक चेतावनी है कि संभावित अलग loci में एसपीआई क्लोनिंग को प्रभावित कर सकता है कि बहुसंकेतन दक्षता के कम है।

सम्मिलन कैसेट और subcloning प्लाज्मिड की लंबाई एसपीआई क्लोनिंग में एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर है। बड़ा डीएनए अणु कम कुशलता electroporate और प्रभाव फिर से दिया, संचयी हैएक ही सेल में सभी कैसेट पेश करने का quirement (डेटा) नहीं दिखाया। बहुसंकेतन छोटे सम्मिलन कैसेट के साथ सबसे कारगर है। डीएनए से बड़ा 3 केबी भी 3 केबी 30 अप करने के लिए सबसे कारगर है जो लाल मध्यस्थता ssDNA प्रसंस्करण पर एक सीमा होती है, जगह टुकड़े। 3 KB से अधिक निवेशन कैसेट resected दोहरा रहे हैं और एक बीटा स्वतंत्र मार्ग 20 के माध्यम से कम कुशलता recombine। इसलिए, सही क्लोन की पहचान करने के लिए पर्याप्त कालोनियों की स्क्रीनिंग के इन मामलों में महत्वपूर्ण हो जाता है। पुनर्संयोजन पोस्ट electroporation की एक लंबी अवधि के लिए भी मुश्किल एसपीआई अभ्यास में सही क्लोन की वसूली की संभावना बढ़ जाती है। चार छोटे कैसेट (<1.5 KB) बहुसंकेतन दक्षता प्रत्येक अतिरिक्त कैसेट के साथ कम हो जाती है, हालांकि एसपीआई प्रक्रिया के साथ एक साथ डाला जा सकता है अप करने के लिए (डेटा) नहीं दिखाया। बहरहाल, यह एक इष्टतम एसपीआई प्रयोग के परिणाम को दर्शाता है और यह कई बड़े कैसेट का उपयोग करते समय बहुसंकेतन की सीमा पर विचार करने की सलाह दी जाती है। क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता तरह जीनोम संपादन उपकरण का विकास (CRISPR) -cas9 endonuclease प्रणाली उपन्यास जीनोम संशोधनों के निर्माण के लिए सक्षम है और अधिक कुशल जीनोम इंजीनियरिंग 36 के लिए प्रेरित किया। हालांकि, इन नई प्रौद्योगिकियों जीन को लक्षित वैक्टर पूरित बजाय उन्हें supplanted है। यह CRISPR कैस प्रणाली एंटीबायोटिक चयन की जगह है और आगे मल्टीप्लेक्स recombineering प्रोटोकॉल को परिष्कृत कर सकता है कि परिकल्पना की गई है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotics except Zeocin Sigma: http://www.sigmaaldrich.com Ampicillin, A9518-5G;
Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G;
Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G
Zeocin Invivogen:  ant-zn-1 Zeocin is also available from Life technologies/Fisher
C57BL/6 BAC clones CHORI: https://bacpac.chori.org/  RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher
KOD hotstart DNA polymerase system Millipore: https://www.merckmillipore.com 71086-3
L-Arabinose Sigma: http://www.sigmaaldrich.com A3256-25G
Long oligos IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com IDT Ultramers or Gene Link long oligos PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos.
MinElute PCR purification kit Qiagen: http://www.qiagen.com  28004 Minimum elution PCR purifications kits are preferred.
QIAPrep Spin Mini Prep kit Qiagen: http://www.qiagen.com  27104 Silica column or similar matrix kits are preferred.
Restriction enzymes NEB: https://www.neb.com DpnI: R0176L See NEB website for a list of RE.

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 95 recombineering अंतर-मरम्मत प्लस प्रविष्टि transgene पीटा माउस subcloning
Subcloning प्लस निवेशन (एसपीआई) - जीन लक्ष्य निर्धारण वैक्टर का तेजी से निर्माण के लिए एक उपन्यास Recombineering विधि
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