Introduction
Utvecklingen av genmålsökning teknik har gjort det möjligt att bygga cellinjer och musmodeller för att undersöka olika biologiska system 1-3. En viktig första etapp i modifiering av en genomsekvens är design och konstruktion av en gen målvektor 4. Inriktning vektorer är plasmidkonstruktioner som bär allelen av intresse innehåller de önskade ändringarna (s) flankerad av en selektionsmarkör (t.ex. neomycin), och långa iska regioner som krävs för en effektiv homolog rekombination i däggdjursceller 5. Exakt genmodifiering uppnås genom införandet av målsökningsvektom i embryonala stamceller (ES-celler) 6 eller somatiska celler 7, varvid homolog rekombination mellan identiska sträckor av DNA-sekvens på målsökningsvektom och iska locus leder överföringen av den avsedda ändringen till genomet genom genomvandling 8. Sådan modified ES-celler kan injiceras i musblastocyster att producera avkommor (chimärer) som sedan kan överföra dessa modifierade alleler via könsceller 9. En alternativ väg för att producera transgena möss involverar mikroinjektion av en gen-expressionsvektor i encelliga mus zygoter, vilket leder till slumpmässig integration av vektorn i musgenomet 10. Traditionella metoder för vektorkonstruktion har förlitat sig på konventionella "klippa och klistra" kloning med hjälp av restriktionsenzymer och DNA-ligaser att klona de olika urvalsmarkör och genomiska fragment i en vektor ryggrad. Emellertid är en inneboende begränsande faktor av traditionell kloning placeringen och val av restriktionsställen, i synnerhet med längre DNA-sekvenser. Detta kräver ofta flera subkloning steg och även introducerar främmande DNA-sekvenser i vektorn, vilket ofta leder till en lägre verkningsgrad genmålsökning.
Recombineering (rekombinogena engineering) är ett DNA-teknik som övervinner dessa begränsningar genom homolog rekombination (HR) medierad av fag rekombinationsproteiner i E. coli-celler 11,12. Eftersom varje region av en homolog sekvens kan tjäna som ett substrat för recombineering, är de begränsningar av tillgängligheten av restriktionsställen avlägsnas. Stora DNA-sekvenser kan smidigt modifieras direkt in vivo, således även bevarar sin strukturella integritet 13. Recombineering är mycket effektivt med korta homologier (50 bp) 14 och därför homologiarmar (HA) kan lämpligen införlivas i syntetiska oligo sekvenser. I ett typiskt recombineering experiment, en oligo eller en dubbelsträngad DNA (dsDNA) fragment innehållande HA elektroporation till recombineering kompetenta E. coli-celler innehållande målet belägen antingen på kromosomen eller på en plasmid 15. Den rekombination potentialen förlänas genom inducerbart uttryck av röda recombination proteiner av fag 16,17 eller recET proteiner av rac profag 18. Den röda / RecE exonukleas omvandlar linjära dsDNA till en enda DNA (ssDNA) mellan, som sedan är bunden av sin partner, Röd / RecT, ett enkelsträngat glödgning protein (RR) 19. Glödgningen av en lång ssDNA eller en kort oligo till dess komplementära målsekvens inträffar på den släpande strängen av replikationsgaffeln och leder till införlivandet av sekvensen vid målstället. Släpande sträng ssDNA rekombination är grunden för den höga effektiviteten i recombineering och kan beskrivas med den "beta" rekombination modell 20,21.
Ett typiskt recombineering arbetsflöde för att bygga en riktad genmodifiering vektor involverar någon av de två följande vägar. En rutt innebär subkloning önskad iska regionen från en mus BAC-klon i en plasmid följt av sekventiell insättning av loxP rekombineringsställen, en selektionsmarkör
Protocol
1. Gene Targeting Design
- Beställ en lämplig BAC-klon som täcker iska regionen av intresse. Se till att det är isogen den typ av ES-celler som ska ändras t.ex. RPCI-23 och RPCI-24 BAC-kloner för riktad genmodifiering med C57BL / 6 ES-celler.
- Applicera konventionell genmålinriktning kriterier vid utformningen målsökningsvektom. Viktiga parametrar är om modifieringen måste vara konstitutiv eller villkorlig, definiera kritiska exoner (CE) för radering i en gen knockout strategi och avstånd och placering av intronic kassetter.
OBS: Var och en av dessa har diskuterats i detalj på annan plats 10. - Välj iska regioner vardera av 5-6 kb flankerande mål-modifieringen stället.
OBS: Storleken på det subklonade insatsen är därför typiskt 10-12 kb, även om den övre gränsen kan vara så hög som 80 kb med en låg kopia subkloning plasmiden som p15A, pBR322 etc. och upp till 200 kb med en BACvektor.
2. Multiplex Recombineering Oligos
- Design oligonukleotider för plasmidskelettet (subkloning plasmid) och markör (insättnings kassett). Utforma varje oligo så att den innehåller 180 bp HA flankerar genomisk målstället och 20 bp av specifik primningssekvens av insättningskassetten eller subkloning plasmiden (Figur 2).
OBS: Homologi vapen bör inte innehålla några repetitiva inslag, kommer närvaron av repetitiva element resultera i felaktig inriktning och subkloning. Repetitiva element kan detekteras med hjälp av webbaserade verktyg som '' Repetera Masker ''. - Inkludera ett unikt restriktionsenzym (RE) platsen på en av vektor oligos att linearisera genmålinriktning vektorn för ES-cell inriktning (fig 2).
- Kontrollera oligo parametrar med ett oligo analysator program. Var noga med att undvika sekundära strukturer i priming regionens.
- Kortare HA (50 bp) i insättningskassetten tolereras och ger lägre antal rekombinanter men se till att subkloningen plasmiden HA är alltid längre (180 bp).
- Bestämma orienteringen av det genomiska DNA-infogningen av den speciella BAC-klonen med användning av webbaserade verktyg som '' cloneDB ''. Upprätta riktning replikering från Oris genom att kontrollera kartan över BAC plasmidskelettet används i BAC-biblioteket konstruktionen.
OBS: Oris är oftast motsatt transkriptionsriktningen för kloramfenikol (Chl) markör för alla vanliga BAC plasmider. - Lägg två terminal fosforotioat- (PTO) obligationer till 5 'änden av oligo som är motsatt riktning replikering på BAC-klon. Lägg en 5 'fosfat modifiering till den omvända oligo (Figur 2).
OBS: Den asymmetriska phosphorothioated PCR kassett på Red matsmältning genererar en ssDNA mellan som kan prima släpar strängenav replikationsgaffeln.
OBS: Maximal multiplex rekombinationsfrekvensen observeras med släpande strängen skyddade kassetter. Ledande sträng skyddade eller dubbla skyddade kassetter får inte ge likvärdiga rekombination effektivitet vid något lokus. - Beställ oligos med PAGE eller HPLC rening.
3. BAC Klon Transformation med pSC101 BADgbaA Recombineering Plasmid.
- För att göra E. coli-stam som bär BAC recombineering skickliga, omvandla den med pSC101 BADgbaA plasmid som innehåller de röda generna 16.
OBS: pSC101 BADgbaA plasmiden innehåller de röda och RecA-generna under kontroll av den Arabinos inducerbara araC-P BAD-promotor, en tetracyklin selektionsmarkör och den temperaturkänsliga pSC101 replikon.- Sticka en steril pipett spets i BAC agar kultur och ympa 5,0 ml av lysogeni buljong (LB) pH 8,0 innehållande 12,556; g ml -1 Chl. Odla vid 37 ° C under 5 h skakning vid 200 rpm.
- Chill 10% (volym / volym) glycerollösning, mikrocentrifugrör och elektroporering kyvetter på is. Kyl en kyld stor centrifug och mikro till 4 ° C.
- Bestäm den optiska densiteten (OD) av kulturen med hjälp av en spektrofotometer och mät absorbansen vid 600 nm. Förbered elektrokompetenta celler (såsom beskrivs nedan) när en OD 600 läsning av 0,3 till 0,8 har uppnåtts.
- Centrifugera ner cellerna i en 50 ml centrifugrör i en stor centrifug vid 1216 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna med 1 ml kyld 10% glycerol och spinn ner cellerna vid 17.949 xg under 20 sek vid 4 ° C. Utför tvättsteget totalt tre gånger.
- Resuspendera cellerna i en total volym av 50 | il 10% glycerol och lägga 10-200 ng av pSC101 BADgbaA recombineering plasmiden. Skaffa en enda cellsuspension genom att pipetteraupp och ner flera gånger och sedan överföra cellerna till en i förväg kyld 1 mm spalt elektroporeringskyvett.
- Electroporate cellerna med en inställning på 1,8 kv, 25 uF och 200 Ω.
OBS: Kontrollera rätt inställningar för varje märke av elektroporator. En tidskonstant av elektroporation mindre än 4 indikerar närvaron av salt och andra orenheter. - Omedelbart återvinna cellerna i 1 ml LB och överföra cellerna till en 50 ml centrifugrör.
- Väx BAC gbaA kulturen vid 30 ° C under 2 h skakning vid 200 rpm.
OBS: pSC101 BADgbaA plasmiden förloras när celler odlas vid 37 ° C på grund av inaktivering av den temperaturkänsliga repE replikationsfaktor. Väx gbaA celler vid 30 ° C för att bibehålla de recombineering funktionerna. - Lägg 9 ml LB innehållande 12,5 ng ml -1 Chl och 4 ug ml -1 Tetracyklin (Tet) till återvunna BAC gbaA kultur. OdlaBAC gbaA kultur O / N vid 30 ° C skakning vid 200 rpm.
OBS: Transformationseffektiviteten av electroporating den supertvinnade gbaA plasmiden är tillräckligt hög för att medge mätt tillväxt O / N i flytande media.
4. Beredning av Inser Kassetter och Subkloning plasmider
- För att införliva HA i insättningskassetten (erna) och subkloning plasmiden, utföra polymeraskedjereaktion (PCR) med användning av de långa modifierade oligos såsom beskrivs nedan.
- Tillval: att förhindra plasmid överföring till recombineering reaktionen används en R6K ursprung eller liknande smalt värdområde plasmid mall för att förstärka insättningskassetten.
- Alternativt, linjärisera plasmiden mallen med en RE digest (tabell 2). Välj en RE som skär utanför PCR-amplifieringen regionen och är värmeinaktiverat. Värme inaktivera RE som rekommenderas av manufacturer.
- Ställ in polymerase chain reaction (PCR) med en high-fidelity hotstart DNA-polymeras systemet. Förbered en PCR Master Mix som beskrivs (tabell 3). Utför termisk cykling som visas (tabell 3).
- Analysera PCR-produkter med hjälp av agarosgelelektrofores. Belastning 1-5 pl av varje PCR på en 1% (vikt / volym) agarosgel innehållande 0,5 mg ml -1 Etidiumbromid (EtBr).
OBS: Närvaron av icke-specifika amplifieringsprodukter interfererar inte i recombineering reaktionen. I vissa fall kan dock primerdimerer minskar recombineering effektivitet. - Rena PCR-produkter med hjälp av en PCR-reningskit.
- Tillval: ta bort plasmiden mallen från PCR genom behandling med Dpnl följt av PCR sanering. Eluera DNA i en minimal volym sterilt avjoniserat vatten (som rekommenderas av tillverkaren).
OBS: Tillsats av Dpnl att orenat PCR reaktioner resulterar i minskad effektivitet klyvning av the metylerade plasmid-DNA-mall.
- Tillval: ta bort plasmiden mallen från PCR genom behandling med Dpnl följt av PCR sanering. Eluera DNA i en minimal volym sterilt avjoniserat vatten (som rekommenderas av tillverkaren).
- Kvantifiera PCR-amplifierat DNA genom agarosgelanalys mot en känd uppsättning DNA-standarder, t.ex., λ Hindlll digere eller genom användning av en Nanodrop spektrofotometer.
5. Subkloning Plus Inser
- Späd O / N BAC gbaA kulturen 50-faldigt genom tillsats av 200 | il i 10 ml LB + Chl + Tet. Väx vid 30 ° C under skakning vid 200 rpm under 1 h 50 min. Inkludera ett prov som skall användas som negativ kontroll.
- Chill alla recombineering material och utrustning till 4 ° C såsom beskrivits i steg 3.1.2.
- Pour LB-agar pH 8 plattor innehållande rätt koncentration av den lämpliga selektiva antibiotika (t) kommer att tillåta val av DNA-fragmentet som skall införas samt för val av subkloningsvektorn (tabell 4).
OBS: Vissa antibiotika är pH-känsliga. Använd LBagar pH 8 som regel. - Bered en 10% (vikt / volym) lösning av L-Arabinos. Filtrera sterilisera genom ett 0,2 um sprutfilter.
OBS: Arabinos inducerar uttrycket av de recombineering proteiner från gbaA plasmiden. - Kontrollera OD av BAC gbaA kulturen med hjälp av en spektrofotometer. När väl en OD 600 av 0,25-0,3 nås, inducera recombineering proteinerna såsom beskrivs i det följande steget.
- Lägg 200 pl av 10% arabinos lösning till 10 ml av BAC kulturen för att uppnå en slutlig koncentration av Arabinos av 0,2%. Inkludera en oinducerat kultur (utan Arabinos) att användas som negativ kontroll.
- Överför BAC kulturen till en 37 ° C skaka inkubator och framkalla Röd uttryck i 45 min skakning vid 230 rpm.
OBS: Uttryck av röda proteiner är ineffektivt vid 30 ° C. - Centrifugera ner cellerna och tvätta med 10% glycerol 3 gånger såsom beskrivits i steg 3.1.5.
- Lägg 600-1,000 ng vardera av subkloningen plasmiden och insättningskassetten (er) till recombineering reaktionen. Inkludera endast en vektor och vektor plus enstaka skär kontroller för att kontrollera rekombination kompetens och integritet vektorn och kassetterna.
- Skaffa en enda cellsuspension genom att pipettera upp och ned. Utför elektroporering som beskrivs i steg 3.1.7 och efterföljande återhämtning i 1 ml LB vid 37 ° C under 1 h för multi-copy-plasmider eller i 10 ml LB vid 37 ° C under 3 h för BAC-vektorer.
- Plåt olika utspädningar av återvunna kultur t.ex. 90%, 10%, 1% på de dubbla urvals agarplattor och växa vid 37 ° C under 16 h.
6. Analys av rekombinanter
- Tillval: Pick 6 till 12 kolonier och utföra koloni PCR med hjälp av en HA-flankerande primer och en insats specifik primer. Inkludera subkloningen plasmiden och insättnings cassette plasmiden liksom moder BAC-klonen som negativa kontroller.
- Utför agarosgelanalys av koloni PCR. Identifiera positiva kloner genom närvaron av ett ljust band vid den förväntade storleken.
OBS: Den höga effektiviteten av kloningsprocess SPI genererar mestadels korrekta rekombinanter.
- Utför agarosgelanalys av koloni PCR. Identifiera positiva kloner genom närvaron av ett ljust band vid den förväntade storleken.
- Plocka kolonier i 5 ml LB-pH 8 innehållande den selektiva antibiotikumet och växa O / N vid 37 ° C.
- Förbered DNA minipreps användning av en kolonn reningskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered BAC miniprep DNA med standard fenolkloroform isolering eller ett liknande protokoll.
- Utför RE digere på miniprep-DNA. Separat DNA genom agarosgelelektrofores. Analysera RE mönster för att identifiera de kloner som innehåller de förväntade fragment storlekar rätt inriktning vektorn. Välj en RI som tydligt skiljer mellan vektorn saknar insert (er) och vektorn innehållande insatsen (er).
- Optional: att få celler som saknar BAC, som fortfarande förekommer i E. coli efter recombineering använder miniprep plasmid-DNA att omvandla DH5alpha eller DH10B E. coli-celler.
- Utför DNA-sekvensering över HA och insättning kassett för att kontrollera oligo syntes fel.
Representative Results
Knockin Vektorer
Knockin målstyrningsvektorer avspeglar behovet av att införa en ny sekvens inslag i genomet inklusive enda baspar substitution i ett protein kodande region, fusion av en fluorescerande markör eller en affinitetsmarkör till ett protein eller integrering av ett genexpressionskassett. För att testa tillämpningen av SPI i Knockin vektorbyggstrategier ades två olika testfall undersöktes. Dnttip1 kodar deoxynucleotidyltransferase, terminalen, interagerande protein 1A (TDIF1) som tillsammans med klass I histondeacetylas (HDAC) bildar en mitotiska deacetylas komplex (MIDAC) 28. För att undersöka vilken roll Dnttip1 i celldelning, var en tandem affinitet tagg tillvägagångssätt för att isolera TDIF1 interagerande proteiner. Tidigare försök att subklona ett parti av Dnttip1 genen med användning av en p15A vektor innehållande långa homologiområdena gav låg gap reparationseffektiviteten till ennd frekventa avvikande rekombinationsprodukter (data visas ej). Således, konstruktionen av en knockin vektorn vid Dnttip1 lokuset förutsatt en utmanande recombineering övning. En SPI strategi utformades för att subklona ett 12 kb avsnitt av Dnttip1 genen spänner den sista exon (exon 13) till ett lågt kopia p15A vektor och att samtidigt sätta in en dubbel affinitet tagg val kassetten i exon 13, som ersätter den stoppkodonet (Figur 3A ). Den 2X FLAG-calmodulin bindande protein (CBP) kopplade FRT-PGK-Em7-Neomycin (Neo) -BGhpA-FRT kassett (2,0 kb) förstärktes från ett RE lineariserad plasmid med dubbla kraftuttags modifierade oligonukleotider som innehöll 120 HA bp flankerar Dnttip1 stoppkodon. En p15A Zeo Dnttip1 subkloningsvektor (1,7 kb) konstruerades som innehöll 200 bp regioner som är homologa med ändarna av den Dnttip1 sekvensen som skall subklonas. Den Dnttip1 subkloning plasmid RE arise och PCR förstärks med hjälp 20 bp modifierade oligonukleotidersom genererade en ledande sträng skyddad vektor. PCR-produkterna Dpnl behandlad, renades och sam-elektroporerades in recombineering kompetent Dnttip1 BAC E. coli-celler såväl som icke-inducerade kontrollceller. SPI reaktionerna ströks på Zeocin (Zeo) och kanamycin (Kan) innehållande agarplattor (Figur 3B). SPI producerade korrekt modifierade Dnttip1 knockin vektor i alla de 12 rekombinanter som analyserades (figur 3C). DNA-sekvensering verifierade frånvaron av eventuella fel till följd av oligo syntes eller PCR-amplifiering.
Ett annat exempel på SPI involverade i ram insättning av en förstärkt gult fluorescerande protein (EYFP) länkade selektionskassetten vid P2rx1 genen. Den P2rx1 genen kodar en G-proteinkopplad receptor som fungerar som ett ATP-jonkanal 29. Koppling till YFP fluorescens tillåter spårning av P2x1 receptor på cellytan i various funktionella analyser. P2rx1 är en annan svår locus som har lagt betydande problem med konventionella recombineering metoder (data visas ej). Genom att använda SPI, en 12 kb segment av P2rx1 genen omfattar det terminala exonet (exon 12) subklonades in i en p15A zeo vektor och modifierad med den samordnade insättning av en EYFP -LoxP flankerad Neo kassett ersätter stoppkodonet i exon 12 för att konstruera P2rx1-EYFP knockin vektorn (Figur 3D). I detta exempel släpar strängen skyddade p15A vektor (1,7 kb) innehöll 230 bp HA och EYFP kassetten innehöll 50 bp HA och även lämnat omodifierad. Den EYFP insättningskassetten (2,7 kb) sattes ihop genom skarvning överlappning PCR av EYFP genen, PCR amplifieras från pEYFP-C1, och LoxP- PGK-Em7-Neo-BGhpA-LoxP kassett, PCR amplifieras från pL452 (NCI, Frederick) . SPI Reaktionen producerade hundratals kolonier (data visas ej). RE analys av DNAminipreps framställda av 11 kloner visade majoriteten innehöll korrekt monterade P2rx1-EYFP Knockin vektorn (figur 3E). Ytterligare validering genom DNA-sekvense visade felfri insättning av EYFP kassetten. Men vissa av klonerna visade profilerna för den omärkta gapet repareras och de taggade gap repar plasmider i samma cell (banorna 6-9). Några prover innehöll även felaktigt gap repar (spår 2) eller mistargeted plasmider (spår 4 och 5). Misslyckandet av samtidig subkloning och inriktning i vissa SPI rekombinanter belyser gränserna för effektiv SPI kloning när stora kassetter (> 3 kb), som uppstår från de begränsningar på röd processivitet av långa DNA-fragment 30, eller om du använder kort HA. Faktum öka HA av EYFP kassetten till 200 bp ökade SPI effektivitet och den korrekta inriktningen av kassetten (data ej visade). Gene inriktning med P2rx1 - EYFP knockin vektor i JM8.N4mus ES-celler (C57BL / 6 stam) genererade 6 positiva kloner av 96, som innehöll den korrekt riktade P2rx1-EYFP sekvensen (Figur 3F).
BAC Reporter Vektorer
En BAC-klon av målgenen innehåller ofta alla nödvändiga uppströms och nedströms regulatoriska element t.ex., förstärkare, UTR etc. samt den endogena promotorn för att driva genuttryck på naturliga nivåer 31. En BAC reporter vektor är därför att föredra fordonet att rekapitulera den endogena uttrycksmönstret av en gen 32. Men den stora storleken på en BAC plasmid (upp till 200 kb) presenterar betydande praktiska problem med transfektering en intakt BAC i celler 33. Att minska storleken på BAC iska insatsen genom BAC trimning 34,35, men behåller de nödvändiga regulatoriska element av en gen, kan enklare hantering av BAC och resulterar i en effektivare transfectipå. Nuvarande BAC teknik involverar flera omgångar av recombineering att uppnå detta mål 35. För att demonstrera nyttan av SPI i BAC trimning, var en pBeloBAC11 BAC vektor som används för att subklona ett 30 kb genomsekvens inklusive fullängds P2rx1 genen från 168 kb P2rx1 BAC tillsammans med samtidig insättning av en EYFP kassett i P2rx1 genen (Figur 4A). Den pBeloBAC11 Zeo vektor ryggraden (6,5 kb) innehållande 180 bp HA PCR förstärktes med modifierade oligonukleotider som genererade en eftersläpande sträng skyddad vektor. Samma EYFP Neo kassett (3 kb), som används i den tidigare P2rx1 Knockin vektorkonstruktion, var PCR amplifieras med hjälp släpar sträng skyddade oligonukleotider innehållande 180 bp HA och riktade den P2rx1 exon 12 ersätter stoppkodonet. Efter kombinerad elektroporering av EYFP kassetten och pBeloBAC11 Zeo vektorn i P2rx1 BAC celler exprESSING de gbaA recombineering proteinerna ades odlings utvanns i 10 ml LB-pH 8 under 3 timmar vid 37 ° C för att avskilja BAC plasmider. Rena rekombinanter valdes på Zeo och Kan agarplattor och observerades med en frekvens på 2 x 10 -6. Colony PCR genotypning analys avslöjade framgångsrik BAC trimning i de tre av sex kloner som analyserades (Figur 4B). Lång räckvidd PCR-amplifiering över EYFP insättningsstället bekräftade rätt kassett ingå i de tre positiva kloner (Figur 4B). De tre klonerna som saknar EYFP insatsen var också felaktigt gap repar vid 5'-änden, även om orsaken till mistargeting av EYFP kassetten i dessa kloner kan vara separat till rätt stängningen av 5 'BAC änden. De tre EYFP positiva BAC-kloner analyserades vidare med RE klyvningar och visade ett förväntat av korrekt trimmade EYFP rekombinant BAC (Figur 4C </ Strong>). Sekvensanalys avslöjade frånvaro av fel i EYFP kassetten på bara 1 klon av de 3 positiva.
Villkorlig Knockout (CKO) Vektorer
Villkorlig ablation av genuttryck är ett viktigt verktyg för att undersöka utvecklingsprocesser eller studera biologiska system vid en viss tidpunkt. En villkorlig gen knockout strategi innebär normalt placeringen av loxP rekombinationsställen omger en kritisk exon (CE). Strykningen av ett CE på Cre uttryck eller aktivering producerar ett ramförskjutning och en tidig stoppkodon, vilket resulterar i nedbrytning av mRNA grund av nonsens medierad sönderfall (NMD). Byggandet av en villkorad genmålsökning vektor är en komplex uppgift och involverar flera steg av subkloning, inriktning och omvandling 22. SPI erbjuder en bekväm väg att förenkla denna process. Som ett testfall, var en villkorlig allel av Zrsr2 genen konstruerasanvänder SPI-metoden (figur 5A). Den Zrsr2 genen kodar för ett splits faktor och en enda kopia är belägen på X-kromosomen. Den villkorliga status gendeletion är särskilt viktigt i det här fallet för att kontrollera för möjligheten av celler anpassar sig till bristen på Zrsr2 under ES-cell val i en konstitutiv gendeletion inriktning strategi. SPI utfördes för att subklona en 10 kb del av ZrSr2 genen med samtidig insättning av två olika LoxP flankeurvals kassetter. Den FRT-PGK-Em7-Neo-FRT-LoxP kassett (2 kb) PCR-amplifierades från RE diger pL451 använder släpar sträng skyddade oligonukleotider som innehöll 180 bp HA inriktning på ZrSr2 intron 2. En andra kassett som innehåller Rox-PGK-em7- Blasticidin (BSD) -Rox-LoxP (2 kb) PCR-amplifierades från en R6K plasmid med släpande sträng skyddade oligonukleotider innehållande 180 bp HA identisk med en nedströms region intron 3. De två loxP sajter flanke exon 3, den CE vars deletion på villkor Cre aktivering resulterar i en ramförskjutning och introducerar en tidig stoppkodon. Den Zrsr2 subkloning plasmiden (1,6 kb) PCR-amplifierades från en RI lineariserad p15A zeo plasmid med användning släpar sträng skyddade oligos innehållande 180 bp HA matchande ändarna av 10 kb Zrsr2 sekvens. SPI-reaktioner utfördes såsom beskrivits tidigare och ströks ut på Zeo + Neo + Bsd plattor. Den ZrSr2 villkorlig målvektor lyckades monteras i de flesta av de 12 rekombinanter som undersöktes (figur 5B). Ytterligare DNA-sekvense analys visade korrekt insättning av både selektionsmarkörer i ZrSr2 cko vektorn.
Figur 1. SPI-kloning. Översikt av SPI kloningsprocessen kombinerar kassett införing och subkloning i ett enda steg. (A) Den BAC klon är transformed med pSC101 BADgbaA plasmiden och odlades vid 30C. (B) Efter arabinos induktion att uttrycka de röda proteinerna, är den asymmetriska modifierade insättnings kassett och subklona plasmiden införs i BAC-klon och valt med både insättning och subkloning markörer för att generera den slutliga vektorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Schematisk illustrerar utformningen av SPI recombineering oligos. Subkloningen plasmid och infogning kassett är båda genereras genom PCR med användning av en kombination av terminal kraftuttag och fosfat modifierade oligos. PCR-fragmentet på Red matsmältning in vivo, ger en ssDNA mellan, vilket parar till släpande strängen av replikationsgaffeln. Gene specifik HA av 50-180 bp införlivas i varje oligo enligt bilden. Pilen indikerar riktningen av DNA-replikation över en kandidatgen. Streckad linje representerar subkloningen plasmid sekvensen inte införlivas i PCR-produkten. RE plats, restriktionsenzymstället arise slutliga vektor; F, framåt sekvens (20 bp) specifika för subkloning plasmid eller insättnings kassett; R, omvända komplementet sekvens (20 bp) av plasmiden eller kassetten; sm, selektionsmarkör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. SPI möjliggör konstruktion av svåra Knockin vektorer. (A) Schematisk ritning av SPI strategi som används i byggandet av den Dnttip1 dubbla taggade vektor. Arrow indikerar riktning replikering på BAC-klon. (B) Plating resultaten av de icke-inducerade och inducerade prover av Dnttip1 SPI experimentet. (C) EcoRI sammandrag av Dnttip1 SPI-kloner. M, 1 kb stege (NEB); C, p15A Dnttip1 gap repar plasmid som saknade den dubbla etiketten kassetten. Fragment storlekar är: taggad, 9,2 + 4,4 + 2,2 kb; kontroll; 9.2 + 4.6 kb. (D) SPI baserade P2rx1-EYFP Knockin vektorkonstruktion. (E) EcoRI Digest of P2rx1-EYFP SPI-kloner. M, 1 kb + stege (Invitrogen); C, p15A P2rx1 gap repar plasmid som saknade den EYFP kassetten. Fragment storlekar är: taggad, 8,3 + 4,4 + 3,1 + 0,03 kb; kontroll; 8,3 + 3,1 + 1,8 + 0,03 kb (F) Southern blot-analys av P2rx1 -. EYFP riktad genmodifiering i JM8.N4 ES cellkroppar. Topplatta, Southern blot med 3 'änden sond använder PshAI digest. Visas är screening resultatet av fem kloner. Bottenplatta, Southern blot använder5 'änden sond och Spel sammandrag av positiva identifierats från 3' änden screening. PshAI RE site; S, Spel-RE site. Streckad linje representerar slutet av vektorn HA. Black box betecknar södra sond. Förväntade restriktionsfragment är, PshAI: WT, 8,9 kb; EYFP-neo, 11,5 kb; Spel:. WT, 6,9 kb; EYFP-neo, 7.6 kb Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Förenklad BAC trimning använder SPI. (A) Schematisk illustrerar begreppet BAC trimning använder SPI. Nyckel till symboler beskrivs i figur 1. (B) PCR-amplifiering över 5 'och 3' ändarna av det subklonade insatsen och över P2rx1-EYFP insertion site. Screeningen Strategin visas för varje typ av PCR. M (övre panelen), Hyperladder 25 bp, (bottenpaneler), 1 kb +; P, P2rx1 BAC; . S, pBeloBAC11 zeo subkloning plasmid (C) Hindlll-uppslutning av de tre EYFP positiva SPI BAC-kloner från (B); E, förväntad Hindlll restriktionsmönstret för trimmade EYFP BAC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Villkorlig knockout vektor generation använder SPI kloning. (A) Schematisk bild av samtidig insättning av två olika loxP flankerad urvals kassetter under subkloning av Zrsr2 allelen. Nyckel till symboler beskrivs i figur 1. (B) </ Strong> EcoRI digereringar av Zrsr2 SPI-kloner. L, 1 kb stege (NEB); C1, p15A ZrSr2 gap repar plasmid, C2, p15A ZrSr2 gap repar plasmid innehållande neo insatsen; C3, p15A ZrSr2 gap reparerade plasmiden innehåller bsd insatsen. Fragment storlekar är: cko, 7,7 + 2,9 + 2,6 + 1,6 kb; C1, 7,7 + 4,0 kb; C2, 7,7 + 4,3 + 1,6 kb; C3, 7,7 + 2,9 + 2,3 kb. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
| Nr av stegen | Konventionell recombineering rörledning en | Multiplex recombineering B |
| Steg 1 | Transformation av recombineering plasmid i BAC värd | Transformation av recombineering plasmiden in BAC värd. Beredning av inriktnings kassetter och subkloning vektorer. |
| Steg2 | Insättning av R1 / R2 Gateway kassett | Multiplex gap reparation kloning |
| Steg 3 | Införande av floxed Kan kassett | O / N-kulturen från enstaka kolonier |
| Steg 4 | Gap reparation i R3 / R4-plasmid | Plasmidberedning och verifiering |
| Steg 5 | Omvandling till Cre + E. coli | |
| Steg 6 | Plasmidberedning och verifiering | |
| Steg 7 | O / N tre-vägs Gateway reaktion | |
| Steg 8 | Transformation av tre-vägs Gateway-reaktion till DH10B E. coli-celler | |
| Steg 9 | Över natten kultur från enstaka kolonier | |
| Steg 10 | Plasmid förberedelse och sekvensverifiering | |
| b Genomsnittlig tid på 4 dagar till verifierad klon | ||
Tabell 1: Jämförelse av konventionell recombineering med SPI i byggandet av villkor knockout vektorer.
| RE-buffert | 5 pl |
| DNA | 1 ^ g plasmid eller renade PCR-produkter |
| RE | 1 pl (5 enheter eller mer) |
| TE | upp till 50 | il |
| Inkubera vid 37 ° C under minst en timme. Värm inacitvate enligt tillverkarens anvisningar | |
Tabell 2: RE Digest.
| PCR material | Slutlig koncentration |
| PCR-buffert | 1x |
| dNTP | 200 nM |
| MgSO 4 | 1,5 mM |
| Betain | 1,3 M |
| DMSO | 1% |
| Framåt primem | 200 nM |
| Omvänd primer | 200 nM |
| DNA-polymeras | 1 U |
| Mall | 10 ng multikopie plasmider eller 2.5 pl miniprep DNA för genotypning PCR |
| Vatten | upp till 50 pl en |
| a För en standard 50 pl PCR-reaktion med multikopie plasmider. Lång räckvidd genotypning PCR sattes upp i 25 pl PCR-reaktioner. | |
| PCR-betingelser | |
| 95 ° C | 2 min |
| 92 ° C | 10 sek |
| 55 ° C | 30 sek |
| 72 ° C | 30 sek |
| 30 cykler b | |
| b Cycle ingen får förlängas till 35 för BAC PCR genotypning | |
Tabell 3: PCR Set-up och villkor.
| Antibiotika | Koncentration en (ig ml -1) |
| Ampicllin | 50 |
| Blasticidin B | 40 |
| Kloramfenikol | 12,5 |
| Gentamicin | 2 |
| Hygromycin c | 30 |
| Kanamycin B | 15 |
| Tetracyklin | 4 |
| Trimetoprim c | 10 |
| Zeocin | 5 |
| en Rekommenderas för användning med BAC och multikopie plasmider när de används i kombinationer i multiplex recombineering | |
| b Blasticidin (35 ug ml -1) och kanamycin (6 ug ml -1) när de används tillsammans i kombination | |
| c Hygromycin och Trimetoprim rekommenderas inte för val med lösnummer BAC. | |
Tabell 4. Rekommenderade antibiotika koncentrationer för användning i SPI experiment.
Discussion
Konstruktion av ES cellinjer och musmodeller har historiskt involverade genmålinriktning använder plasmidkonstruktioner som innehöll den modifierade allelen 4. Däremot har byggandet av dessa komplexa gen målstyrningsvektorer visat sig vara en betydande flaskhals i tid produktion av sådana modeller. Utvecklingen av recombineering baserad vektor byggstrategier har tillåtit förbättrade vektor mönster och effektivare vektorenhet. Trots nuvarande recombineering protokoll som fortfarande involverar flera steg, kräver mellanliggande plasmidrening och använder olika bakteriestammar. Subkloning plus insättning erbjuder ett nytt sätt att vektorkonstruktion som kan utföras i en elektro händelse i den bofasta BAC värdstam. Användbarheten av SPI i genmålinriktning testades här i en mängd olika vektorkonstruktionstillämpningar. I samtliga fall som undersöktes här visade SPI att vara effektiv och den korrekta rekombinanta plasmiden producerades.I majoriteten av fallen, var de multipla olika kassetter korrekt insatt i målsökningsvektom. Stora DNA-kassetter och vektorer var lätt rymmas i SPI-protokollet och demonstrerade flexibiliteten i detta system.
SPI bygger på användning av långa homologisekvenser och fosfortioat (PTO) skydd av linjära DNA-kassetter. PTO modifiering ger skydd mot exonukleaser till linjära DNA 20,21 och den långa HA ökar rekombinationseffektivitet att tillåta multiplexering. Dock ökar syntes av längre oligo sekvenser chanserna att ackumulera fel speciellt strykningar. Mutationer i oligo kan vara särskilt skadligt om de täcker protein kodande regioner. DNA-sekvensering över HA och täcker fullängds av den insatta kassetten rekommenderas att eliminera kloner med eventuella sekvensförändringar. Användning av en high-fidelity DNA-polymeras systemet föreslås också för att undvika införandet av eny PCR fel. Längden och sammansättningen av HA av subkloning plasmiden är mer kritisk i förhållande till den hos insättningskassetten (data ej visade). För särskilt känsliga applikationer som byggandet av Knockin vektorer, där eventuella mutationer i exonregioner inte tolereras, kan HA av insättningskassetten kortas (50-120 bp) för att undvika problem i samband med långa oligonukleotider. Införings kassetten kan också lämnas omodifierade eller dubbel phosphorothioated (där kunskap om riktningen för replikering är inte tillgänglig). Men multiplexering i dessa fall fortfarande kräver långa skyddade HA subkloning plasmider. En varning för denna strategi är en sänkning av multiplexering effektivitet som potentiellt kan påverka SPI kloning vid olika loci.
Längden av införings kassetten och subkloning plasmiden är en annan viktig parameter i SPI kloning. Större DNA-molekyler electroporate mindre effektivt och effekten är kumulativ, med tanke på den reBehovet att införa alla kassetter i samma cell (data ej visade). Multiplexing är mest effektiva med mindre insättnings kassetter. DNA fragment större än 3 kb placera också en gräns för Red medierad ssDNA bearbetning, vilket är mest effektiva upp till 3 kb 30. Inser kassetter överstigande 3 kb är dubbelt resekterade och kombinera mindre effektivt via en beta oberoende väg 20. Därför blir screening av tillräckliga kolonier för att identifiera den rätta klonen viktigt i dessa fall. En längre duration av rekombination efter elektroporering ökar också chanserna för återhämtning av den korrekta klonen i svåra SPI övningar. Upp till fyra små kassetter (<1,5 kb) kan sättas in samtidigt med SPI processen, även om multiplexering effektiviteten minskar med varje ytterligare kassett (data ej visade). Detta återspeglar dock resultatet av en optimal SPI experiment och det är lämpligt att överväga gränserna för multiplexering när många stora kassetter. Utvecklingen av genomredigeringsverktyg som klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) -cas9 endonukleas systemet har möjliggjort skapandet av nya genom modifieringar och har lett till effektivare genom engineering 36. Emellertid har dessa nyare teknik kompletteras genmålinriktning vektorer stället ersatt dem. Det är tänkt att den CRISPR-cas systemet kunde ersätta antibiotikaselektion och ytterligare förfina multiplex recombineering protokollet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
|
| Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
| C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
| KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
| L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
| Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
| QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
| Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |
References
- Dovey, O. M., Foster, C. T., Cowley, S. M. Histone deacetylase 1 (HDAC1), but not HDAC2, controls embryonic stem cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 8242-8247 (2010).
- Harvey, M., et al. Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225-229 (1993).
- Waterhouse, P., et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4. Science. 270, 985-988 (1995).
- Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
- Hasty, P., Rivera-Pérez, J., Bradley, A. The length of homology required for gene targeting in embryonic stem cells. Mol. Cell. Biol. 11, 5586-5591 (1991).
- Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 317, 230-234 (1985).
- Hirata, R., Chamberlain, J., Dong, R., Russell, D. W. Targeted transgene insertion into human chromosomes by adeno-associated virus vectors. Nat. Biotechnol. 20, 735-738 (2002).
- Szostak, J. W., Orr-Weaver, T. L., Rothstein, R. J., Stahl, F. W. The double-strand-break repair model for recombination. Cell. 33, 25-35 (1983).
- Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309, 255-256 (1984).
- Fu, J., Teucher, M., Anastassiadis, K., Skarnes, W., Stewart, A. F. A recombineering pipeline to make conditional targeting constructs. Methods Enzymol. Soriano, P. M., Wassarman, P. M. 477, Academic Press. 125-144 (2010).
- Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J., Stewart, A. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123-128 (1998).
- Copeland, N., Jenkins, N., Court, D. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Testa, G., Stewart, A. Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET-recombination. Nucleic Acids Res. 27, 1555-1557 (1999).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5978-5983 (2000).
- Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nature Protoc. 4, 206-223 (2009).
- Wang, J., et al. An improved recombineering approach by adding RecA to λ red recombination. Mol. Biotechnol. 32, 43-53 (2006).
- Datta, S., Costantino, N., Court, D. L. A set of recombineering plasmids for gram-negative bacteria. Gene. 379, 109-115 (2006).
- Fu, J., et al. Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombination and facilitates direct cloning for bioprospecting. Nat. Biotechnol. 30, 440-446 (2012).
- Muyrers, J., Zhang, Y., Buchholz, F., Stewart, A. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Develop. 14, 1971-1982 (2000).
- Maresca, M., et al. Single-stranded heteroduplex intermediates in lambda Red homologous recombination. BMC Mol. Biol. 11, 54 (2010).
- Mosberg, J. A., Lajoie, M. J., Church, G. M. Lambda Red recombineering in Escherichia coli occurs through a fully single-stranded intermediate. Genetics. 186, 791-799 (2010).
- Liu, P., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Res. 13, 476-484 (2003).
- Chan, W., et al. A recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction. Nucleic Acids Res. 35, e64 (2007).
- Zhang, Y., Muyrers, J. P. P., Testa, G., Stewart, A. F. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. Nat. Biotechnol. 18, 1314-1317 (2000).
- Lee, E. C., et al. A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA. Genomics. 73, 56-65 (2001).
- Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Valenzuela, D. M., et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotechnol. 21, 652-659 (2003).
- Bantscheff, M., et al. Chemoproteomics profiling of HDAC inhibitors reveals selective targeting of HDAC complexes. Nat. Biotechnol. 29, 255-265 (2011).
- Mulryan, K., et al. Reduced vas deferens contraction and male infertility in mice lacking P2X1 receptors. Nature. 403, 86-89 (2000).
- Subramanian, K., Rutvisuttinunt, W., Scott, W., Myers, R. The enzymatic basis of processivity in lambda exonuclease. Nucleic Acids Res. 31, 1585-1596 (2003).
- Antoch, M. P., et al. Functional identification of the mouse circadian Clock gene by transgenic BAC rescue. Cell. 89, 655-667 (1997).
- Rostovskaya, M., et al. Transposon-mediated BAC transgenesis in human ES cells. Nucleic Acids Res. 40, e150 (2012).
- Giraldo, P., Montoliu, L. Size matters: use of YACs, BACs and PACs in transgenic animals. Transgenic Res. 10, 83-103 (2001).
- Hill, F., et al. BAC trimming: minimizing clone overlaps. Genomics. 64, 111-113 (2000).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36 (2005).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339, 819-823 (2013).
