Introduction
Peixe-zebra (Danio rerio) embriões têm sido amplamente utilizados como um modelo para estudar o desenvolvimento renal e doença renal policística. Há muitas vantagens na utilização do peixe-zebra como um modelo animal: a viabilidade de estudar interacções genéticas, a capacidade de usar morpholinos anti-sentido (MO) para knockdown proteína, a oportunidade para ensaiar rapidamente um grande número de embriões, e a facilidade de visualização de órgãos em fenótipos 1 larvas vivas. Os pronephros é o primeiro rim para desenvolver nos vertebrados e é funcional em peixes-zebra larval 2. A estrutura dos pronephros peixe-zebra é relativamente simples quando comparado com os metanefros de mamífero, o terceiro e último rim para desenvolver em mamíferos. O néfron é a unidade de trabalho do rim, com cada rim humano que contenham entre 500,000-1,000,000 néfrons 3,4 e cada rim do rato tendo aproximadamente 13.000 néfrons 5, o que torna difícil observar a estrutura de néfrons único in rins humanos ou do mouse. O peixe-zebra tem apenas dois nefrónios, cada nefrónio peixe-zebra e contém todos os componentes principais encontrados nos glomérulos e túbulos de ratos e seres humanos 6 e tipos de células renais especializadas semelhantes. Comparado a outros modelos de vertebrados, como Xenopus, o néfron zebrafish mais se assemelha a de néfrons mamíferos porque tem um sistema fechado 7.
Nos últimos anos, o genoma do peixe-zebra foi sequenciado, permitindo a ampla introdução de ferramentas genéticas, amplos recursos mutantes, e coleções de linhas repórter transgênicos em modelos de peixe-zebra. Os peixes-zebra pronephros formas entre 12-72 h pós fertilização (hpf) e podem ser facilmente visualizados em embriões transparentes. Proteína tumor do Wilm WT1 é um fator essencial para o desenvolvimento do rim. Linhas de peixes-zebra transgénicos que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostram GFP expression especificamente localizados em regiões pronephric em embriões de peixe-zebra, a partir de 17 hpf 8. Nephronophthisis (NPHP), uma doença do rim autossómica recessiva cística, é causada por mutações de genes NPHP 9. NPHP4 knockdown por morfolino causou a formação de cistos na Tg (wt1b: GFP). Fish 10 Portanto, este peixe transgênico é um modelo adequado para a observação de estruturas renais e formação de cistos durante o desenvolvimento do rim. Importante, a influência de moduladores de desenvolvimento do rim pode ser estudada usando esta estirpe em um tempo de trabalho e modo eficiente.
Nosso trabalho descreve o uso de Tg (wt1b: GFP) de peixe como um modelo para visualizar a formação de cistos nos rins depois de modulação gene. Usamos partida e emenda local anti-sense MOs derrubar o gene Wnt5a no peixe-zebra. Wnt5a é uma glicoproteína segregada não canónicas da família Wnt, que desempenha um papel importante no desenvolvimento de vários órgãos e pós-natal celularfunção 11. Wnt5a funciona através de vias de Wnt não canónicas, incluindo a via de polaridade celular planar (PCP), que tem sido encontrado para desempenhar um papel na divisão celular orientada durante o alongamento tubular renal. Wnt5a regula a via Wnt / PCP, formando um complexo com o receptor de tirosina cinase semelhante (Ryk), que transduz mais Wnt5a sinalização através da formação de um complexo com a proteína da polaridade celular planar VANGL 2 (Vangl2), promovendo assim a estabilidade Vangl2 12. Os defeitos na via de PCP pode resultar na divisão celular aleatória e causar a formação de quistos renais. Utilizou-se o Tg (wt1b: GFP) linha peixe-zebra para observar a formação de cistos nos rins seguinte Wnt5a knockdown. A Tg (wt1b: GFP) modelo de peixe-zebra permite imagens ao vivo e observação oportuna da estrutura renal. Após Wnt5a knockdown, formação de cistos nos rins foi encontrado com início às 24 hpf; a 72 hpf, os cistos podem ser encontrados nos glomérulos e dos túbulos proximais. Este método também poderia ser usado para screen outros genes que podem causar a formação de cistos nos rins.
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Protocol
Declaração de Ética: NOTA: Todas as experiências de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Eastern Virginia Medical School.
1. Preparação Morpholino
- Concepção e síntese de tradução-bloqueio (AUG-) e de inibição de splicing (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para o gene de interesse, conforme as instruções do fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte as informações do fabricante na Tabela 1.
NOTA: MOs são enviados como ações liofilizada em garrafas de vidro. - Adicionar alto grau de água estéril para os frascos de vidro para re-suspender OMs para uma concentração final de 25 ug / uL. Certifique-se de que o oligonucleótido esteja completamente dissolvido. Se alguns restos sólidas, aquecer o frasco contendo a solução de estoque de oligonucleótido a 65 ° C durante 5 a 10 min e agitar com vortex brevemente.
- Guardar a solução estoque MO na RT. Não armazená-los a 4 ° C ou -20 ° C; C, porque temperaturas mais baixas, pode causar o oligonucleótido MO para se ligarem à parede do recipiente. Medir a concentração da solução-mãe usando um espectrofotómetro (consulte a tabela 1) cada vez que uma nova solução de estoque MO é feita.
- Preparar a solução de trabalho de MO no dia da injecção por diluição da solução de reserva com alto grau de água esterilizada para a dose desejada. Adicionar 0,5% de vermelho de fenol para atingir uma concentração de 0,05%. Por exemplo, para fazer a solução de trabalho 5 ul com uma concentração de 15 ng / nL, adicionar solução de estoque 3 ul MO e 0,5 ul de 0,5% de vermelho de fenol para 1,5 ul de água.
NOTA: Com esta concentração de trabalho, cada gota (500 pl) de injeção contém 7,5 ng de MO e duas gotas conter 15 ng de MO.
2. Preparação do aparelho de injecção
- Vidro Compra agulhas pré-puxou (por favor, consulte a Tabela 1 para obter informações detalhadas). Como alternativa, puxe a agulha wi injeção de vidroth um puxador de agulha.
- Ligue o compressor de ar e ajuste a configuração para 50 psi de pressão. Ligue a fonte de luz microscópio de dissecação e Pico bomba de micro-injecção e ajustar as configurações da seguinte forma: segurar a pressão de 20 psi, ejetar 10 psi de pressão, valor do período de 2,5 e 100 ms gama de gating.
- Carregar o vidro pré-agulha puxada com 5 ul de solução de injecção e colocar a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Espere até que toda a solução atingir a ponta da agulha sem bolhas de ar visíveis. Inserir o suporte de agulha numa posição adequada ao lado do microscópio e inserir a agulha no suporte de vidro. Ajustar o ângulo de injecção de 45 graus.
- Traga a ponta da agulha em vista ao microscópio, de alta para fora do palco, e concentrar-se na região mais fina da ponta. Quebre a ponta da agulha com uma pinça de ponta fina.
- Coloque uma régua e um tubo capilar com diâmetro interno de 0,15 mm de lado a lado, sob o microscópio;injectar a solução em uma extremidade do tubo capilar para fazer uma coluna de líquido. Ajustar o tempo de ejecção para chegar a cada 17 gotas por 1 milímetro de comprimento da coluna de líquido, então o volume de cada gota nl é 1 (volume da gota π = raio x 2 x comprimento (coluna de líquido) / contagem (de gotas).
NOTA: Uma gota com um diâmetro de 0,1 mm dá um volume de injecção de cerca de 500 pl (volume da gota = 4/3 x π raio x 3).
3. Preparação de Fertilized embriões Zebrafish e injeção com Morpholinos
- Configure Tg (wt1b: GFP) casais reprodutores de peixes-zebra transgénicos acordo com protocolos publicados para criação de peixe-zebra padrão e manutenção. Coletar embriões após desova natural, e mantê-los em uma placa de Petri 10 centímetros cheia de água E3 (5 mM NaCl, 0.17mm KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Comece injeção MO imediatamente 13. Monitorar morfologia do embrião sob o microscópio e certifique-se de injeção MO está no um-estágio de célula, ou o mais tardar no estágio de quatro células.
- Transferir os embriões para a placa de Petri 10 centímetros com cunha em forma de agar calhas. Aspirar a água E3 extra e pressione suavemente os embriões nas calhas.
- Manipular os embriões com a micropipeta para visualizar embriões em estágio 1 de células ao microscópio de dissecação. Penetrar no cório e, em seguida, a gema para injectar uma ou duas gotas de MO na gema (1 gota = 500 pl). Transferir os embriões injectados com 10 cm de placa de Petri com água E3 e incubar a 28,5 ° C.
- Após as injeções, remover os embriões mortos e registrar o número de embriões injetados. Substitua a água E3 no prato a cada 24-48 horas.
4. Experimentos Fenótipo de resgate
- Selecione uma orthologue de outra espécie que tem uma estrutura de pares de bases principal diferente (geralmente 3-7 descasamentos de pares de bases) e é, portanto, resistentes à MO, para o salvamento. Por exemplo, neste experimento, escolhemosrato, porque a sequência de ratinho Wnt5a ARNm é diferente da sequência de peixe-zebra.
- Conceber um conjunto de iniciadores com o iniciador directo de partida no local da translação e o iniciador reverso de perto para o fim da região de codificação do ARNm. Adicionar uma sequência do promotor de T7 na extremidade 5 'da sequência iniciadora para a frente. Neste experimento, foram utilizadas as seguintes as seqüências de primers; para a frente: 5'- taa tac GAC TCA tag cta gga cta tga tgc tgc tga AGC tga a- 3 'e inverter: 5'- TCA ctt gca GAC gta ctg gtc- 3'.
- Executar um 50 ul de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) com o conjunto de iniciadores (0,5 uM de cada iniciador) concebido de cima e de 0,1 ug de ADN molde contendo a sequência de rato Wnt5a ADNc com o seguinte programa de PCR: 1 ciclo a 95 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 95 ° C (30 s), 58,5 ° C (30 segundos), 72 ° C (1 min); e passo de extensão final a 72 ° C durante 7 min.
- Depois de terminar tele de bicicleta, correr 2 l do produto da PCR em gel de agarose 1% para garantir que a banda é o tamanho certo. Purifica-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Verifique concentração de DNA com um espectrofotômetro. Armazenar o produto de PCR purificado a -20 ° C ou se utilizar directamente na tampado transcrição de ARN no passo seguinte.
- Sintetizar in vitro de mRNA tampado com um kit de síntese de ARN tampado acordo com as instruções do fabricante. Dilui-se o ARNm em 20 ul de ARNase isenta de água e determinar a concentração. Alíquota da RNA e armazenar a -80 ° C.
- No dia da injecção, preparar uma solução de trabalho do mRNA com água estéril livre de RNase. Note-se que 40 pg é geralmente a dose mais elevada de ARN em que os efeitos não específicos ou tóxicos do ARN não ocorrem. Manter a solução de trabalho em gelo. Injectar o embrião com MO e, em seguida, o mRNA de resgate, ou co-injectar os dois juntos. Por exemplo, se a concentração da prepar ARNmed no passo 4.5 é de 0,6 mg / mL, adicionar 0,67 mL de ARNm (0,4 ug) de 4,33 ul de ARNase isenta de água para fazer uma concentração final de 0,08 mg / mL, seguida de uma gota (500 pl) de cada injecção contém 40 pg do ARNm. Prepare MO como descrito na etapa 3.
5. Preparação de embriões injetados para imagens fluorescentes
- Após incubação a 28,5 ° CO / N, adicionar 0,003% de N-feniltioureia (PTU) para a água para impedir a melanização E3, que afecta a observação da estrutura pronephros utilizando microscopia de fluorescência. No entanto, não adicione PTU antes gastrulação, porque afeta o desenvolvimento embrionário precoce.
- Às 48 hpf, dechorionate manualmente os embriões com uma pinça fina. Tire fotos de 48 e 72 embriões HPF sob uma dissecção microscópio de luz.
NOTA: Estas imagens podem ser tomadas sem anestesia. - Aproximadamente 10 minutos antes da imagiologia sob o microscópio de fluorescência, anestesiar os embriões, colocando-os emuma placa de Petri contendo 10 centímetros de 160 ug / ml tamponado tricaina. Aguarde 5-10 min, e em seguida, toque levemente o peixe-zebra para confirmar que eles não se movem e, portanto, a anestesia está funcionando.
- Depois os embriões são anestesiados, montá-los em 3% metil celulose e orientá-los em uma posição propensa sob um microscópio de dissecação (consulte a Tabela 1).
- Observe a estrutura pronephros sob um microscópio de fluorescência (consulte a Tabela 1) e tirar fotos em diferentes ampliações (10x e 20x).
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Representative Results
Wnt5a derrubar foi conseguido através da introdução de tradução bloqueando MO (AUG-MO) ou exon / intron fronteira emenda MO (tala-MO) para embriões de peixes-zebra no estádio de uma célula. O AUG-MO tem como alvo o codão de iniciação e, portanto, inibe tanto a mensagem Wnt5a materna e zigótica. A tala MO-alvo o terceiro local de splice dador e inibe apenas a transcrição zigótica de Wnt5a (Figura 1A). O AUG- e morphants splice- phenocopied uns aos outros com defeitos múltiplos, incluindo a cauda para baixo eixo do corpo encaracolado e edema pericárdico (Figura 1B). Rato Wnt5a ARNm parcialmente resgata o fenótipo morphant (Figura 4B), o que demonstra que o fenótipo não é devido aos efeitos fora do alvo. A Tg (wt1b: GFP) peixes-zebra transgénicos, que expressa a GFP conduzida pelo promotor wt1b para que GFP recapitula a expressão endógena de wt1b, foi utilizado para delinear a estrutura pronephric. A Tg (WT1b: GFP) mostrou a formação de cistos peixe glomerular após Wnt5a knockdown em 48 hpf, enquanto que os embriões de controlo injectados com fenol-vermelho isolado demonstrou pronephric desenvolvimento normal, formando um glomérulo fundidos em um "U" com túbulos que se estendem lateralmente (Figura 2). Aos 72 hpf, estrutura glomerular desenvolvida com alças vasculares facilmente visualizadas, com ambos AUG- e splice-OMs desenvolvido quistos nos glomérulos e túbulos proximais (Figura 3). H & E coloração dos cortes histológicos transversais de embriões morphant 72 HPF revelou a formação de cistos, interrompido estruturas glomerular e túbulos renais dilatados (Figura 4A).
Figura 1: Projeto Morpholino e aparência microscópica luz de embriões de peixes-zebra a 72 hr pós fecundação (hpf) após injecçãocom controle de fenol-vermelho, AUG-MO, ou emenda-MO. (A) Diagrama mostrando o gene do peixe-zebra Wnt5a, a região de codificação, e as regiões abrangidas pelo AUG- e splice- MO. O Wnt5a AUG-MO foi concebido para atingir o codão de iniciação ATG para bloquear a tradução da proteína; a emenda-MO foi projetado para atingir a fronteira de exons 3 e 4. Splice-MO oligo dirigidos contra qualquer junção de processamento deverá gerar tanto uma deleção exão única completa ou parcial ou a inserção completa ou parcial intron único. Escolhemos para derrubar Wnt5a tanto com um AUG-MO, o que afeta mensagem materna e zygotic, e uma emenda-MO, que afeta apenas a transcrição zigótica, a fim de aumentar a especificidade. (B) O embrião injetado com fenol-vermelho ( controle de injeção) mostraram normais curvatura do corpo, comprimento e pericárdio. O embrião injetado com o AUG-MO mostrou estrutura para baixo encaracolado cauda e edema do pericárdio, eo embrião injetado com a emenda-MO phenocopied oaparência do embrião injectados com AUG-MO. Barra = 2 mm.
Figura 2: aparência microscópica de Fluorescência de Tg (wt1b: GFP). Embriões de peixes-zebra em 48 hpf após a injeção com controle de fenol-vermelho, Wnt5a AUG-MO ou Wnt5a Splice-MO No controle de injeção de fenol-vermelho, desenvolvimento pronephros estava completa em 48 hpf. Dois glomérulos fundidos e os túbulos proximais pode ser visto. A formação de cistos pode ser observado nos glomérulos em ambos o AUG- e splice-MO em embriões HPF 48 até ao final do desenvolvimento pronephros peixe-zebra (barra = 100 um).
Figura 3: aparência microscópica de Fluorescência de Tg (wt1b: GFP) embriões de peixes-zebra em 72 hpf após a injeção de fenol-vermelhocontrole, Wnt5a AUG-MO ou Wnt5a emenda-MO. Às 72 hpf, estrutura glomerular pode ser claramente visualizado. No controlo de injecção de vermelho de fenol, duas glomérulos fundidos e alças vasculares pode ser observada. Wnt5a knockdown resultou na formação de cistos em todas as estruturas de nefrónios que podem ser visualizadas, incluindo os glomérulos e região tubular proximal (barra = 100 um).
Figura 4: (A) H & E coloração dos cortes histológicos transversais de 72 embriões hpf morphant revelou a formação de cistos, interrompido estruturas glomerular e túbulos renais dilatadas. Arrow: glomérulos pronephric; Arrowhead: dilatada túbulo renal. Barra = 20 um. (B) O fenótipo AUG-MO poderá ser parcialmente resgatados com rato Wnt5a, resistente ao MO devido a uma diferença na estrutura primária do par de bases, Demonstrando assim que o fenótipo não era devido a efeitos fora do alvo. A diferença foi estatisticamente significativa para p <0,05 (* P <0,05 vs grupo fenol-vermelho; # P <0,05 vs AUG-MO grupo de 15 ng).
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Discussion
Doença policística dos rins (PKD) é uma das principais causas da doença renal da fase final em seres humanos e é caracterizada pela formação progressiva cisto, o alargamento renal e desenvolvimento anormal túbulo 14. Autossómica dominante de PKD (ADPKD) é uma doença genética em que a mutação de qualquer um de PKD1, que codifica policistina-1 (CP1), ou PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), resulta em doença renal policística. Muitos outros genes, especialmente aqueles que codificam proteínas que se encontram no cílio primária, são pensados para ser envolvido no desenvolvimento de quistos renais e, até agora não existe nenhuma ferramenta ideal para o rastreio destes genes. Nós descrevemos uma maneira rápida e fácil de observar a formação de cistos nos rins depois de knockdown gene no peixe-zebra. Este método pode provavelmente ser utilizados para pesquisar outros genes candidatos PKD.
Um dos pontos fortes desta técnica é sua simplicidade. Em Tg (wt1b: GFP) peixe-zebra, a expressão da GFP é nos glomérulos, túbulos e dutos, o que torna um determinadoly modelo adequado para estudar toda a estrutura renal pronephric. A Tg (wt1b: GFP) zebrafish permite a visualização direta da estrutura pronephric e formação de cistos nos rins após gene derrubar. Suspeitou-se que Wnt5a knockdown pode causar defeitos da via PCP e formação de quistos nos rins em ratinhos. No entanto, nocaute global de Wnt5a pós-natal é letal em ratinhos e não podia ser usado para observar a formação de quistos nos rins após o nascimento. Ao utilizar o método aqui descrito, num curto período de tempo, foi determinado que Wnt5a knockdown em peixes-zebra resultou na formação de quistos nos rins. Com este resultado, o próximo passo será o de gerar camundongos knockout Wnt5a específicas nos rins.
Essa técnica também tem algumas limitações. É difícil estimar a eficácia de uma boa OMs sem anticorpo, e para excluir a possibilidade de que o MO pode inibir a função de um gene irrelevante para causar o fenótipo. Experime controle Extensivents são necessários para ultrapassar estes problemas. Dois OMs distintas, a AUG-MO e o MO splice- foram usadas para avaliar Wnt5a knockdown. Ambos os morphants phenocopied uns dos outros, e injecção de ARNm de rato Wnt5a, resistente aos OMs devido a uma diferença na estrutura primária do par de bases, resgatou o fenótipo anormal, o que demonstra que o fenótipo não era devido aos efeitos de "off-alvo" da MO.
Nosso modelo demonstra que Wnt5a knockdown provoca formação de cistos nos rins em embriões de peixe-zebra. Esta metodologia pode ser empregue para testar muitos outros genes que são suspeitos de causar a formação de quistos renais, como é simples e menos demorado. Uma vez que se demonstrou que os resultados de mutação genética em formação de cistos nos rins no peixe-zebra, outros experimentos podem ser realizados para investigar os mecanismos detalhados de formação de cistos nos rins. Nesta experiência, uma vez que os ratinhos knockout Wnt5a global são pós-natal letal e não pode ser utilizado para observir formação de cistos nos rins após o nascimento, o próximo passo será o de gerar camundongos knockout Wnt5a específico de rim que utilizam o sistema Cre-lox.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH (DK093625 ao LH, e DK069909 e DK047757 para JHL) eo VA (Prémio de Mérito I01BX000820 para JHL). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Pack e Dr. Jie Ele, na Universidade da Pensilvânia Zebrafish Núcleo de prestação de apoio essencial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
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