Introduction
Zebrafish (Danio rerio) gli embrioni sono stati ampiamente utilizzati come modello per lo studio dello sviluppo del rene e rene policistico. Ci sono molti vantaggi di utilizzare zebrafish come un modello animale: la fattibilità di studiare le interazioni genetiche, la capacità di utilizzare Morpholinos antisenso (MO) per le proteine atterramento, l'opportunità di saggiare rapidamente un gran numero di embrioni, e la facilità di visualizzazione fenotipi organo in larve 1 vivono. I pronephros è il primo rene a sviluppare nei vertebrati ed è funzionale in zebrafish larvale 2. La struttura dei pronephros zebrafish è relativamente semplice rispetto alle metanefro mammiferi, la terza e ultima rene sviluppare nei mammiferi. Il nefrone è l'unità di lavoro del rene, con ogni rene umano contenente tra 500,000-1,000,000 nefroni 3,4 e ciascun rene del mouse con circa 13.000 nefroni 5, il che rende difficile osservare la struttura singola nefrone in reni umani o il mouse. Il pesce zebra ha solo due nefroni, e ogni nefrone zebrafish contiene tutti i principali componenti presenti nel glomerulo e tubuli di topi e gli esseri umani 6 e tipi di cellule renali specializzati simili. Rispetto ad altri modelli di vertebrati, come Xenopus, nefrone zebrafish assomiglia più da vicino il nefrone mammiferi perché ha un sistema chiuso 7.
Negli ultimi anni, il genoma zebrafish è stato sequenziato, permettendo l'ampia introduzione di strumenti genetici, ampie risorse mutanti, e raccolte di linee giornalista transgeniche nei modelli di zebrafish. Pronefro zebrafish forme tra 12-72 ore dopo la fecondazione (HPF) e possono essere visualizzati facilmente negli embrioni trasparenti. Proteina tumore del Wilm WT1 è un fattore essenziale per lo sviluppo del rene. Linee di zebrafish transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore wt1b Tg (wt1b: GFP) mostrano GFP espresfissione specificamente trova nelle regioni pronephric in embrioni di zebrafish, a partire dal 17 hpf 8. Nefronoftisi (NPHP), una malattia renale cistica autosomica recessiva, è causata da mutazioni di geni NPHP 9. NPHP4 atterramento da morpholino causato la formazione di cisti nel Tg (wt1b: GFP). Pesce 10 Pertanto, questo pesce transgenico è un modello adatto per osservare le strutture renali e formazione di cisti durante lo sviluppo del rene. È importante sottolineare che l'influenza di modulatori di sviluppo rene può essere studiata utilizzando questo ceppo in un tempo e manodopera modo efficiente.
Il nostro documento descrive l'uso di Tg (wt1b: GFP) pesce come modello per visualizzare rene formazione di cisti dopo la modulazione del gene. Abbiamo usato inizio e splice-site anti-senso MOs per abbattere il gene Wnt5a in zebrafish. Wnt5a è una glicoproteina secreta non canonica della famiglia Wnt che svolge un ruolo importante nello sviluppo dei vari organi e postnatale cellularefunzione 11. Wnt5a opera attraverso percorsi Wnt non canonici, tra cui il percorso di polarità planare delle cellule (PCP), che è stato trovato a svolgere un ruolo nella divisione cellulare orientato durante renale allungamento tubolare. Wnt5a regola l'/ PCP pathway Wnt formando un complesso con il recettore come tirosina chinasi (Ryk), che trasduce ulteriormente segnalazione Wnt5a formando un complesso con la proteina VANGL polarità cellulare planare 2 (Vangl2), promuovendo in tal modo la stabilità Vangl2 12. Difetti nella via PCP possono provocare divisione cellulare casuale e causare la formazione di cisti renale. Abbiamo usato il Tg (wt1b: GFP) Linea zebrafish per osservare la formazione di cisti renali dopo Wnt5a atterramento. Il Tg (wt1b: GFP) modello di zebrafish permette l'imaging dal vivo e l'osservazione puntuale della struttura del rene. Dopo Wnt5a atterramento, formazione di cisti renali è stato trovato con inizio alle 24 HPF; a 72 HPF, cisti potrebbero essere trovati nei glomeruli e tubuli prossimali. Questo metodo può essere utilizzato anche per sCreen altri geni che possono causare la formazione di cisti renali.
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Protocol
NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti gli esperimenti di zebrafish sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso la Virginia Medical School orientale.
1. Morpholino Preparazione
- Progettazione e sintesi di traduzione-bloccante (AUG-) e-giunzione inibizione (Splice-) antisenso morfolino (MO) oligonucleotidi per il gene di interesse secondo le istruzioni del produttore (Figura 1A). Si prega di consultare le informazioni del produttore nella tabella 1.
NOTA: MO vengono spediti come scorte liofilizzati in bottiglie di vetro. - Aggiungere acqua sterile alta qualità per le bottiglie di vetro per risospendere MOs ad una concentrazione finale di 25 mg / mL. Assicurarsi che l'oligonucleotide è completamente sciolto. Se alcuni resti solidi, riscaldare il flaconcino contenente la soluzione di riserva oligonucleotide a 65 ° C per 5 a 10 minuti e vortex brevemente.
- Conservare la soluzione di riserva MO a RT. Non riporli a -20 ° 4 ° C o; C perché le temperature più basse possono provocare l'oligonucleotide MO di legarsi alla parete del contenitore. Misurare la concentrazione della soluzione madre utilizzando uno spettrofotometro (fare riferimento alla Tabella 1) ogni volta che un nuovo MO soluzione madre è fatto.
- Preparare la soluzione di lavoro MO il giorno dell'iniezione diluendo la soluzione madre con acqua sterile alta qualità alla dose desiderata. Aggiungere 0,5% di fenolo-rosso per raggiungere una concentrazione di 0,05%. Ad esempio, per rendere soluzione di lavoro 5 microlitri con una concentrazione di 15 ng / nL, aggiungere 3 microlitri soluzione stock MO e 0,5 microlitri 0,5% di fenolo-rosso a 1,5 ml di acqua.
NOTA: Con questa concentrazione di lavoro, ogni goccia (500 pl) di iniezione contiene 7,5 ng di MO e due gocce contiene 15 ng di MO.
2. Preparazione del Apparato Injection
- Vetro Acquisto aghi pre-tirato (vedi Tabella 1 per informazioni dettagliate). In alternativa, tirare l'iniezione di vetro ago with un estrattore ago.
- Accendere il compressore d'aria e regolare l'impostazione di 50 psi pressione. Accendere la sorgente di luce microscopio da dissezione e Pico pompa micro-iniezione e regolare le impostazioni come segue: mantenere la pressione 20 psi, espellere pressione 10 psi, valore periodo di 2,5 e 100 msec gamma di gating.
- Caricare il bicchiere ago pre-stirato con 5 ml di soluzione di iniezione e inserire l'ago in posizione verticale con la punta rivolta verso il basso. Attendere che tutta la soluzione raggiunge la punta dell'ago con bolle d'aria visibili. Posizionare il porta-aghi in una posizione appropriata vicino al microscopio e inserire l'ago di vetro nel supporto. Regolare l'angolo di iniezione a 45 gradi.
- Portare la punta dell'ago in vista al microscopio, alta dal palco, e concentrarsi sulla regione più sottile della punta. Spezzare la punta dell'ago con una pinzetta punta fine.
- Posizionare un righello e un tubo capillare con diametro interno di 0,15 mm di lato a fianco al microscopio;iniettare la soluzione in una estremità del tubo capillare per effettuare una colonna di liquido. Regolare il tempo di espulsione per raggiungere ogni 17 gocce per 1 mm di colonna lunghezza di liquido, poi il volume di ogni goccia è 1 NL (volume goccia = π x raggio 2 x lunghezza (di colonna di liquido) / count (di gocce).
NOTA: Una goccia di diametro 0,1 mm restituisce un volume di iniezione di circa 500 pl (volume goccia = 4/3 x π x raggio 3).
3. Preparazione di fertilizzato Zebrafish embrioni e iniezione con Morpholinos
- Impostare Tg (wt1b: GFP) transgenici coppie nidificanti zebrafish secondo protocolli pubblicati per la zootecnia zebrafish di serie e la manutenzione. Raccogliere gli embrioni dopo progenie naturale, e tenerli in una piastra di Petri 10 centimetri riempito con acqua E3 (5mm NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 MgSO mm 4). Inizia iniezione MO subito 13. Monitorare dell'embrione morfologia al microscopio e assicurarsi iniezione MO è al onefase delle cellule, o al più tardi nella fase quattro celle.
- Trasferire gli embrioni di una capsula di Petri 10 centimetri con il cuneo a forma di agar depressioni. Aspirare l'acqua E3 supplementare e premere delicatamente gli embrioni nelle depressioni.
- Manipolare gli embrioni con la micropipetta di visualizzare 1-cellule di embrioni stadio sotto il microscopio da dissezione. Penetrare il corion e poi il tuorlo di iniettare una o due gocce di MO nel tuorlo (1 goccia = 500 pl). Trasferire gli embrioni iniettati di 10 cm capsula di Petri con acqua E3 e incubare a 28,5 ° C.
- Dopo le iniezioni, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituire l'acqua E3 nel piatto ogni 24-48 ore.
4. Esperimenti fenotipo di soccorso
- Selezionare un ortologo da un'altra specie che ha una diversa struttura di coppia di base principale (di solito 3-7 coppie di basi disallineamenti) ed è, quindi, resistenti al MO, per il soccorso. Ad esempio, in questo esperimento, abbiamo sceltoMouse perché la sequenza del mouse Wnt5a mRNA è differente dalla sequenza zebrafish.
- Progettare un set di primer con il primer forward partenza dal sito traslazionale e il primer reverse da vicino alla fine della regione codificante mRNA. Aggiungere una sequenza promotore T7 alla 5'fine della sequenza primer forward. In questo esperimento, abbiamo utilizzato le seguenti sequenze di primer; avanti: 5'-TAA tac gac tca tag cta cta gga tga TGC TGC tga agc tga a- 3 'e retromarcia: 5'-TCA ctt gca gac gta ctg gtc- 3'.
- Eseguire Polymerase Chain Reaction 50 microlitri (PCR) con il set di primer (0,5 mM di ciascun primer) progettati sopra e 0.1 mg DNA stampo contenente il mouse Wnt5a sequenza cDNA con il seguente programma PCR: 1 ciclo a 95 ° C per 5 min; 35 cicli di 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 minuto); e passo estensione finale a 72 ° C per 7 minuti.
- Dopo aver terminato tegli ciclo, eseguito 2 ml di prodotto di PCR su 1% gel per assicurarsi che la banda è la dimensione giusta. Purificare il prodotto di PCR con un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Controllare concentrazione di DNA con uno spettrofotometro. Conservare il prodotto di PCR purificato a -20 ° C o utilizzare direttamente capped trascrizione dell'RNA nel passaggio successivo.
- Sintetizzare in vitro capped mRNA con un kit di sintesi di RNA capped secondo le istruzioni del produttore. Diluire il mRNA in 20 microlitri RNasi acqua gratuita e determinare la concentrazione. Aliquota della RNA e conservare a -80 ° C.
- Il giorno dell'iniezione, preparare una soluzione di lavoro del mRNA con RNasi acqua sterile libera. Si noti che il 40 pg è generalmente la dose massima RNA in cui effetti non specifici o tossici del RNA non si verificano. Mantenere la soluzione di lavoro su ghiaccio. Iniettare l'embrione con MO e quindi l'mRNA di salvataggio, o co-iniezione di entrambi insieme. Ad esempio, se la concentrazione del prepar mRNAed al passo 4.5 è 0,6 mg / mL, aggiungere 0,67 ml di mRNA (0,4 mg) di 4,33 ml di acqua RNasi libero di fare una concentrazione finale di 0,08 mg / mL, allora una goccia (500 pl) di ciascuna iniezione contiene 40 pg di mRNA. Preparare MO come descritto al punto 3.
5. Preparazione di embrioni iniettati per Imaging fluorescente
- Dopo incubazione a 28,5 ° CO / N, aggiungere 0,003% N-feniltiourea (PTU) all'acqua E3 per prevenire melanizzazione, che colpisce l'osservazione della struttura pronephros mediante microscopia a fluorescenza. Tuttavia, non aggiungere PTU prima gastrulation, perché colpisce sviluppo embrionale precoce.
- Al 48 HPF, dechorionate manualmente gli embrioni con pinzette sottili. Prendere le immagini di 48 e di 72 embrioni HPF al microscopio dissezione luce.
NOTA: Queste immagini possono essere prese senza anestesia. - Circa 10 minuti prima di imaging al microscopio a fluorescenza, anestetizzare gli embrioni mettendoli inuna capsula di Petri 10 centimetri contenente 160 mg / ml tamponata Tricaine. Attendere 5-10 minuti, quindi toccare leggermente il zebrafish per verificare che non si muovono e quindi l'anestesia sta lavorando.
- Dopo gli embrioni vengono anestetizzati, montarli in 3% metilcellulosa e li orientano in posizione prona sotto un microscopio da dissezione (fare riferimento alla Tabella 1).
- Osservare la struttura pronephros sotto un microscopio a fluorescenza (fare riferimento alla Tabella 1) e scattare foto a diversi ingrandimenti (10X e 20X).
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Representative Results
Wnt5a abbattere è stato ottenuto con l'introduzione di traduzione bloccando MO (AUG-MO) o esone / introni splice confine MO (giuntura-MO) per zebrafish embrioni nella fase di una cella. Il AUG-MO rivolge il codone di inizio e, quindi, inibisce entrambi messaggio Wnt5a materna e zigotico. La giunzione-MO rivolge il terzo sito donatore di splicing e inibisce solo la trascrizione zygotic di Wnt5a (Figura 1A). Il AUG- e morphants splice- phenocopied vicenda con più difetti, tra cui la coda giù all'asse del corpo ricci e edema pericardico (Figura 1B). Mouse Wnt5a mRNA salva parzialmente il fenotipo morphant (Figura 4B), a dimostrazione che il fenotipo non è dovuto agli effetti off-target. Il Tg (wt1b: GFP) zebrafish transgenico, che esprime GFP guidato dal promotore wt1b in modo che la GFP ricapitola espressione endogena di wt1b, è stato utilizzato per descrivere la struttura pronephric. Il Tg (WT1b: GFP) pesci mostrato formazione di cisti glomerulare dopo Wnt5a knockdown a 48 HPF, che gli embrioni di controllo iniettati con fenolo-rosso alone visualizzata normale sviluppo pronephric, formando un glomerulo fuso a forma di "U" con tubuli che si estendono lateralmente (figura 2). Al 72 HPF, struttura glomerulare ulteriormente sviluppato con passanti vascolari facilmente visualizzati, sia con AUG- e giunzione-MOS sviluppato cisti nel glomeruli e tubuli prossimali (Figura 3). H & E colorazione delle sezioni istologiche trasversali di 72 HPF embrioni morphant rivelato la formazione di cisti, interrotto strutture glomerulari e tubuli renali dilatati (Figura 4A).
Figura 1: il design e la luce Morpholino aspetto microscopico di embrioni di zebrafish a 72 ore dopo la fecondazione (HPF) in seguito ad iniezionecon il controllo fenolo-rosso, agosto-MO, o giunzione-MO. (A) Schema del gene zebrafish Wnt5a, la regione codificante, e le regioni oggetto di tale AUG- e splice- MO. Il Wnt5a AUG-MO è stato progettato per indirizzare il codone di inizio ATG per bloccare traduzione delle proteine; la giunzione-MO è stato progettato per indirizzare il confine di esoni 3 e 4. Splice-MO oligo dirette contro qualsiasi giunzione giunzione si prevede di generare sia una delezione dell'esone singolo completo o parziale o di un inserimento totale o parziale introne unico. Abbiamo scelto di abbattere Wnt5a sia con un AUG-MO, che colpisce il messaggio materna e zigotica, e una giunta-MO, che riguarda solo la trascrizione zygotic, al fine di migliorare la specificità. (B) L'embrione iniettato con fenolo-rosso ( controllo dell'iniezione) ha mostrato curvatura normale del corpo, la lunghezza e il pericardio. L'embrione iniettato con l'AUG-MO ha mostrato la struttura verso il basso ricci coda e edema pericardico, e l'embrione iniettato con la giunzione-MO phenocopied ilaspetto dell'embrione iniettato con AUG-MO. Bar = 2 mm.
Figura 2: Fluorescenza aspetto microscopico di Tg (wt1b: GFP). Zebrafish embrioni a 48 HPF dopo l'iniezione con controllo di fenolo-rosso, Wnt5a AUG-MO o Wnt5a Splice-MO Nel controllo iniezione di fenolo-rosso, sviluppo pronephros era completa a 48 hpf. Due glomeruli fuse e tubuli prossimali può essere visto. Formazione di cisti può essere osservato in glomeruli sia nel AUG- e giunzione-MO embrioni a 48 HPF entro la fine del pronephros zebrafish sviluppo (bar = 100 micron).
Figura 3: fluorescenza aspetto microscopico di Tg (wt1b: GFP) zebrafish embrioni a 72 HPF dopo l'iniezione con fenolo-rossoControllo, Wnt5a AUG-MO o Wnt5a giunzione-MO. A 72 HPF, struttura glomerulare può essere chiaramente visualizzato. Nel controllo iniezione di fenolo-rosso, due glomeruli fusi e loops vascolari può essere osservato. Wnt5a atterramento portato formazione di cisti in tutte le strutture nefrone che possono essere visualizzati, tra cui i glomeruli e regione del tubulo prossimale (bar = 100 micron).
Figura 4: (A) H & E colorazione delle sezioni istologiche trasversali di 72 embrioni hpf morphant rivelato la formazione di cisti, interrotto strutture glomerulari e tubuli renali dilatati. Freccia: glomeruli pronephric; freccia: dilatato tubulo renale. Bar = 20 micron. (B) Il fenotipo AUG-MO potrebbe essere parzialmente salvato con il mouse Wnt5a, resistente alla MO a causa di una differenza nella struttura di coppie base principale, Dimostrando in tal modo che il fenotipo non era dovuta agli effetti off-target. La differenza era statisticamente significativa a p <0,05 (* P <0.05 vs gruppo fenolo-rosso; # P <0.05 vs AUG-MO gruppo 15 ng).
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Discussion
Rene policistico (PKD) è una delle principali cause di malattia renale allo stadio terminale nell'uomo ed è caratterizzata da progressiva formazione di cisti, l'allargamento renale, e lo sviluppo tubulo anormale 14. Autosomica dominante PKD (ADPKD) è una malattia genetica in cui la mutazione di una PKD1, codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, codifica policistina-2 (PC2), i risultati di reni policistiche. Molti altri geni, in particolare quelli che codificano proteine che si trovano nel cilium primario, si pensa di essere coinvolto nello sviluppo di cisti renali, e finora non c'è strumento ideale per lo screening di questi geni. Descriviamo un modo veloce e facile da osservare la formazione di cisti renali dopo atterramento gene in zebrafish. Questo metodo può probabilmente essere usato per lo screening altri geni candidati PKD.
Uno dei punti di forza di questa tecnica è la sua semplicità. In Tg (wt1b: GFP) zebrafish, l'espressione della GFP è in glomeruli, tubuli e dotti, che lo rende un particolarely modello adatto per studiare l'intera struttura del rene pronephric. Il Tg (wt1b: GFP) zebrafish permette la visualizzazione diretta delle strutture pronephric e formazione di cisti renali dopo gene abbattere. Si sospettava che Wnt5a atterramento potrebbe causare difetti PCP pathway e formazione di cisti renali nei topi. Tuttavia, knockout globale di Wnt5a è postnatale letali nei topi e non poteva essere usato per osservare la formazione di cisti renali dopo la nascita. Utilizzando il metodo descritto qui, in un breve periodo di tempo è stato stabilito che Wnt5a atterramento in zebrafish provocato formazione di cisti renali. Con questo risultato, il prossimo passo sarà quello di generare renali specifici topi knockout Wnt5a.
Questa tecnica ha anche alcune limitazioni. È difficile valutare l'efficacia di MOs senza una buona anticorpi, ed esclude la possibilità che la MO potrebbe inibire la funzione di un gene irrilevante per causare il fenotipo. Ampia experime Controllonti sono tenuti a superare questi problemi. Due MO distinti, il AUG-MO e la splice- MO sono stati utilizzati per valutare Wnt5a atterramento. Entrambi morphants phenocopied vicenda, e l'iniezione di topo Wnt5a mRNA, resistente alle MOs a causa di una differenza nella struttura di coppie base principale, salvo il fenotipo anormale, dimostrando che il fenotipo non era dovuto a effetti "off-target" del MO.
Il nostro modello dimostra che Wnt5a atterramento provoca rene formazione di cisti in embrioni di zebrafish. Questo metodo può essere impiegato per testare molti altri geni che sono sospettati di provocare la formazione di cisti renali, come è semplice e richiede meno tempo. Una volta che si è dimostrato che i risultati della mutazione genica dei reni formazione di cisti in zebrafish, ulteriori esperimenti possono essere condotti per indagare i meccanismi specifici di formazione di cisti renali. In questo esperimento, poiché le Wnt5a topi knockout globale sono postnatale letali e non possono essere utilizzate per observire rene formazione di cisti dopo la nascita, il prossimo passo sarà quello di generare specifici rene topi knockout Wnt5a utilizzando il sistema Cre-lox.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIH (DK093625 di LH e DK069909 e DK047757 a JHL) e la VA (Merit Award I01BX000820 a JHL). Vorremmo ringraziare il Dr. Michael Pack and Dr. Jie Egli presso l'Università della Pennsylvania Zebrafish core per fornire supporto essenziale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
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