Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של Published: December 2, 2014 doi: 10.3791/52156
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 2
1Department of Medicine, Eastern Virginia Medical School, 2Department of Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Pediatrics, University of Michigan

Introduction

עוברי דג הזברה (Danio rerio) היו בשימוש נרחב כמודל ללימוד פיתוח כליות ומחלת כליות פוליציסטיות. ישנם יתרונות רבים לשימוש דג הזברה כמודל חיה: את הכדאיות של חקר אינטראקציות גנטיות, את היכולת להשתמש בmorpholinos antisense (MO) למציאת חלבון, הזדמנות assay במהירות מספר גדול של עוברים, ואת הקלות של צפייה פנוטיפים איבר ב חיים זחלים 1. כִּליַת רֵאשִׁית היא הכליה הראשונה לפתח בבעלי חוליות ופונקציונלי בדג הזברה זחל 2. המבנה של דג הזברה כִּליַת רֵאשִׁית בהשוואה פשוט יחסית לmetanephros היונקים, הכליות שלישי ואחרונה להתפתח ביונקים. נפרון הוא יחידת העבודה של הכליות, עם כל כליה אנושית המכילה בין 500,000-1,000,000 nephrons 3,4 וכל כליה עכבר יש כ -13,000 nephrons 5, ולכן קשה להבחין מבנה נפרון יחיד in כליות אדם או לעכבר. יש דג הזברה רק שני nephrons, וכל נפרון דג הזברה מכיל את כל הרכיבים העיקריים נמצאים בglomerulus והצינוריות של עכברים ובני אדם 6 וסוגי תאים דומים מתמחים כליות. בהשוואה לדגמי חוליות אחרות כגון Xenopus, נפרון דג הזברה דומה יותר נפרון היונקים כי יש לו מערכת סגורה 7.

בשנים האחרונות, הגנום דג הזברה כבר רצף, המאפשר היכרות הרחבה של כלים גנטיים, מוטציה משאבים נרחבים, ואוספים של קווי כתב מהונדסים בדגמי דג הזברה. כִּליַת רֵאשִׁית דג הזברה הצורות בין 12-72 לאחר שעה ההפריה (hpf) וניתן דמיינו בקלות בעוברים השקופים. חלבון הגידול של וילם WT1 הוא גורם חיוני להתפתחות כליות. קווי דג הזברה מהונדסים מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן wt1b Tg (wt1b: GFP) להראות expre GFPssion ממוקם דווקא באזורי pronephric בעוברי דג הזברה, החל מ -17 hpf 8. Nephronophthisis (NPHP), מחלת כליות פיברוזיס אוטוזומלית רצסיבית, נגרמת על ידי מוטציות של גני NPHP 9. NPHP4 מציאה על ידי morpholino גרם היווצרות ציסטה בTg (wt1b: GFP). דגי 10 לכן, דג מהונדס זה הוא מודל מתאים להתבוננות מבני כליות והיווצרות ציסטה במהלך התפתחות כליות. חשוב לציין, את ההשפעה של מאפננים של פיתוח כליות ניתן ללמוד באמצעות זן זה בזמן ובאופן יעיל עבודה.

העיתון שלנו מתאר את השימוש בTg (wt1b: GFP) דגים כמודל לדמיין היווצרות ציסטה בכליות לאחר אפנון הגן. אנחנו השתמשנו נגד תחושה-אתר שחבור ההתחלה וMOS להפיל את גן wnt5a בדג זברה. Wnt5a הוא גליקופרוטאין מופרש הלא קנוניה של משפחת Wnt שממלא תפקיד חשוב בהתפתחות איברים ולאחר לידה סלולרית שוניםפונקציה 11. Wnt5a עובד דרך מסלולי Wnt הלא קנוניות, כוללים מסלול קוטבי תא מישוריים (PCP), שכבר נמצא לשחק תפקיד בחלוקת תא אוריינטציה במהלך התארכות צינורי כליות. Wnt5a מסדיר את המסלול / PCP Wnt על ​​ידי יצירה מורכבת עם קולטן כמו טירוזין קינאז (ריק), אשר transduces איתות Wnt5a נוסף על ידי יצירה מורכבת עם חלבוני VANGL קוטביות תא מישוריים 2 (Vangl2), ובכך לקדם יציבות Vangl2 12. פגמים במסלול PCP יכולים לגרום לחלוקת תא אקראית ולגרום להיווצרות ציסטה בכליה. אנחנו השתמשנו Tg (wt1b: GFP) קו דג הזברה להתבונן היווצרות ציסטה בכליות הבאות מציאה wnt5a. Tg (wt1b: GFP) מודל דג הזברה מאפשר הדמיה חיה ותצפית בזמן של מבנה כליות. לאחר מציאה wnt5a, היווצרות ציסטה בכליות נמצאה מתחילה ב 24 hpf; בגיל 72 hpf, ניתן היו למצוא ציסטות בglomeruli וtubules הפרוקסימלי. שיטה זו יכולה לשמש גם ליםקרין גנים אחרים שעלולים לגרום להיווצרות ציסטה בכליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה כל ניסויי דג הזברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית הספר לרפואת וירג'יניה מזרח.

1. הכנת Morpholino

  1. עיצוב ולסנתז תרגום חסימה (AUG-) וoligonucleotides morpholino אנטי תחושת עיכוב אחוי (Splice-) (MO) לגן של עניין בהתאם להוראות יצרן (איור 1 א). אנא ראה מידע של היצרן בטבלה 1.
    הערה: MOS נשלחים כמניות lyophilized בבקבוקי זכוכית.
  2. מוסיף מים סטריליים בדרגה גבוהה לבקבוקי הזכוכית מחדש להשעות MOS לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / μl. ודא שoligonucleotide הוא נמס לגמרי. אם כמה שרידים מוצקים, לחמם את הבקבוקון המכיל את פתרון oligonucleotide המניה על 65 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות ובקצרה מערבולת.
  3. אחסן את פתרון מניות MO ב RT. אין לאחסן אותם על 4 מעלות צלזיוס או -20 °; C בגלל טמפרטורות נמוכות עלולות לגרום לoligonucleotide MO להיקשר לקיר מיכל. למדוד את הריכוז של פתרון המניות באמצעות ספקטרופוטומטר (עיין טבלת 1) בכל פעם שפתרון מניות MO חדש הוא עשה.
  4. הכן את הפתרון עובד MO ביום ההזרקה על ידי דילול פתרון המניות עם מים סטריליים בדרגה גבוהה למינון הרצוי. הוסף 0.5% פנול-אדום כדי להגיע לריכוז של 0.05%. לדוגמא, כדי להפוך את הפתרון עובד 5 μl עם ריכוז של 15 ng / NL, להוסיף 3 פתרון מניות μl MO ופנול-אדום 0.5 μl 0.5% לרמה של 1.5 μl מים.
    הערה: עם ריכוז עבודה זו, כל טיפה (500 pl) של הזרקה מכילה 7.5 ננוגרם של MO ושתי טיפות מכילות 15 ng של MO.

2. הכנת מכשירי ההזרקה

  1. זכוכית רכישה מראש משכה מחטים (ראה טבלת מס '1 למידע מפורט). לחלופין, למשוך את wi מחט זריקת הכוסth חולץ מחט.
  2. הפעל את מדחס האוויר ולהתאים את לחץ הגדרה ל -50 psi. הפעל את המקור לנתח מיקרוסקופ אור ומשאבת הזרקת מיקרו פיקו ולהתאים את ההגדרות באופן הבא: החזק את לחץ 20 psi, להוציא לחץ 10 psi, ערך תקופה של טווח 2.5 ו -100 μsec של gating.
  3. טען את זכוכית מחט מראש משכה-עם 5 μl של פתרון ההזרקה ולמקם את המחט במצב אנכי עם הקצה כלפי מטה. חכה עד שכל הפתרון מגיע קצה המחט ללא בועות אוויר נראות לעין. מניחים את בעל המחט בעמדה מתאימה בסמוך למיקרוסקופ ולהכניס את מחט הזכוכית לתוך המחזיק. כוון את זווית הזריקה ל -45 מעלות.
  4. להביא את קצה המחט לעין מתחת למיקרוסקופ, גבוהה מהבמה, ולהתמקד באזור הדק ביותר של הקצה. לשבור את קצה המחט עם פינצטה נקודה עדינה.
  5. הנח שליט וצינור נימים עם קוטר פנימי של צד מ"מ 0.15 על ידי צד מתחת למיקרוסקופ;להזריק את התמיסה לתוך קצה אחד של צינור הנימים לעשות עמודת נוזל. התאם את זמן השליפה להגיע לכל 17 טיפות לכל עמודת נוזל אורך 1 מ"מ, ולאחר מכן את עוצמת הקול של כל טיפה היא nl 1 (ירידה = π x רדיוס 2 אורך x (/ ספירה (טיפות) נפח של טור נוזלי).
    הערה: ירידה בקוטר של 0.1 מ"מ נותנת נפח הזרקה של כ -500 pl (ירידת נפח = 4/3 x π x רדיוס 3).

3. הכנת מופרת עוברי דג הזברה והזרקה עם Morpholinos

  1. הגדר את Tg (wt1b: GFP) זוגות רבייה דג הזברה מהונדסים על פי פרוטוקולים שפורסמו לגידול דג הזברה סטנדרטי ותחזוקה. איסוף עובר אחרי שרצים טבעי, ולשמור אותם בצלחת פטרי 10 סנטימטרים מלאים במי E3 (5 מ"מ NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 מ"מ CaCl 2, 0.33 מ"מ MgSO 4). התחל הזרקת MO מייד 13. צג מורפולוגיה עובר מתחת למיקרוסקופ ולעשות הזרקת MO בטוחה היא בחדשלב תא, או לא יאוחרו משלב ארבעה התאים.
    1. מעביר את העוברים לצלחת פטרי 10 סנטימטר עם טריז בצורה אגר שקתות. לשאוב המים E3 נוספים ולחץ בעדינות את העוברים לשקתות.
    2. מניפולציות עובר עם micropipette לדמיין עובר שלב 1-תא מתחת למיקרוסקופ לנתח. לחדור סיסית ואז החלמון להזריק טיפה אחת או שתיים של MO בחלמון (הירידה של 1 = 500 pl). מעביר את העוברים הוחדרו לצלחת פטרי 10 סנטימטר עם מים E3 ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר הזריקות, להסיר את העוברים המתים ולהקליט את מספר העוברים מוזרקים. החלף את המים E3 בצלחת בכל 24 עד 48 שעות.

4. ניסויי הפנוטיפ הצלה

  1. בחר orthologue ממין אחר שיש לו מבנה זוג בסיס העיקרי שונה (בדרך כלל 3-7 חוסר התאמה זוג בסיס), והוא, לכן, עמיד לMO, להצלה. לדוגמא, בניסוי זה, בחרנועכבר בגלל רצף העכבר Wnt5a mRNA שונה מרצף דג הזברה.
  2. עיצוב פריימר שנקבע עם פריימר קדימה מתחיל באתר translational ופריימר ההפוכה בסמוך לסוף אזור קידוד mRNA. הוסף רצף אמרגן T7 ב5'- סוף רצף פריימר קדימה. בניסוי זה, השתמשנו ברצפי פריימר הבאים; קדימה: 5'- TAA מיקס GAC TCA תג CTA GGA CTA TGA TGC TGC TGA TGA AGC a- 3 'ולהפוך: 5'- TCA CTT GCA GAC gta CTG gtc- 3'.
  3. בצע תגובת 50 μl שרשרת פולימראז (PCR) עם סט פריימר (0.5 מיקרומטר של כל צבע יסוד) נועד לעיל ו0.1 מיקרוגרם תבנית ה- DNA המכיל את רצף עכבר Wnt5a cDNA עם תכנית ה- PCR הבאה: מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 35 מחזורים של 95 ° C (30 שניות), 58.5 ° C (30 שניות), 72 ° C (1 דקות); וצעד ​​ארכה סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
  4. לאחר שסיימתי את tהוא מעגל, לרוץ 2 μl של מוצר ה- PCR על 1% agarose ג'ל כדי לוודא את הלהקה היא בגודל הנכון. לטהר את מוצר ה- PCR עם ערכת טיהור PCR על פי הוראות יצרן. בדוק ריכוז ה- DNA עם ספקטרופוטומטר. אחסן את מוצר ה- PCR מטוהר ב -20 ° C או להשתמש ישירות בשעתוק RNA כתרים בשלב הבא.
  5. לסנתז במבחנה כתרים mRNA עם ערכת סינתזת RNA כתרים על פי הוראות היצרן. לדלל את mRNA ב -20 מים חופשיים RNase μl ולקבוע את הריכוז. Aliquot RNA ולאחסן ב -80 ° C.
  6. ביום ההזרקה, להכין פתרון עבודה של mRNA עם מים סטריליים חופשיים RNase. שים לב כי 40 pg הוא בדרך כלל מינון RNA הגבוה ביותר שבי השפעות ספציפיות או רעילות של RNA אינן מתרחשות. שמור את הפתרון עובד על קרח. להזריק את העובר עם MO ולאחר מכן mRNA ההצלה, או שיתוף להזריק את שניהם יחד. לדוגמא, אם הריכוז של prepar mRNAed בשלב 4.5 הוא 0.6 מיקרוגרם / μl, להוסיף 0.67 μl של mRNA (0.4 מיקרוגרם) ל4.33 μl של מים חופשיים RNase לעשות ריכוז סופי של 0.08 מיקרוגרם / μl, אז טיפה אחת (500 pl) של כל זריקה מכילה 40 pg של mRNA. הכן MO כמתואר בשלב 3.

5. הכנת עוברים מוזרקים להדמית פלורסנט

  1. לאחר דגירה על 28.5 מעלות CO / N, להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למים E3 כדי למנוע melanization, אשר משפיע על תצפית של מבנה כִּליַת רֵאשִׁית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, אל תוסיף PTU לפני gastrulation, כי זה משפיע על התפתחות עוברית מוקדמת.
  2. ב 48 hpf, dechorionate ידני את העוברים עם פינצטה בסדר. קח תמונות של 48 ו -72 עוברים hpf תחת מיקרוסקופ לנתיחה אור.
    הערה: ניתן לצלם תמונות אלה ללא הרדמה.
  3. כ 10 דקות לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להרדים את העוברים על ידי הצבת אותם לצלחת פטרי 10 סנטימטרים המכילה 160 מיקרוגרם / מיליליטר Tricaine נאגר. חכה למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן באורח קל לגעת בדג הזברה כדי לוודא שהם לא זזים ולכן ההרדמה עובדת.
  4. לאחר העוברים מורדמים, לעגן אותן ב- 3% תאית מתיל ומכוון אותם במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתח (אנא עיינו בטבלת 1).
  5. שים לב למבנה כִּליַת רֵאשִׁית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אנא עיין בטבלת 1) ולצלם בהגדלה שונה (10X ו20X).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wnt5a להפיל הושג על ידי החדרת תרגום חסימת MO (אוגוסט-MO) או אחוי גבול אקסון / אינטרון MO (אחוי-MO) לעוברי דג הזברה בשלב תא אחד. האוג-MO מטרות קודון ההתחלה, ולכן, מעכב שניהם הודעת wnt5a האימהית וzygotic. אחוי-MO מטרות אתר תורם אחוי השלישי ומעכב את תמליל zygotic רק של wnt5a (איור 1 א). AUG- וmorphants splice- phenocopied אחד את השני עם מומים מרובים, כוללים ציר מתולתל זנב למטה גוף ובצקת קרום הלב (איור 1). עכבר Wnt5a mRNA חלקית מציל את הפנוטיפ morphant (איור 4), הוכחה כי הפנוטיפ אינו נובע מהשפעות חוץ-יעד. Tg (wt1b: GFP) דג הזברה המהונדס, המבטא GFP מונע על ידי האמרגן wt1b כך שGFP משחזר ביטוי אנדוגני של wt1b, שימש להתוות את מבנה pronephric. Tg (wt1ב: GFP) דגים הראו היווצרות ציסטה גלומרולרי לאחר מציאה wnt5a ב 48 hpf, בעוד עוברי שליטה הזריקו עם פנול-אדום לבד מוצג פיתוח pronephric נורמלי, ויצר glomerulus התמזגו בצורה "U" עם צינוריות שמרחיבות רוחבי (איור 2). בגיל 72 hpf, מבנה גלומרולרי פיתוח נוסף עם לולאות כלי דם דמיינו בקלות, עם שני AUG- ואחוי-MOS פיתח ציסטות בglomeruli וtubules הפרוקסימלי (איור 3). צביעת H & E של הסעיפים היסטולוגית הרוחביים של עוברי morphant 72 hpf חשפה היווצרות ציסטה, שיבש מבני גלומרולרי וtubules כליות מורחבים (איור 4 א).

איור 1
איור 1: עיצוב Morpholino ומראה מיקרוסקופי אור של עוברי דג הזברה ב 72 שעות שלאחר הפריה (hpf) לאחר הזרקהעם שליטת פנול-אדום, אוגוסט-MO, או אחוי-MO. (א) תרשים המראה את גן דג הזברה wnt5a, אזור הקידוד, ואזורים שהותקפו על ידי AUG- וMO splice-. Wnt5a האוג-MO נועד למקד את קודון התחלת ATG לחסום תרגום חלבון; אחוי-MO נועד למקד את הגבול של אקסונים 3 ו -4 אוליגו אחוי-MO המכוונים נגד כל צומת אחוי צפויה לייצר או מחיקה מלאה או חלקית אחת אקסון או הכנסת אינטרון אחת מלאה או חלקית. בחרנו להפיל wnt5a עם שני אוג-MO, אשר משפיע על הודעה אימהית וzygotic, ואחוי-MO, אשר משפיע על תמליל zygotic בלבד, על מנת לשפר את הספציפיות. (ב) העובר מוזרק עם פנול-אדום ( שליטת הזרקה) הראתה עקמומיות גוף, אורך וקרום לב נורמלי. העובר מוזרק עם האוג-MO הראה מבנה כלפי מטה מתולתל זנב ובצקת קרום הלב, ואת העובר מוזרק עם אחוי-MO phenocopiedהופעתו של העובר מוזרק עם האוג-MO. בר = 2 מ"מ.

איור 2
איור 2: הופעת הקרינה מיקרוסקופית של Tg (wt1b: GFP). עוברי דג הזברה ב 48 hpf לאחר הזרקה עם שליטת פנול-אדום, wnt5a אוג-MO או wnt5a אחוי-MO בשליטת פנול-אדום ההזרקה, פיתוח כִּליַת רֵאשִׁית היה מלא ב 48 hpf. שתי glomeruli התמזגה וtubules הפרוקסימלי ניתן לראות. היווצרות ציסטה ניתן לצפות בglomeruli בשני AUG- ואחוי-MO עוברים בHPF 48 עד סוף פיתוח דג הזברה כִּליַת רֵאשִׁית (בר = 100 מיקרומטר).

איור 3
איור 3: הופעת הקרינה מיקרוסקופית של Tg (wt1b: GFP) עוברי דג הזברה ב 72 hpf לאחר הזרקה עם פנול-אדוםשליטה, wnt5a אוג-MO או wnt5a אחוי-MO. בגיל 72 hpf, מבנה גלומרולרי ניתן בבירור דמיין. בשליטת פנול-אדום ההזרקה, שתי glomeruli התמזגה ולולאות של כלי דם יכולים להיות שנצפו. מציאה Wnt5a הביאה היווצרות ציסטה בכל מבני נפרון שיכול להיות דמיינו, כולל glomeruli והאזור הפרוקסימלי צינורי (בר = 100 מיקרומטר).

איור 4
איור 4: (א) צביעת H & E של הסעיפים היסטולוגית הרוחביים של 72 עוברי morphant hpf חשפה היווצרות ציסטה, שיבש מבני גלומרולרי וtubules כליות מורחבים. חץ: glomeruli pronephric; ראש חץ: מורחב אבובית כליה. בר = 20 מיקרומטר. (B) פנוטיפ האוג-MO ניתן היה להציל באופן חלקי עם העכבר Wnt5a, עמיד לMO בשל הבדל במבנה זוג בסיס העיקרי, ובכך להוכיח כי פנוטיפ לא היה בשל השפעות חוץ-יעד. ההבדל היה משמעותי מבחינה סטטיסטית בp <0.05 (* P <0.05 לעומת קבוצת פנול-אדום; # P <0.05 לעומת קבוצת 15 ng האוג-MO).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחלת כליות פוליציסטיות (PKD) היא אחד מהגורמים העיקריים למחלת כליות סופנית בבני אדם ומאופיין בהיווצרות מתקדמת ציסטה, הרחבת כליות, ופיתוח אבובית נורמלי 14. PKD אוטוזומלית הדומיננטי (ADPKD) הוא מחלה גנטית שבו מוטציה של שני PKD1, קידוד polycystin-1 (PC1), או PKD2, קידוד polycystin-2 (PC2), תוצאות בכליות פוליציסטיות. גנים רבים אחרים, במיוחד אלה קידוד חלבונים הנמצאים בcilium העיקרי, הם חשבו להיות מעורבים בפיתוח של ציסטות בכליות, ועד כה אין כלי אידיאלי לסינון גנים אלה. אנו מתארים את דרך מהירה וקלה להתבונן היווצרות ציסטה בכליות לאחר מציאה גן בדג זברה. סביר להניח שיטה זו יכולה לשמש מסך הגנים PKD המועמד אחרים.

אחד היתרונות של שיטה זו היא הפשטות שלו. בTg (wt1b: GFP) דג הזברה, הביטוי של GFP הוא בglomeruli, tubules וצינורות, שהופך אותו במיוחדמודל המתאים ly ללמוד את מבנה כליות pronephric כולו. Tg (wt1b: GFP) דג הזברה מאפשרת הדמיה ישירה של מבנה pronephric והיווצרות ציסטה בכליות לאחר הגן להפיל. זה היה חשד כי מציאה Wnt5a יכולה לגרום למומי מסלול PCP והיווצרות ציסטה בכליות בעכברים. עם זאת, בנוקאאוט הגלובלי של Wnt5a הוא לאחר לידה קטלנית בעכברים ולא ניתן היה להשתמש להתבונן היווצרות ציסטה בכליות לאחר לידה. על ידי שימוש בשיטה שתוארה כאן, בפרק זמן קצר נקבע כי wnt5a מציאה בדג הזברה הביאה היווצרות ציסטה בכליות. עם תוצאה זו, השלב הבא יהיה ליצור עכברי נוקאאוט כליות ספציפיים Wnt5a.

טכניקה זו יש גם כמה מגבלות. קשה להעריך את היעילות של MOS ללא נוגדן טוב, וכדי לשלול את האפשרות שMO עשוי לעכב את הפונקציה של גן לא רלוונטי לגרום פנוטיפ. experime שליטה נרחבתNTS נדרש להתגבר על בעיות אלה. שני MOS מובחן, האוג-MO וMO splice- שימש להערכת מציאה wnt5a. שני morphants phenocopied אחד את השני, והזרקה של עכבר Wnt5a mRNA, עמיד לMOS בשל הבדל במבנה זוג הבסיס עיקרי, הצילה את הפנוטיפ נורמלי, הוכחה כי פנוטיפ לא היה בשל תופעות "מחוץ היעד" של MO.

המודל שלנו מראה שמציאת wnt5a גורמת היווצרות ציסטה בכליות בעוברי דג הזברה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מועסק על מנת לבדוק גנים רבים אחרים שנחשדים לגרום להיווצרות ציסטה כליות, כפי שהיא פשוט ופחות זמן רב. ברגע שזה הוכיח כי תוצאות המוטציה בגן בהיווצרות ציסטה בכליות בדג זברה, ניתן לבצע ניסויים נוספים כדי לחקור את המנגנונים מפורטים של היווצרות ציסטה בכליות. בניסוי זה, שכן עכברי נוקאאוט הגלובלי Wnt5a הם לאחר לידה קטלנית ולא ניתן להשתמש בו לאובלשרת את כליות היווצרות ציסטה לאחר לידה, השלב הבא יהיה ליצור עכברי נוקאאוט Wnt5a כליות ספציפיות באמצעות מערכת Cre-לקס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (DK093625 לLH, וDK069909 וDK047757 לJHL) ו( פרס הצטיינות I01BX000820 לJHL) VA. ברצוננו להודות לד"ר מיכאל חבילת וד"ר Jie הוא באוניברסיטת פנסילבניה דג הזברה Core למתן תמיכה חיונית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Phenol-Red Sigma P0290 Color indicator for injection
Morpholino Genn Tools, LLC (customized) Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle Tritech Research MINJ-PP If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit Ambion 1344 For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea Sigma P7629 For prevention of melanization
Tricaine Sigma A5040 Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose Sigma M-0387 For position of zebrafish 
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix Promega U1511 For PCR
Tag DNA Polymerase Invitrogen 10342-053 For PCR
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-1000 For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor Werther International, Inc. Panther Compact 106 Air source for injection
Pico micro-injection pump World Precision Instruments Inc PV830 Pnematic PicoPump Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator World Precision Instruments Inc MMJR Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder World Precision Instruments Inc 5430-ALL To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers Fine Surgical Tools 11253-20 For breaking off the needle tip
Dissecting microscope Leica M205C  For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope Zeiss Axio Obserer D1m   For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm) VitroCom CV1525Q-100 For measure the volume of each injected drop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
  2. Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
  4. Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
  5. Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
  6. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
  7. Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
  8. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  9. Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
  10. Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
  11. Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
  12. Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).

Tags

רפואה גיליון 94, מחלת כליות פוליציסטיות morpholino microinjection דג הזברה כִּליַת רֵאשִׁית
מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, L., Xiao, A., Wecker, A.,… More

Huang, L., Xiao, A., Wecker, A., McBride, D. A., Choi, S. Y., Zhou, W., Lipschutz, J. H. A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys. J. Vis. Exp. (94), e52156, doi:10.3791/52156 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter