Introduction
जेबराफिश (देनियो rerio) भ्रूण व्यापक रूप से गुर्दा विकास और पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है। वहाँ एक पशु मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के कई फायदे हैं: आनुवंशिक बातचीत का अध्ययन करने की व्यवहार्यता, प्रोटीन पछाड़ना के लिए antisense morpholinos (एमओ) का उपयोग करने की क्षमता है, अवसर जल्दी भ्रूण की बड़ी संख्या को परख करने के लिए, और अंग phenotypes के देखने की आसानी लार्वा एक रह रहे हैं। pronephros रीढ़ में विकसित करने के लिए पहले गुर्दे की है और लार्वा zebrafish 2 में कार्यात्मक है। zebrafish pronephros की संरचना स्तनधारी metanephros करने के लिए अपेक्षाकृत आसान तुलना में है, तीसरे और अंतिम गुर्दे स्तनधारियों में विकसित करने के लिए। नेफ्रॉन यह मुश्किल एकल नेफ्रॉन संरचना का पालन करने के लिए कर रही है, 500,000-1,000,000 नेफ्रॉन 3,4 और लगभग 13,000 नेफ्रॉन 5 होने प्रत्येक माउस गुर्दे के बीच युक्त प्रत्येक मानव गुर्दे के साथ, गुर्दे का काम कर इकाई है मैंएन मानव या माउस गुर्दे। zebrafish केवल दो नेफ्रॉन है, और प्रत्येक zebrafish नेफ्रॉन ग्लोमेर्युल्स और चूहों और इंसानों के 6 और इसी तरह के विशेष गुर्दे सेल प्रकार की नलिकाओं में पाया सभी प्रमुख घटक शामिल हैं। यह एक बंद व्यवस्था 7 है, क्योंकि इस तरह के Xenopus के रूप में अन्य हड्डीवाला मॉडल की तुलना में, zebrafish नेफ्रॉन अधिक बारीकी से स्तनधारी नेफ्रॉन जैसा दिखता है।
हाल के वर्षों में, zebrafish जीनोम आनुवंशिक उपकरण, व्यापक उत्परिवर्ती संसाधनों, और zebrafish मॉडल में ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनों के संग्रह का विस्तृत परिचय की इजाजत दी, अनुक्रम किया गया है। 12-72 घंटा के बाद निषेचन (HPF) और बीच zebrafish pronephros रूपों पारदर्शी भ्रूण में आसानी से देखे जा सकते हैं। Wilm के ट्यूमर प्रोटीन WT1 गुर्दे के विकास के लिए एक अनिवार्य पहलू है। Wt1b प्रमोटर टीजी के नियंत्रण में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों (wt1b: GFP) के GFP के Expre दिखानेssion विशेष रूप से 17 HPF 8 से शुरू, zebrafish भ्रूण में pronephric क्षेत्रों में स्थित है। Nephronophthisis (NPHP), एक autosomal पीछे हटने सिस्टिक गुर्दा रोग, NPHP जीन 9 के म्यूटेशन के कारण होता है। (Wt1b: GFP) के morpholino द्वारा पछाड़ना NPHP4 टीजी में पुटी गठन का कारण बना। मछली 10 इसलिए, इस ट्रांसजेनिक मछली गुर्दे विकास के दौरान गुर्दे की संरचना और पुटी गठन के अवलोकन के लिए एक उपयुक्त मॉडल है। महत्वपूर्ण बात है, गुर्दे की विकास की modulators के प्रभाव एक समय और श्रम कुशल तरीके से इस तनाव का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है।
जीन मॉडुलन के बाद गुर्दा पुटी गठन कल्पना करने के लिए एक मॉडल के रूप में मछली: हमारे पेपर टीजी (GFP wt1b) के उपयोग का वर्णन करता है। हम zebrafish में wnt5a जीन नीचे दस्तक करने के लिए प्रारंभ और ब्याह-साइट विरोधी भावना राज्यमंत्री का इस्तेमाल किया। Wnt5a विभिन्न अंगों और सेलुलर प्रसव के बाद के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि Wnt परिवार का एक गैर विहित स्रावित ग्लाइकोप्रोटीन हैसमारोह 11। Wnt5a गुर्दे ट्यूबलर बढ़ाव दौरान उन्मुख कोशिका विभाजन में एक भूमिका निभा पाया गया है जो तलीय सेल polarity (पीसीपी) मार्ग, सहित गैर विहित Wnt रास्ते, के माध्यम से काम करता है। Wnt5a आगे जिससे Vangl2 स्थिरता 12 को बढ़ावा देने, VANGL तलीय सेल polarity प्रोटीन 2 (Vangl2) के साथ एक जटिल बनाने के द्वारा Wnt5a संकेतन पारगमन जो टाइरोसीन काइनेज तरह रिसेप्टर (Ryk), के साथ एक जटिल बनाने के द्वारा Wnt / पीसीपी मार्ग को नियंत्रित करता है। पीसीपी मार्ग में दोष यादृच्छिक कोशिका विभाजन में परिणाम और गुर्दे पुटी गठन हो सकता है। Wnt5a पछाड़ना निम्नलिखित गुर्दे पुटी गठन का निरीक्षण करने के लिए zebrafish लाइन: हम टीजी (GFP wt1b) का इस्तेमाल किया। टीजी (wt1b: GFP) के zebrafish मॉडल रहते इमेजिंग और गुर्दे की संरचना के समय पर अवलोकन की अनुमति देता है। Wnt5a पछाड़ना के बाद, गुर्दे पुटी गठन 24 HPF में शुरुआत पाया गया था; 72 HPF पर, अल्सर ग्लोमेरुली और समीपस्थ नलिकाओं में पाया जा सकता है। इस विधि को भी एस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैगुर्दे पुटी गठन के कारण हो सकता है कि creen अन्य जीनों।
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Protocol
नोट: आचार कथन: सभी zebrafish प्रयोगों पूर्वी वर्जीनिया मेडिकल स्कूल में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. morpholino तैयारी
- (चित्रा 1 ए) के निर्माता के निर्देशों के अनुसार ब्याज की जीन के लिए डिजाइन और synthesize अनुवाद अवरुद्ध (AUG-) और ब्याह-बाधा (Splice-) विरोधी भावना morpholino (एमओ) oligonucleotides के। तालिका 1 में निर्माता की जानकारी देखें।
नोट: राज्यमंत्री कांच की बोतलों में lyophilized शेयरों के रूप में भेज रहे हैं। - 25 माइक्रोग्राम प्रति / μl के अंतिम एकाग्रता को राज्यमंत्री फिर से निलंबित करने के लिए कांच की बोतलों के लिए उच्च ग्रेड बाँझ पानी जोड़ें। Oligonucleotide पूरी तरह भंग है कि सुनिश्चित करें। कुछ ठोस रहता है, तो 5 संक्षेप में न्यूनतम और भंवर 10 के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर शेयर oligonucleotide समाधान युक्त शीशी गर्मी।
- आरटी पर एमओ शेयर समाधान स्टोर। 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री पर उन्हें स्टोर न करें; सी कम तापमान एमओ oligonucleotide कंटेनर दीवार के लिए बाध्य करने का कारण बन सकता है। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग स्टॉक समाधान की एकाग्रता उपाय एक नए एमओ शेयर समाधान किया जाता है हर बार (Table1 को देखें)।
- वांछित खुराक के लिए उच्च ग्रेड बाँझ पानी के साथ शेयर समाधान गिराए द्वारा इंजेक्शन के दिन पर एमओ काम कर समाधान तैयार है। 0.05% की एकाग्रता तक पहुँचने के लिए 0.5% फिनोल लाल जोड़ें। उदाहरण के लिए, 15 एनजी / नाथन के एक एकाग्रता के साथ 5 μl काम कर समाधान बनाने के लिए, 3 μl एमओ शेयर समाधान और 0.5 μl 0.5% फिनोल लाल पानी के 1.5 μl जोड़ें।
नोट: इस काम एकाग्रता के साथ, इंजेक्शन की प्रत्येक बूंद (500 पी एल) एमओ के 7.5 एनजी होता है और दो बूँदें एमओ के 15 एनजी होते हैं।
इंजेक्शन तंत्र की 2. तैयारी
- क्रय ग्लास (विस्तृत जानकारी के लिए 1 टेबल देखें) सुई पूर्व खींच लिया। वैकल्पिक रूप से, कांच इंजेक्शन की सुई वाई खींचएक सुई खींचने वें।
- हवा कंप्रेसर पर मुड़ें और 50 साई करने के लिए सेटिंग दबाव को समायोजित। विदारक माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत और पिको सूक्ष्म इंजेक्शन पंप पर बारी और के रूप में सेटिंग्स समायोजित: दबाव 20 साई पकड़, दबाव 10 साई, gating का 2.5 और 100 μsec सीमा की अवधि के मूल्य बेदखल।
- इंजेक्शन समाधान के 5 μl के साथ कांच के पूर्व खींचा सुई लोड और टिप नीचे ओर इशारा करते हुए के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में सुई जगह है। सभी समाधान नहीं दिखाई हवाई बुलबुले के साथ सुई टिप तक पहुँच जाता है जब तक प्रतीक्षा करें। माइक्रोस्कोप के बगल में एक उपयुक्त स्थिति में सुई धारक प्लेस और धारक में कांच सुई डालें। 45 डिग्री करने के लिए इंजेक्शन कोण समायोजित करें।
- उच्च मंच से, खुर्दबीन के नीचे देखने में सुई टिप ले आओ, और टिप का सबसे पतला क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित। ठीक बिंदु चिमटी के साथ सुई टिप बंद तोड़ने।
- एक शासक और माइक्रोस्कोप के नीचे की ओर से 0.15 मिमी पक्ष के भीतरी व्यास के साथ एक केशिका ट्यूब प्लेस;एक तरल स्तंभ बनाने के लिए केशिका ट्यूब के एक छोर में समाधान इंजेक्षन। 1 मिमी लंबाई तरल स्तंभ प्रति हर 17 बूंदों तक पहुँचने के लिए बेदखल समय समायोजित करें, तो हर बूंद की मात्रा एक nl तरल स्तंभ के = π एक्स त्रिज्या 2 एक्स लंबाई (ड्रॉप मात्रा () बूंदों की / गिनती () है।
नोट: 0.1 मिमी की एक व्यास के साथ एक बूंद के बारे में 500 पी एल का एक इंजेक्शन की मात्रा (ड्रॉप मात्रा = 4/3 एक्स π एक्स त्रिज्या 3) देता है।
Morpholinos साथ 3. निषेचित zebrafish भ्रूण की तैयारी और इंजेक्शन
- मानक zebrafish पशुपालन और रखरखाव के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसजेनिक zebrafish प्रजनन जोड़े: टीजी (GFP wt1b) की स्थापना की। प्राकृतिक अंडे के बाद भ्रूण लीजिए, और E3 पानी से भरा एक 10 सेमी पेट्री डिश (5 मिमी NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी MgSO 4) में उन्हें रखने के लिए। सही दूर 13 एमओ इंजेक्शन शुरू करो। माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण आकृति विज्ञान मॉनिटर और सुनिश्चित करें कि एमओ इंजेक्शन एक- में हैसेल चरण, या चार सेल चरण की तुलना में कोई बाद में।
- के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण troughs अगर पच्चर के आकार का। अतिरिक्त E3 के पानी Aspirate और धीरे troughs में भ्रूण दबाएँ।
- विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक सेल चरण भ्रूण कल्पना करने के लिए micropipette के साथ भ्रूण हेरफेर। जर्दी (1 बूंद = 500 पी एल) में मो में से एक या दो बूँदें इंजेक्षन जरायु और फिर जर्दी घुसना। E3 के पानी के साथ एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए इंजेक्शन भ्रूण स्थानांतरण और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
- इंजेक्शन के बाद, मृत भ्रूण को हटा दें और इंजेक्शन भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड है। पकवान हर 24 से 48 घंटा में E3 पानी की जगह।
4. Phenotype बचाव प्रयोगों
- बचाव के लिए मो करने के लिए प्रतिरोधी इसलिए, एक अलग प्राथमिक आधार जोड़ी संरचना (आमतौर पर 3-7 आधार जोड़ी बेमेल) है और है कि अन्य प्रजातियों से एक orthologue, का चयन करें। उदाहरण के लिए, इस प्रयोग में, हम चुनामाउस माउस Wnt5a mRNA के अनुक्रम zebrafish अनुक्रम से अलग है।
- आगे प्राइमर translational साइट और mRNA कोडिंग क्षेत्र के अंत के करीब पर रिवर्स प्राइमर पर शुरू के साथ सेट एक प्राइमर डिजाइन। आगे प्राइमर अनुक्रम का 5'- अंत में एक T7 प्रमोटर अनुक्रम जोड़ें। इस प्रयोग में, हम निम्नलिखित प्राइमर दृश्यों का इस्तेमाल किया; आगे: 5'- TAA टीएसी GAC TCA सीटीए टैग GGA सीटीए TGA टी जी सी टी जी सी TGA AGC TGA A- 3 'और रिवर्स: 5'- TCA सीटीटी GCA GAC GTA CTG gtc- 3'।
- इसके बाद के संस्करण के लिए डिज़ाइन प्राइमर सेट (प्रत्येक प्राइमर के 0.5 माइक्रोन) और निम्न पीसीआर कार्यक्रम के साथ माउस Wnt5a सीडीएनए अनुक्रम युक्त 0.1 माइक्रोग्राम प्रति टेम्पलेट डीएनए के साथ एक 50 μl पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रदर्शन: 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक चक्र; 95 डिग्री सेल्सियस (30 सेकंड), 58.5 डिग्री सेल्सियस (30 सेकंड), 72 डिग्री सेल्सियस (1 मिनट) के 35 चक्र; और अंतिम विस्तार चरण 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर।
- टी खत्म करने के बादवह चक्र, बैंड सही आकार है सुनिश्चित करने के लिए 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 2 μl चलाते हैं। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक पीसीआर शुद्धि किट के साथ पीसीआर उत्पाद शुद्ध। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ डीएनए एकाग्रता की जाँच करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध पीसीआर उत्पाद की दुकान या सीधे अगले चरण में छाया हुआ आरएनए प्रतिलेखन में इस्तेमाल करते हैं।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक छाया शाही सेना संश्लेषण किट के साथ mRNA के छाया हुआ विट्रो में synthesize। 20 μl RNase मुक्त पानी में mRNA पतला और एकाग्रता का निर्धारण। -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना और दुकान विभाज्य।
- इंजेक्शन के दिन, RNase मुक्त बाँझ पानी के साथ mRNA की एक काम कर समाधान तैयार करते हैं। 40 पीजी शाही सेना के अविशिष्ट या विषाक्त प्रभाव नहीं होती है, जिस पर सर्वोच्च शाही सेना खुराक आम तौर पर है कि ध्यान दें। बर्फ पर काम कर समाधान रखें। मो के साथ भ्रूण और फिर बचाव mRNA, सुई या दोनों एक साथ सह-इंजेक्षन। उदाहरण के लिए, अगर mRNA के prepar की एकाग्रताप्रत्येक इंजेक्शन के कदम 4.5 में एड 0.08 माइक्रोग्राम प्रति / μl के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए RNase मुक्त पानी की 4.33 μl के लिए mRNA के (0.4 माइक्रोग्राम प्रति) के 0.67 μl जोड़ने के लिए, 0.6 माइक्रोग्राम प्रति / μl है, तो एक बूंद (500 पी एल) 40 पीजी में शामिल mRNA की। चरण 3 में वर्णित के रूप में एमओ तैयार करें।
फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए इंजेक्शन भ्रूण 5. तैयारी
- 28.5 डिग्री सीओ पर ऊष्मायन के बाद / एन, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग pronephros संरचना का अवलोकन को प्रभावित करता है, जो melanization, को रोकने के लिए E3 के पानी के लिए 0.003% एन Phenylthiourea (पी टी यू) जोड़ें। यह जल्दी भ्रूण के विकास को प्रभावित करता है क्योंकि हालांकि, gastrulation से पहले पी टी यू जोड़ नहीं है।
- 48 HPF पर, मैन्युअल रूप से ठीक चिमटी के साथ भ्रूण dechorionate। एक प्रकाश विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत 48 और 72 HPF भ्रूण की छवियों को ले लो।
नोट: इन चित्रों को संज्ञाहरण के बिना लिया जा सकता है। - प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे इमेजिंग में उन्हें रखने के द्वारा भ्रूण anesthetize करने के लिए लगभग 10 मिनट पूर्व160 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / बफर Tricaine युक्त एक 10 सेमी पेट्री डिश। 5-10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर हल्के से वे कदम नहीं है और इसलिए संज्ञाहरण काम कर रहा है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए zebrafish छूना।
- भ्रूण anesthetized हैं, के बाद (1 टेबल देखें) 3% मिथाइल सेलुलोज में उन्हें माउंट और उन्हें एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक प्रवण स्थिति में पूरबी।
- एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे pronephros संरचना का पालन (1 टेबल देखें) और विभिन्न आवर्धन (10x और 20X) पर तस्वीरें ले लो।
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Representative Results
Wnt5a नीचे दस्तक अनुवाद एमओ अवरुद्ध शुरू करने से हासिल की थी (अगस्त-एमओ) या एक सेल मंच पर zebrafish भ्रूण को एक्सॉन / Intron सीमा ब्याह मिसौरी (ब्याह-एमओ)। अगस्त-एमओ इसलिए, दोनों मातृ और युग्मज wnt5a संदेश को रोकता है, शुरू कोडोन लक्ष्य और। ब्याह-एमओ तीसरा ब्याह दाता साइट को लक्षित करता है और wnt5a (चित्रा 1 ए) का केवल युग्मज प्रतिलिपि को रोकता है। AUG- और splice- morphants घुंघराले पूंछ नीचे शरीर धुरी और पेरिकार्डियल शोफ (चित्रा 1 बी) सहित कई दोषों के साथ एक दूसरे को phenocopied। माउस Wnt5a mRNA के आंशिक रूप से फेनोटाइप बंद लक्ष्य प्रभाव के कारण नहीं है कि प्रदर्शन, morphant फेनोटाइप (4B चित्रा) बचाता है। टीजी (wt1b: GFP) के GFP के wt1b की अंतर्जात अभिव्यक्ति का स्मरण दिलाता है कि इतनी wt1b प्रमोटर द्वारा संचालित GFP व्यक्त जो ट्रांसजेनिक zebrafish, pronephric संरचना की रूपरेखा तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। टीजी (wt1बी: नियंत्रण भ्रूण फिनोल लाल के साथ इंजेक्शन जबकि GFP) के मछली अकेले पार्श्व (चित्रा 2) का विस्तार है कि नलिकाओं के साथ एक 'यू' आकार में एक दूसरे से जुड़ने ग्लोमेर्युल्स बनाने, सामान्य pronephric विकास प्रदर्शित, 48 HPF पर wnt5a पछाड़ना के बाद केशिकागुच्छीय पुटी गठन दिखाया। 72 HPF पर, केशिकागुच्छीय संरचना आगे AUG- और ब्याह-राज्य मंत्री के साथ दोनों ग्लोमेरुली और समीपस्थ नलिकाओं (चित्रा 3) में अल्सर विकसित की है, आसानी से कल्पना संवहनी छोरों के साथ विकसित की है। 72 HPF morphant भ्रूण की अनुप्रस्थ ऊतकीय वर्गों के एच एंड ई धुंधला, पुटी गठन से पता चला केशिकागुच्छीय संरचनाओं और फैली हुई वृक्क नलिकाओं (चित्रा -4 ए) खलल डाल दिया।
चित्रा 1: morpholino डिजाइन और 72 घंटा बाद निषेचन (HPF) निम्न इंजेक्शन पर zebrafish भ्रूण के प्रकाश सूक्ष्म उपस्थितिफिनोल लाल नियंत्रण, अगस्त-एमओ, या ब्याह-मो के साथ। (ए) आरेख zebrafish wnt5a जीन, कोडिंग क्षेत्र, और AUG- और splice- एमओ द्वारा लक्षित क्षेत्रों दिखा। wnt5a Aug-एमओ प्रोटीन अनुवाद ब्लॉक करने के लिए ATG शुरू होने से कोडोन लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया था; ब्याह-एमओ किसी भी ब्याह जंक्शन एक पूर्ण या आंशिक एकल एक्सॉन विलोपन या एक पूर्ण या आंशिक एकल Intron प्रविष्टि या तो उत्पन्न करने के लिए आशा की जाती है के खिलाफ निर्देशित एक्सॉनों 3 और 4 ब्याह-एमओ oligo के सीमा लक्षित करने के लिए डिजाइन किया गया था। हम विशिष्टता को बढ़ाने के क्रम में, मातृ और युग्मज संदेश को प्रभावित करता है, जो एक अगस्त-एमओ, और केवल युग्मज प्रतिलेख को प्रभावित करता है, जो एक ब्याह-एमओ, दोनों के साथ wnt5a नीचे दस्तक करने के लिए चुना है। (बी) फिनोल लाल के साथ इंजेक्शन भ्रूण ( इंजेक्शन नियंत्रण) सामान्य शरीर वक्रता, लंबाई और पेरीकार्डियम दिखाया। अगस्त-एमओ के साथ इंजेक्शन भ्रूण ब्याह-मो के साथ इंजेक्शन के नीचे घुंघराले पूंछ संरचना और पेरिकार्डियल शोफ, और भ्रूण phenocopied दिखायाभ्रूण की उपस्थिति अगस्त-मो के साथ इंजेक्शन। बार = 2mm।
चित्रा 2: टीजी (wt1b: GFP) के प्रतिदीप्ति सूक्ष्म उपस्थिति। फिनोल लाल नियंत्रण, wnt5a Aug-एमओ या wnt5a ब्याह-मो के साथ इंजेक्शन के बाद 48 HPF पर zebrafish भ्रूण फिनोल लाल इंजेक्शन नियंत्रण में, pronephros विकास 48 में पूरा हो गया था HPF। दो जुड़े हुए ग्लोमेरुली और समीपस्थ नलिकाओं देखा जा सकता है। पुटी गठन AUG- और ब्याह-एमओ zebrafish pronephros विकास (बार = 100 माइक्रोन) के अंत तक HPF 48 पर भ्रूण दोनों में ग्लोमेरुली में मनाया जा सकता है।
चित्रा 3: टीजी (wt1b: GFP) के प्रतिदीप्ति सूक्ष्म उपस्थिति के साथ इंजेक्शन के बाद 72 HPF पर zebrafish भ्रूण फिनोल-लालनियंत्रण, wnt5a Aug-एमओ या wnt5a ब्याह-मो। 72 HPF पर, केशिकागुच्छीय संरचना स्पष्ट रूप से देखे जा सकते हैं। फिनोल लाल इंजेक्शन नियंत्रण में, दो जुड़े हुए ग्लोमेरुली और नाड़ी छोरों मनाया जा सकता है। Wnt5a पछाड़ना ग्लोमेरुली और समीपस्थ ट्यूबलर क्षेत्र (बार = 100 माइक्रोन) सहित कल्पना की जा सकती है कि सभी नेफ्रॉन संरचनाओं में पुटी गठन में हुई।
चित्रा 4: 72 HPF morphant भ्रूण की अनुप्रस्थ ऊतकीय वर्गों के (ए) एच एंड ई धुंधला, पुटी गठन से पता चला केशिकागुच्छीय संरचनाओं और फैली हुई वृक्क नलिकाओं खलल डाल दिया। तीर: pronephric ग्लोमेरुली; Arrowhead: गुर्दे की छोटी नली फैली हुई। बार = 20 माइक्रोन। (बी) अगस्त-एमओ phenotype के कारण आंशिक रूप से प्राथमिक आधार जोड़ी संरचना में एक फर्क करने के लिए मो करने के लिए प्रतिरोधी माउस Wnt5a, साथ बचाया जा सकता हैजिससे फेनोटाइप बंद लक्ष्य प्रभाव के कारण नहीं था कि प्रदर्शन है। फर्क पी <0.05 पर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (* पी <0.05 Phenol लाल समूह बनाम; # पी <0.05 Aug-एमओ 15 एनजी समूह बनाम)।
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Discussion
पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (PKD) मनुष्यों में अंतिम चरण गुर्दे की बीमारी के प्रमुख कारणों में से एक है और प्रगतिशील पुटी गठन, गुर्दे की वृद्धि, और असामान्य छोटी नली विकास 14 की विशेषता है। ऑटोसोमल प्रमुख PKD (ADPKD) एक आनुवांशिक बीमारी है जिसमें या तो PKD1 का उत्परिवर्तन, polycystin -1 (PC1), या PKD2 एन्कोडिंग polycystin -2 (PC2) एन्कोडिंग, पॉलीसिस्टिक गुर्दे में परिणाम है। कई अन्य जीन, प्राथमिक पपनी में पाया प्रोटीन एन्कोडिंग विशेष रूप से उन लोगों के, गुर्दे अल्सर के विकास में शामिल होने के लिए सोचा था, और अब तक इन जीनों स्क्रीन करने के लिए कोई आदर्श उपकरण है कर रहे हैं। हम zebrafish में जीन पछाड़ना के बाद गुर्दा पुटी गठन का पालन करने के लिए एक तेज और आसान तरीका वर्णन। इस विधि की संभावना अन्य उम्मीदवार PKD जीन स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस तकनीक की शक्तियों में से एक अपनी सादगी है। टीजी (wt1b: GFP) के में zebrafish, GFP की अभिव्यक्ति यह एक विशेष बनाता है, जो ग्लोमेरुली, नलिकाओं और नलिकाओं में हैly के उपयुक्त मॉडल पूरे pronephric गुर्दे की संरचना का अध्ययन करने के लिए। टीजी (wt1b: GFP) के लिए zebrafish जीन के बाद pronephric संरचना और गुर्दे पुटी गठन के प्रत्यक्ष दृश्य नीचे दस्तक देता है। यह Wnt5a पछाड़ना पीसीपी मार्ग दोषों और चूहों में गुर्दा पुटी गठन पैदा कर सकता है कि संदेह था। हालांकि, Wnt5a के वैश्विक पीटा चूहों में घातक प्रसवोत्तर है और जन्म के बाद गुर्दा पुटी गठन का पालन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। समय की एक छोटी अवधि में, यहाँ वर्णित विधि का उपयोग करके यह zebrafish में पछाड़ना wnt5a गुर्दा पुटी गठन के परिणामस्वरूप कि निर्धारित किया गया था। इस परिणाम के साथ, अगले कदम के गुर्दे विशिष्ट Wnt5a पीटा चूहों उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा।
इस तकनीक को भी कुछ सीमाएं हैं। यह एक अच्छा प्रतिरक्षी बिना राज्यमंत्री के प्रभावकारिता अनुमान लगाने के लिए, और एमओ फेनोटाइप पैदा करने के लिए एक अप्रासंगिक जीन के समारोह को बाधित कर सकता है कि संभावना को खारिज करना मुश्किल है। व्यापक नियंत्रण experimeएनटीएस इन समस्याओं को दूर करने के लिए आवश्यक हैं। दो अलग राज्यमंत्री, अगस्त-एमओ और splice- एमओ wnt5a पछाड़ना मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। दोनों morphants एक दूसरे phenocopied, और माउस Wnt5a mRNA की इंजेक्शन, प्राथमिक आधार जोड़ी संरचना में एक अंतर के कारण राज्यमंत्री के लिए प्रतिरोधी, फेनोटाइप मो "बंद लक्ष्य" प्रभाव के कारण नहीं था कि प्रदर्शन, असामान्य फेनोटाइप बचाया।
हमारे मॉडल wnt5a पछाड़ना zebrafish भ्रूण में गुर्दे पुटी गठन का कारण बनता है कि यह दर्शाता है। यह सरल और कम समय लगता है के रूप में इस पद्धति, गुर्दे पुटी गठन पैदा करने के संदेह कर रहे हैं कि कई अन्य जीनों का परीक्षण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। यह zebrafish में गुर्दा पुटी गठन में जीन उत्परिवर्तन का परिणाम है, आगे के प्रयोगों के गुर्दे पुटी गठन की विस्तृत तंत्र की जांच करने के लिए आयोजित किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है एक बार। Wnt5a वैश्विक पीटा चूहों घातक प्रसव के बाद कर रहे हैं और नहीं किया जा सकता क्योंकि इस प्रयोग में, ओ करने के लिएजन्म के बाद गुर्दा पुटी गठन की सेवा है, अगले कदम के लिए रचनात्मक-Lox प्रणाली का उपयोग गुर्दे विशिष्ट Wnt5a पीटा चूहों उत्पन्न करने के लिए किया जाएगा।
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Acknowledgments
यह काम (एलएच को DK093625, और DK069909 और DK047757 JHL करने के लिए) एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया था और वर्जीनिया (मेरिट पुरस्कार JHL को I01BX000820)। हम आवश्यक सहायता प्रदान करने के लिए पेंसिल्वेनिया Zebrafish कोर विश्वविद्यालय में डॉ माइकल पैक और डॉ जी वह शुक्रिया अदा करना चाहूँगा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
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