Introduction
El pez cebra (Danio rerio), los embriones se han usado ampliamente como un modelo para estudiar el desarrollo del riñón y enfermedad renal poliquística. Hay muchas ventajas en el uso del pez cebra como modelo animal: la viabilidad de estudiar las interacciones genéticas, la capacidad de utilizar morfolinos antisentido (MO) durante caída de proteínas, la oportunidad para ensayar rápidamente un gran número de embriones, y la facilidad de ver fenotipos de órganos en larvas 1 viviente. Los pronefros es el primer riñón para desarrollar en los vertebrados y es funcional en larvas de pez cebra 2. La estructura de los pronefros pez cebra es relativamente simple en comparación con los metanefros de mamíferos, la tercera y última riñón a desarrollar en los mamíferos. La nefrona es la unidad de trabajo del riñón, con cada riñón humano contiene entre 500,000-1,000,000 nefronas 3,4 y cada riñón de ratón que tiene aproximadamente 13.000 nefronas 5, por lo que es difícil de observar la estructura nefrona única in riñones humanos o de ratón. El pez cebra tiene sólo dos nefronas y cada nefrona pez cebra contiene todos los componentes principales que se encuentran en el glomérulo y los túbulos de ratones y seres humanos 6 y tipos de células renales especializados similares. En comparación con otros modelos de vertebrados tales como Xenopus, la nefrona pez cebra se asemeja más a la nefrona de mamíferos, ya que tiene un sistema cerrado 7.
En los últimos años, el genoma pez cebra ha sido secuenciado, lo que permite la amplia introducción de herramientas genéticas, amplios recursos de mutantes, y colecciones de líneas transgénicas reportero en modelos de pez cebra. Las formas pronefros pez cebra entre 12 a 72 h después de la fecundación (HPF) y pueden ser visualizados fácilmente en los embriones transparentes. La proteína del tumor de Wilms WT1 es un factor esencial para el desarrollo del riñón. Líneas de pez cebra transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostrar expre GFPsión encuentra específicamente en las regiones pronéfricos en embriones de pez cebra, a partir de 17 HPF 8. Nefronoptisis (NPHP), una enfermedad renal quística autosómica recesiva, es causada por mutaciones de genes NPHP 9. NPHP4 desmontables por morfolino causó la formación de quistes en la Tg (wt1b: GFP). Peces 10 Por lo tanto, este pez transgénico es un modelo adecuado para la observación de las estructuras del riñón y formación de quistes durante el desarrollo del riñón. Es importante destacar que la influencia de moduladores de desarrollo del riñón puede ser estudiada usando esta cepa en un tiempo y mano de obra de manera eficiente.
Nuestro trabajo se describe el uso de Tg (wt1b: GFP) de pescado como un modelo para visualizar la formación de quistes renales después de la modulación de genes. Utilizamos inicio y empalme de sitio antisentido OM para derribar el gen Wnt5a en el pez cebra. Wnt5a es una glicoproteína secretada no canónica de la familia Wnt que juega un papel importante en el desarrollo de diversos órganos y postnatal celularfunción 11. Wnt5a trabaja a través de vías de Wnt no canónica, incluyendo la vía de la polaridad celular planar (PCP), que se ha encontrado a desempeñar un papel en la división celular orientado durante la elongación tubular renal. Wnt5a regula la vía / PCP Wnt mediante la formación de un complejo con el receptor tirosina quinasa (Ryk), que transduce más Wnt5a de señalización mediante la formación de un complejo con la proteína de la polaridad celular planar VANGL 2 (Vangl2), promoviendo así la estabilidad Vangl2 12. Los defectos en la vía de PCP pueden resultar en la división celular aleatoria y causar la formación de quiste renal. Utilizamos la Tg (wt1b: GFP) de la línea de pez cebra para observar la formación de quistes renales tras caída Wnt5a. La Tg (wt1b: GFP) modelo de pez cebra permite obtener imágenes en vivo y la observación puntual de la estructura del riñón. Después caída Wnt5a, formación de quistes renales se encontró a partir de las 24 HPF; en 72 hpf, los quistes se pueden encontrar en los glomérulos y los túbulos proximales. Este método también podría ser usado para sotros Creen genes que podrían causar la formación de quistes renales.
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Protocol
Declaración de Ética: NOTA: Todos los experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en la Eastern Virginia Medical School.
1. Preparación morfolino
- Diseño y síntesis de traducción-bloqueo (aumentación) y el empalme de inhibición (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para el gen de interés según las instrucciones del fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte la información del fabricante en la Tabla 1.
NOTA: OM se envían como acciones liofilizados en botellas de vidrio. - Añadir alto grado agua estéril a las botellas de vidrio para volver a suspender MOS a una concentración final de 25 mg / l. Asegúrese de que el oligonucleótido se disuelva por completo. Si algunos restos sólidos, caliente el frasco que contiene la solución de oligonucleótido a 65 ° C durante 5 a 10 minutos y agitar brevemente.
- La solución madre, MO en RT. No se puede almacenar a 4 ° C o -20 °; C porque las temperaturas más bajas podrían causar el oligonucleótido MO para unirse a la pared del recipiente. Medir la concentración de la solución madre usando un espectrofotómetro (véase Tabla 1) cada vez que se realiza una nueva MO solución madre.
- Preparar la solución de trabajo de MO en el día de la inyección mediante la dilución de la solución madre con alto grado de agua estéril a la dosis deseada. Añadir 0,5% de rojo de fenol para alcanzar una concentración de 0,05%. Por ejemplo, para hacer que la solución de trabajo 5 l con una concentración de 15 ng / nL, agregue 3 l MO solución stock y 0,5 l 0,5% de rojo de fenol al 1,5 l de agua.
NOTA: Con esta concentración de trabajo, cada gota (500 pl) de inyección contiene 7,5 ng de MO y dos gotas contiene 15 ng de MO.
2. Preparación del aparato de inyección
- Compra de vidrio agujas pre-tiró (véase el cuadro 1 para información detallada). Como alternativa, retire la aguja de inyección wi vidrioth un extractor de aguja.
- Encienda el compresor de aire y ajustar el valor a 50 psi de presión. Encienda la fuente de luz del microscopio de disección y Pico bomba de microinyección y ajustar la configuración de la siguiente manera: mantener la presión de 20 psi, expulsar la presión de 10 psi, valor del período de 2,5 y 100 microsegundos gama de gating.
- Cargar el vidrio aguja pre-desmenuzado con 5 l de la solución de inyección y colocar la aguja en una posición vertical con la punta hacia abajo. Espere hasta que toda la solución llega a la punta de la aguja sin burbujas de aire visibles. Coloque el soporte de la aguja en una posición apropiada al lado del microscopio e inserte la aguja de vidrio en el soporte. Ajuste el ángulo de inyección a 45 grados.
- Llevar la punta de la aguja a la vista bajo el microscopio, alto del escenario, y se centran en la región más delgada de la punta. Rompa la punta de la aguja con unas pinzas de punta fina.
- Coloque una regla y un tubo capilar con diámetro interior de 0,15 mm de lado a lado con el microscopio;inyectar la solución en un extremo del tubo capilar para hacer una columna de líquido. Ajustar el tiempo de expulsión para llegar a cada 17 gotas por la columna de líquido de longitud 1 mm, entonces el volumen de cada gota es 1 nl (volumen de la gota = π x radio de 2 x longitud (de la columna de líquido) / count (de gotas).
NOTA: Una gota con un diámetro de 0,1 mm da un volumen de inyección de alrededor de 500 pl (volumen de la gota = 4/3 x π x radio de 3).
3. Preparación de fertilizados embriones de pez cebra y de inyección con Morpholinos
- Configure Tg (wt1b: GFP) parejas reproductoras de pez cebra transgénico de acuerdo con los protocolos publicados para la cría de peces cebra estándar y mantenimiento. Recoger los embriones después de desove natural, y mantenerlos en una placa de Petri de 10 cm llena de agua E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO4). Iniciar MO inyección de inmediato 13. Monitorear morfología del embrión bajo el microscopio y hacer la inyección segura de MO es en el de unoetapa de célula, o no más tarde de la etapa de cuatro células.
- Transferir los embriones a una placa de Petri de 10 cm con forma de cuña agar valles. Aspirar el agua E3 extra y presionar suavemente los embriones en los comederos.
- Manipular los embriones con la micropipeta para visualizar embriones en estadio de 1 célula bajo el microscopio de disección. Penetrar en el corion y luego la yema para inyectar una o dos gotas de MO en la yema (1 gota = 500 pl). La transferencia de los embriones inyectados a un 10 cm placa de Petri con agua E3 y se incuba a 28,5 ° C.
- Después de las inyecciones, toma de embriones muertos y registrar el número de embriones inyectados. Cambie el agua E3 en el plato de cada 24 a 48 horas.
4. Experimentos fenotipo de rescate
- Seleccione un orthologue de otra especie que tiene una estructura de base par primario diferente (generalmente 3-7 pares de bases desajustes) y es, por lo tanto, resistentes a la MO, para el rescate. Por ejemplo, en este experimento, elegimosratón porque la secuencia de ratón Wnt5a ARNm es diferente de la secuencia de pez cebra.
- Diseñar un conjunto de cebadores con el cebador directo comenzando en el sitio de la traducción y el cebador inverso en cerca del final de la región codificante del mRNA. Añadir una secuencia de promotor T7 en el extremo 5 'final de la secuencia del cebador hacia adelante. En este experimento, se utilizaron los siguientes el primer secuencias; adelante: 5'-taa tac gac tca etiqueta cta GGA cta tga tgc tgc tga agc tga a- 3 'y revertir: 5'-tca ctt gca gac gta CTG gtc- 3'.
- Realizar una reacción en cadena de polimerasa 50 l (PCR) con el conjunto de cebadores (0.5 M de cada cebador) diseñado arriba y 0.1 g de ADN plantilla que contiene la secuencia de ADNc de ratón Wnt5a con el siguiente programa de PCR: 1 ciclo a 95 ° C durante 5 min; 35 ciclos de 95 ° C (30 seg), 58,5 ° C (30 segundos), 72 ° C (1 min); y paso de extensión final a 72 ° C durante 7 minutos.
- Después de terminar tél ciclo, ejecute 2 l de producto de PCR en un 1% en gel de agarosa para asegurarse de que la banda es el tamaño correcto. Se purifica el producto de PCR con un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Comprueba la concentración de ADN con un espectrofotómetro. Almacenar el producto de PCR purificado a -20 ° C o usar directamente en la transcripción de ARN tapado en la siguiente etapa.
- Sintetizar in vitro capsulado ARNm con un kit de síntesis de ARN tapado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir el ARNm en 20 l de agua libre de RNasa y determinar la concentración. Alícuota de la ARN y almacenar a -80 ° C.
- En el día de la inyección, preparar una solución de trabajo del ARNm con RNasa libre de agua estéril. Tenga en cuenta que 40 pg es generalmente la dosis ARN alta a la que no se producen efectos no específicos o tóxicos de la ARN. Mantenga la solución de trabajo en el hielo. Inyectar el embrión con MO y luego el ARNm de rescate, o co-inyectar los dos juntos. Por ejemplo, si la concentración de la prepar mRNAed en el paso 4,5 es de 0,6 mg / l, añadir 0,67 l de mRNA (0,4 g) a 4,33 l de RNasa libre de agua para hacer una concentración final de 0,08 mg / l, y luego una gota (500 pl) de cada inyección contiene 40 pg de mRNA. Preparar MO como se describe en el paso 3.
5. Preparación de embriones inyectados de Imagen Fluorescente
- Después de incubación a 28,5 ° CO / N, añadir 0,003% N-feniltiourea (PTU) al agua para evitar melanization E3, que afecta a la observación de la estructura pronefros mediante microscopía de fluorescencia. Sin embargo, no añada PTU antes de la gastrulación, ya que afecta el desarrollo embrionario temprano.
- A las 48 HPF, dechorionate manualmente los embriones con pinzas finas. Tomar imágenes de 48 y 72 embriones HPF bajo un microscopio de disección luz.
NOTA: Estas imágenes pueden ser tomadas sin anestesia. - Aproximadamente 10 min antes de la imagen bajo el microscopio de fluorescencia, anestesiar los embriones colocándolos enuna placa de Petri de 10 cm que contiene 160 mg / ml tamponada tricaína. Espere 5-10 minutos, y luego toque ligeramente el pez cebra para confirmar que no se mueven y por lo tanto la anestesia está trabajando.
- Después de que los embriones son anestesiados, montarlos en el 3% de metilcelulosa y les orientan en posición prona con un microscopio de disección (por favor consulte la Tabla 1).
- Observe la estructura pronefros bajo un microscopio de fluorescencia (por favor consulte la Tabla 1) y tomar fotografías a diferentes aumentos (10X y 20X).
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Representative Results
Wnt5a derribar se logró mediante la introducción de traducción bloqueando MO (agosto-MO) o el exón / intrón empalme frontera MO (empalme-MO) a los embriones de pez cebra en la etapa de una célula. El AUG-MO se dirige al codón de inicio y, por lo tanto, inhibe tanto mensaje Wnt5a materna y cigóticos. El empalme de MO se dirige a la tercera sitio donador de empalme y sólo inhibe la transcripción cigóticos de Wnt5a (Figura 1A). La aumentación y morphants splice- phenocopied uno al otro con múltiples defectos, incluyendo la cola hacia abajo eje del cuerpo rizadas y edema pericárdico (Figura 1B). Ratón Wnt5a ARNm rescata parcialmente el fenotipo morphant (Figura 4B), lo que demuestra que el fenotipo no es debido a los efectos fuera de la meta. La Tg (wt1b: GFP) pez cebra transgénico, que expresa GFP dirigido por el promotor wt1b de modo que la GFP recapitula expresión endógena de wt1b, se utilizó para describir la estructura pronephric. La Tg (WT1b: GFP) de pescado mostró la formación de quistes glomerular tras caída Wnt5a a las 48 HPF, mientras que el control de embriones inyectados con rojo fenol solo muestra el desarrollo pronephric normal, formando un glomérulo fundido en forma de "U" con túbulos que se extienden lateralmente (Figura 2). En 72 HPF, estructura glomerular desarrolló aún más con bucles vasculares fácilmente visualizados, tanto con aumentación y empalme-OM desarrolló quistes en los glomérulos y túbulos proximales (Figura 3). H & E tinción de los cortes histológicos transversales de embriones morphant 72 HPF reveló la formación de quistes, alteración de las estructuras glomerulares y túbulos renales dilatados (Figura 4A).
Figura 1: Diseño Morfolino y la apariencia microscópica de embriones de pez cebra a 72 h después de la fecundación (HPF) después de la inyeccióncon un control de rojo fenol, agosto-MO, o empalme-MO. (A) Diagrama que muestra el gen de pez cebra Wnt5a, la región codificante, y las regiones seleccionadas por la aumentación y splice- MO. El Wnt5a AUG-MO fue diseñado para dirigir el codón de inicio ATG para bloquear la traducción de proteínas; el empalme-MO fue diseñado para atacar la frontera de los exones 3 y 4. Empalme-MO oligo dirigidos contra se espera que cualquier nudo de empalme para generar ya sea una deleción del exón sola completa o parcial o una inserción intrón sola completa o parcial. Elegimos para derribar Wnt5a tanto con un AUG-MO, que afecta mensaje materna y cigóticos, y un empalme-MO, que sólo afecta a la transcripción cigóticos, con el fin de mejorar la especificidad. (B) El embrión inyectado con rojo fenol ( control de la inyección) mostró curvatura normal del cuerpo, la longitud y el pericardio. El embrión inyectado con el AUG-MO mostró estructura descendente rizado cola y edema pericárdico, y el embrión inyectado con el empalme de la MO phenocopiedaparición del embrión inyectado con AUG-MO. Bar = 2 mm.
Figura 2: aspecto microscópico de fluorescencia de Tg (wt1b: GFP). Embriones de pez cebra a las 48 HPF después de la inyección con control de rojo fenol, Wnt5a agosto-MO o Wnt5a Splice-MO En el control de la inyección de fenol rojo, desarrollo pronefros fue completa en el 48 HPF. Dos glomérulos fusionados y los túbulos proximales se pueden ver. La formación de quistes se puede observar en los glomérulos tanto en la aumentación y empalme-MO embriones a las 48 HPF por el final del desarrollo pronefros pez cebra (barra = 100 micras).
Figura 3: aspecto microscópico de fluorescencia de Tg (wt1b: GFP) embriones de pez cebra a las 72 HPF después de la inyección con rojo fenol-control, Wnt5a agosto-MO o Wnt5a empalme-MO. A las 72 HPF, estructura glomerular puede visualizarse claramente. En el control de la inyección de fenol rojo, dos glomérulos fusionados y bucles vasculares se pueden observar. Wnt5a caída dio lugar a la formación de quistes en todas las estructuras de la nefrona que podrían ser visualizados, incluyendo los glomérulos y la región tubular proximal (barra = 100 micras).
Figura 4: (A) H & E tinción de los cortes histológicos transversales de 72 embriones morphant HPF reveló la formación de quistes, alteración de las estructuras glomerulares y túbulos renales dilatados. Flecha: glomérulos pronephric; punta de flecha: dilatado túbulo renal. Bar = 20 micras. (B) El fenotipo AUG-MO podría ser parcialmente rescatado con el ratón Wnt5a, resistente a la MO debido a una diferencia en la estructura de base par primaria, Lo que demuestra que el fenotipo no se debió a efectos fuera de la meta. La diferencia fue estadísticamente significativa a p <0,05 (* P <0,05 vs grupo fenol-rojo; # P <0.05 vs agosto-MO grupo 15 ng).
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Discussion
La enfermedad renal poliquística (PKD) es una de las principales causas de enfermedad renal terminal en los seres humanos y se caracteriza por la progresiva formación de quistes, agrandamiento renal y desarrollo de túbulos anormal 14. PKD autosómica dominante (PQRAD) es una enfermedad genética en la que la mutación de cualquiera de PKD1, que codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), los resultados en los riñones poliquísticos. Muchos otros genes, especialmente los que codifican proteínas que se encuentran en el cilio primario, se cree que participan en el desarrollo de quistes renales, y hasta el momento no existe una herramienta ideal para detectar estos genes. Describimos una manera rápida y fácil de observar la formación de quistes renales después de caída de genes en el pez cebra. Este método probablemente se puede utilizar para detectar otros genes PKD candidato.
Uno de los puntos fuertes de esta técnica es su simplicidad. En Tg (wt1b: GFP) el pez cebra, la expresión de GFP es en los glomérulos, túbulos y conductos, lo que hace un especially modelo adecuado para el estudio de toda la estructura del riñón pronephric. La Tg (wt1b: GFP) pez cebra permite la visualización directa de la estructura pronephric y formación de quistes renales después gen tumbar. Se sospechaba que Wnt5a caída podría causar defectos de la vía de PCP y la formación de quiste renal en ratones. Sin embargo, knockout mundial de Wnt5a es postnatal letal en ratones y no podría ser usado para observar la formación de quiste renal después del nacimiento. Al utilizar el método descrito aquí, en un corto período de tiempo se determinó que Wnt5a desmontables en el pez cebra resultó en la formación de quistes renales. Con este resultado, el siguiente paso será generar ratones knockout Wnt5a específicas renales.
Esta técnica también tiene algunas limitaciones. Es difícil estimar la eficacia de las OM sin un buen anticuerpo, y para descartar la posibilidad de que la MO podría inhibir la función de un gen irrelevante para causar el fenotipo. Amplia EXPERIME de controlse requieren nts para superar estos problemas. Dos OM distintas, la AUG-MO y la splice- MO se utilizaron para evaluar caída Wnt5a. Ambos morphants phenocopied entre sí, y la inyección de ratón Wnt5a ARNm, resistente a las OM, debido a una diferencia en la estructura de base par primario, rescataron el fenotipo anormal, lo que demuestra que el fenotipo no se debió a efectos de "fuera de objetivo" de la MO.
Nuestro modelo demuestra que desmontables Wnt5a provoca la formación de quistes renales en embriones de pez cebra. Esta metodología puede ser empleado para probar muchos otros genes que se sospecha que causan la formación de quiste renal, ya que es simple y consume menos tiempo. Una vez que se demuestra que los resultados de mutación de genes en la formación de quiste renal en el pez cebra, otros experimentos pueden llevarse a cabo para investigar los mecanismos detallados de la formación de quistes renales. En este experimento, ya que los ratones knockout mundial Wnt5a son postnatal letal y no se pueden utilizar a OBservir a la formación de quistes renales después del nacimiento, el siguiente paso será generar ratones knockout Wnt5a-renales específica utilizando el sistema Cre-lox.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH (DK093625 a la LH, y DK069909 y DK047757 a JHL) y la Administración de Veteranos (Premio al Mérito I01BX000820 a JHL). Nos gustaría agradecer al Dr. Michael paquete y el Dr. Jie Él en la Universidad de Pennsylvania pez cebra Core para proporcionar un apoyo esencial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
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