Summary
설립 암 세포주 및 이종 이식편은 지난 수십 년간 암 연구의 주류이었다. 그러나, 최근의 증거는 치료 반응이 크게 종양 세포 미세 환경에 의해 영향을 받는다는 의미한다. 따라서, 우리는 약물 개발을 목적으로 일차 종양 시료의 생체 외 분석을 개발 하였다.
Introduction
효과적인 암 치료제를 개발하는 것이 매우 어려운 것으로 입증되었습니다. 암 세포주와 종양 이식편 -뿐만 아니라 이종 절반 위에 세기 1,2,3 대한 암 연구에서 사용되어왔다. 현재까지, 약물 감수성 및 내성 둘 확립 암 세포주 및 이종 이식 환자 유래의 분자량 분석 (PDX)이 필수적이다. 그러나, 확립 암 세포주에서의 시험 화합물들은 생체 내 효능을 예측할 수없고, 특히 PDX 모델에서, 동물의 생체 내 연구에 대응하는, 매우 많은 비용과 시간이 소요된다. 이 모델 시스템, 종양 진행 및 치료 전략에 응답하여 네이티브 미세의 영향에 알리는 즉 무능력의 한계는 이러한 분석을 보완하기위한 추가 방법을 개발하는 연구 분야를 주도하고있다. 최근의, 높아진 관심은 환자 다치의 생체 분석으로 지급되는암 치료 반응은 암세포의 내재적 분자 조성물 단독이 아니라 오히려 크게 기존 배양 방법에 의해 효과적으로 요약 할 수없는 종양 세포 미세 환경 (6, 7) 기능에 의해 영향을 받는다는 인해 큰 이해 또는 이식편 4, 5 / 또는 PDX. 상기 컨텍스트의 생체 외 분석 (예. 인접한 주위 종양 세포 미세 환경의 영향)보다는 셀룰러 균주 8, 9의 생체 외 분석을보다 실용적 일차 종양 / 전이 섹션의 평가를 의미한다.
우리는 모두 환자의 기본 종양 (정밀 분리 된 신선한 조직 섹션 즉.) 및 관련 전이 (즉, 림프절)을 충실하게 응답에 알립니다 (IC50), 오프 대상 효과 생체 기술에 여기에보고하고 분자 수 있습니다 저항과 피드백 메커니즘의 분석. 치료 적 레이저 각막 절제의 또한, 상관 관계 분석바이오 마커 및 유전자 발현 프로파일 대 utic 감도 / 저항 (즉. 높은 약물 반응이 특히 생물학적 프로필을 가진 환자와 일치) 관심 실험 약물에 반응 할 가능성 환자를 확인하기 위해 수행 될 수있다. 다중 매개 변수 방식으로 생체 기술과 평가의 적용은 환자의 선택과 임상 결과의 전반적인 개선을 향한 움직임이다.
생체 내 치료 반응 분석은 암 치료제의 전임상 및 임상 개발의 표준 도구가 될 수 있고, 치료 개발 전략에 맞춤 의학의 접근 방식으로 단계로 구상된다.
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Protocol
참고 : 환자 조직 조달이 제도적 검토위원회 (IRB)를 통해 권한이 부여 된 기념 슬로안 케터링 암 센터에서 Biospecimen 및 임상 프로토콜 (프로토콜 번호는 각각 09-121 및 11-041을) -approved.
1 조직 조달
- 환자의 기본 종양 / 전이 조달
참고 : 현재까지,이 프로토콜은 수술로 제거 췌장, 위 및 유방 종양 유형뿐만 아니라, 같은 림프종 전이에 수행되었습니다.- 멸균 유출 방지 컨테이너 내의 밀봉 및 살균 누수 방지 플라스틱 시편 가방에 병리학 부서에 택배 또는 공압 튜브 시스템에 의해 표본을 제공하기 위해 외과 팀을 직접. 더 포르말린 고정액으로 신선한 상태의 시료를 수송 할 수있는 외과 팀을 직접.
- 어느 것이 Inc의 멸균 기술을 사용하여 신선한 표본을 채취하기 위해 병리학 자 또는 병리학 지원을 직접층류 후드 멸균 장갑과 악기의 ludes 사용.
- 수술의 완성에서 30 분에서 엄격하게 유지된다 조달 시료의 채취 시간을 기록한다. 냉 허혈을 고려하여 효과를 고려,> 30 분 (18)의 감기 허혈성 시간 절제술에서 샘플을 채취하지 않습니다.
- 무균 환경을 유지하기 위해 층류 후드에서 1.0 cm (3)에 약 0.5 cm (3)의 일차 종양 표본을 제거하는 병리학 부서 담당자 직접. 가능하면, 전위 프랭크 중앙 괴사 (세포 사멸)를 피하기 위해 인덱스 병변의 주변부로부터 종양 조직을 선택한다.
참고 : 괴사 조직은 다음 기준 중 하나에 의해 심하게 인식 할 수 있습니다 : 색상이나 조직의 창백 손실; 괴사 조직 부드럽고 무른 인 강도의 손실; 괴사 및 실행 가능한 조직 사이에 뚜렷한 경계. - pathologi 직접성 또는 병리학 보조 진단 평가를위한 종양의 즉각적인 샘플링 초과 후 (수술 폐기)에 주변 조직을 제공합니다. 약 5 ㎖의 1 % 항생제 (페니실린과 스트렙토 마이신)를 포함하는 최소 필수 미디어 (MEM)의 포함 된 15 ㎖의 멸균 원뿔 원심 분리 관에 시료를 놓습니다.
- 사용 가능한 (예를 들어, 유방 절제 표본의 겨드랑이 꼬리 림프절)은 같은 크기 (0.5 cm 3 cm 3 내지 1.0)의 조잡한 포지티브 관련된 림프절 표본을 조달 일차 종양의 약물 반응과 비교하면. 일차 종양 표본 마찬가지로, 1 % 항생제 (페니실린 스트렙토 마이신)를 포함하는 약 5 ㎖의 최소 필수 매체 (MEM)의 함유를 15 ㎖의 멸균 원추형 원심 분리 튜브에 연결된 림프절 표본을 배치.
- 만약 즉 수술 표본 허가 (예를 들어, 유방 절제 표본)을, (주 종양에서 먼) 제거의 정상 조직 샘플 (크기,약 5 ml의 전송만을 목적으로 1 %의 항생제를 함유하는 최소 필수 매체 (MEM)의 함유를 15 ㎖의 멸균 원추형 원심 분리 관에서 통상 고밀도 / 섬유질 유방 실질) 및 장소. 실험실 시설 이전에 따라,에 cryovial, '스냅'동결 및 저장에 '정상'표본을 전송 -80 C의 냉동고 ° 향후 분자 분석을 위해.
- 젖은 얼음에 모든 시편을 놓고 즉시 생체 신선한 조직 절편에 대한 실험실 공간으로 운반 할 것. 하지 부에게 정상적인 시료를 수행 아니라 미래의 분자 분석을위한 C의 냉동고 °에 -80 저장합니다. 미래의 분자 분석을 위해 -80 ° C의 냉동고에 cryovial, '스냅'동결 및 저장에 대한 기본 종양의 부분과 관련된 전이을 전송합니다.
- 임상 연구에서 조직의 조달 (예, 선택적 코어 생검 바늘 (CNB))
참고 : 우리는 환자의 종양 조직을 얻을치료 시작 전 액세스 종양 전이 CNB을 거쳐 그들의 동의를 임상 프로토콜에 등록. CNBs는 현재까지 유방암, 한계 영역 림프종, 맨틀 세포 림프종, 전이성 paraganglioma, 자궁 경부 (편평 상피 세포) 및 난소 암 환자에서 수행되었다.- 중재 방사선 또는 관련 부서로부터 임상 인력 함유 멸균 원추형 원심 분리 관을 전처리 코어 생검을 수행하고 15 ml의 시료를 배치 유무 약 5 ㎖의 1 % 항생제 (페니실린 스트렙토 마이신)을 함유하는 최소 필수 매체 (MEM)의.
- 젖은 얼음에 생검 표본을 놓고 즉시 생체 신선한 조직 절편에 대한 실험실 공간으로 운반 할 것.
단면 및 Vibratome 설정 재료의 2 준비
- 단면 용 재료의 제조
- AGA 4 g을 첨가하여 4 % 아가로 오스 용액을 만들기PBS 100 ㎖로 상승했다. 오토 클레이브 (주기 설정 : 액체, 121 ° C, 30 분, 평방 인치 당 15파운드)를 처음 사용할 경우, 사용하기 전에 솔루션을 제공합니다. 이후 용도를 위해, 아가로 오스는 RT에서 굳은 것을 염두에 각각 사용하기 전에 (30 초 간격으로 높은 열을) 액화 적절 ~ 25 ° C (즉, 따뜻한 터치)으로 냉각 전자 레인지에서 4 % 아가로 오스를 배치합니다.
- 비 영구적 인 조직 내장 매체로 4 % 아가로 오스를 사용합니다. 4 %의 아가 로스를 충분히 냉각하고 무균 집게 매립 금형 티슈 시편을 넣고 4 % 아가 로즈 부어와 액체 상태 여전히 때.
- 매립 금형의 절삭면의 벽에 직접 주변 조직 시료 (~ 2mm의 거리)를 배치 아니지만. 4 % 아가로 신속 고화하기 때문에 적절히 빠르게 조직 시편을 위치시킨다. 단면 동안 솔루션을 유지하기위한 55 ° C의 물을 욕조에 4 % 아가로 오스를 유지합니다.
- 단면 분석 24 웰 플레이트에 1 ㎖의 O 추가각 웰에 F 완전한 미디어 (즉, MEM + 10 % 소 태아 혈청 + 1 % 항생제). 단면의 기간에 걸쳐 RT (~ 25 ° C)에서 24 웰 플레이트를 유지합니다.
- Vibratome 설정의 준비
- 진동 마이크로톰을 사용하여, (10)에 칼날이 시험편에 접근하는 속도 [10 (2.5 mm / 초) 0 (0.00 mm / 초)]와 블레이드 [0 (0 Hz에서)의 주파수를 설정 (100 Hz에서) ]. 조직 (즉, 밀도 / 탄력)의 질감에 따라 설정을 조정합니다.
- 침윤성 암의 주요 유방 종양의 경우, 각각 6, 3, 속도 및 주파수 설정을 조정합니다. 밀도가 낮은 / 회사 종양 조직의 경우, 속도가 감소하고 그에 따라 주파수를 증가시킨다.
- (- 999 μm의 1) 기기의 범위 내에서 부분의 두께를 설정합니다. 이러한 분석의 경우, 200 μm의에서 단면 두께를 설정합니다.
- 시험편 디스크 그쪽에 액상 접착제의 얇은 층을 사용하여 아가로 포매 표본 마운트t는 젖은 얼음에 쌌다 미디어의 저수지에 잠겨있다.
3 조직 단면, 처리 및 분석
- 즉시 전체 미디어의 1 ml의 멀티 웰 플레이트에서 멸균 포셉과 장소를 사용하여 단면에 정밀 슬라이스 섹션을 제거합니다. 충분한 부분이 상호 반응 및 분석을 위해 획득 될 때, 표준 조직 배양 조건 설정 조직 배양 인큐베이터에서 치료 반응을 위해 멀티 웰 플레이트를 배치했다.
- 배양 아티팩트 반대로 용량 의존적 반응을 확인하기위한 노력으로 처리 된 부분 책꽂이 다중 제어부를 타고. (- 4 시간 ~ 2) 18도 차가운 허혈 시간의 해로운 영향에서, - (40 분 ~ 30) 조직 빠르게 단면을 수행합니다. 단지 1 시간의 순응 기간 다음 섹션의 치료를 수행합니다.
- 1 시간의 순응 기간에 따라, 용량 (치료 관련 증가 추가;
- 치료 후, RT O에서 10 % 포르말린과 장소를 포함하는 튜브에 조직 절편을 배치하여 멸균 조건 및 포르말린으로 고정 섹션이 모두 제거 / N 또는 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 튜브 (유리 병에서 16 % 파라 포름 알데히드를 희석 2 시간 동안 RT에서 4 %의 최종 농도) 및 장소와 PBS.
- 큰 조직 섹션을 수정 (예. ~ 6mm X 4mm) 10 % 포르말린의 O에서 200 μm의 두께 / RT에서 N. 작은 부분을 수정 (예를 들면., 1mm X 1mm) 실온에서 2 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 200 μm의 두께.
NOTE : 정착액 (F)의 양을 효율적으로 침투ixative 조직의 부피를 20 배한다. 주어진 적절한 고정 사용하는 모든 조직의 크기에 정착 1 ㎖의 보증을위한 매우 작은 조직의 크기 (예를 들어, 6mm 3 조직 = 6 μL 볼륨),이 프로토콜의 결과. - 고정 후 조직 표본은 병리학 부서 담당자가 포함 된 파라핀있다. 충전 슬라이드 위에 파라핀 블록 표본 섹션 헤 마톡 실린 및 스테인드 에오신 및 평가 면역 조직 화학적 (예를 들면, 세포 사멸) 할 수 있습니다.
- 치료 후, RT O에서 10 % 포르말린과 장소를 포함하는 튜브에 조직 절편을 배치하여 멸균 조건 및 포르말린으로 고정 섹션이 모두 제거 / N 또는 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 튜브 (유리 병에서 16 % 파라 포름 알데히드를 희석 2 시간 동안 RT에서 4 %의 최종 농도) 및 장소와 PBS.
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Representative Results
이 연구를 위해 생체 외 기술은 열 충격 단백질 90 저해제 (Hsp90i)의 치료 감수성 / 내성 상관 분석에 사용 하였다. 이 Hsp90i, 유방암 일차 종양, ER + 침윤성 암종 (IDC), 및 관련된 림프절 전이의 임상 평가에 치료 반응을위한 생체 외 분석 하였다 (그림 1). 여러 200 μm의 시리얼 섹션 Hsp90i의 차량 만 증가 복용량 (0.25, 0.50, 1.0 및 2.5 μM)로 처리 하였다. 그림 1의 데이터는 포르말린에 고정 된 48 시간의 치료 기간에 따라 파라핀 (FFPE)와 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 섹션을 나타냅니다. 핵 형태 학적 변화에 의해 볼 때 2.5 μM 처리 조직 절편은 세포 사멸의 40 % 유도 결과 반면 처리 부분 제어 (전용 차량) 가능한 IDC 둥지를 보여줍니다 (즉, pyknotic 핵 / APOPtotic 파편) (그림 1A). 아폽토시스가 상기 단말 deoxynucleotidyl 전이 된 dUTP 닉 엔드 라벨링 (TUNEL)에 의해 기본 분석 종양에서 확인되었다 (데이터는 미도시). IC50은 약물의 농도에 비해 아폽토시스 백분율을 그래프 화하여 응답 데이터로부터 계산된다. 중요한 것은, 보호자는 Hsp90의 정상 및 암 세포 10 두의 중요한 신호 전달 경로의 단백질 안정화 및 항상성에 중요한 역할을합니다. 암의 Hsp90을 대상으로하는 기능은 악성 세포가 심하게 특히 전이성 진행 중 발생하는 황폐 한 환경의 스트레스 상태를 극복하기위한 노력의 일환으로,의 Hsp90의 chaperoning 기능에 의존한다는 연구 결과에 의존한다. 본질적으로, 암 세포는 '발암'의 Hsp90 (11)의 선택적 타겟팅 풀 결과의 Hsp90의 기능에 크게 의존된다. 삽입에서 그림 1A, 관련 꽈리 및 덕트와 인접 양성 소엽은 변경되지 않은 내가 남아n은 2.5 μM Hsp90i 처리 섹션을 참조하십시오. 우리가 알기로는이이 Hsp90의 암 특이성이 시각적으로 차 종양과 관련된 전이 Hsp90i 응답 평가에 포착이 처음이다. 림프절 전이 일차 종양 주변의 양성 유방 실질 내에 IDC (도 1a)뿐 아니라 혈관의 인접한 양성 소엽 볼과 연관된으로 변하지 양성 / 정상 세포의 이러한 발견은 (데이터는 도시되지 않음) 여러 가지로 효과적으로 요약 한 내용 종양의 종류 (예를 들면, 유방, 위 림프종의 전이).
이 차 종양의 첨부 림프절 전이가 느슨하게 관련이 있었다 IDC의 둥지 (그림 1B)에서 완전 반응을 보였다. TUNEL (그림 1C)에 의해 확인으로 꽉 타원체는, 그러나, 가능한 남아 형성 IDC의 둥지. 밝혀 면역에 의해 실행 가능한 IDC의 타원체의 추가 분석세포 - 세포 부착 분자, E-카드 헤린의 영구 또는 재 발현 (도 1C). 이 발견은과 일치 지속, 과발현이 높은 악성 치명적인 염증성 유방암 (12, 13)에 반영된 전이 가능성 또는 전이성 효율성을 추가하는 E-cadherin의의. 재미 있지만,이 발견은이 문서의 범위를 벗어납니다. 그러나, 이러한 림프절 (LN) IDC의 타원체 2 주 동안 배양 유지되었음을 주목하는 것이 중요하고, 따라서 전임상 약물 개발에 모두 감도 / 저항을 연구하는 생체 외 기법을 이용하여 강도에 신빙성을 준다.
생체 기술은 또한 종양 (16, 17)에서 대상 억제의 증거에 대한 핵심 바늘 생검 (CNBs)에 대한 임상 연구에 사용되어왔다. 전처리 코어 생검 (CNB) 절차를 수행한다 (그림 2)가 동의, 환자. 대등 한주 종양의 임상 평가에, 생체 외 기술은 액세스 전이 CNB 감도 또는 응답을 결정하는 데 사용된다. CNB의 여러 200 μm의 시리얼 섹션은 차량 만 Hsp90i의 증가 용량 (0.25, 0.50, 1.0 및 2.5 μM)로 처리 하였다. 생체 외 평가에 사용 Hsp90i 량의 수는 CNB의 크기에 의해 결정된다. 그러나, 모든 노력은 위에 제시 한 용량의 스펙트럼을 사용하도록 구성되어 있습니다. 전임상 생체 평가와 마찬가지로 반응은 환자의 반응의 실제에 비해 나중에 평가 될 수있다 (즉, 상관 관계 분석, 그림 2) 후 처리 CNB 약동학 (PK)에 의해 결정되는, 즉, 액체 크로마토 그래피를 통해 측정 된 약물 보존 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)은 환자 PET 영상 (도 2) (16, 17)뿐만 아니라 분석한다. 지금까지,이 C에서 생체 기술을 사용하여 분석linical 연구는 여러 종류의 암 (예, 유방, 한계 영역 림프종, 맨틀 세포 림프종, 전이성 paraganglioma, 자궁 경부 및 난소 암) (16)는, 상기 생체 기술을 구현 17. 전체 상관 관계 분석은이 기술의 유틸리티를 예시에 수행 된 임상 약물 개발.
ER + 유방암의 그림 1 예 생체 응답 해석. (, 스케일 바 100 μm의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색) (A, 왼쪽 패널) 침윤성 암 (IDC)의 가능한 둥지를 표시합니다. (스테인드 헤 마톡 실린 및 에오신, 스케일 바 100 μm의) Hsp90i의 2.5 μM로 처리 (A, 오른쪽 패널)에 40 % 세포 사멸 반응 ~ 유도 (화살표 pyknotic 핵 / 세포 사멸 파편)이있다. 양성 소엽
그림 임상 연구에서 생체 기술의 구현의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
효과적인 치료 전략을 개발하려고 할 때 암 생물 학자들은 상당한 도전에 직면하고 있습니다. 확립 암 세포주에서 약물 개발을 테스트하는 것은 정확하게 생체 반응과 PDX 모델에서 생체 내 실험은 노동 집약적이고 비용이 매우 다를 수있다. 상기를 감안 기본 환자의 생체 기술의 애플리케이션 (15)은 현재 설정된 암 세포주와 환자 유래의 이종 이식 (PDX)의 분자량 분석 옆에 위치되는, 14 종양.
이 문서는 기술이 충실하게 응답에 (IC50)를 알려주는 것을에 새로운 높이로, 오프 - 타겟 효과를 생체 기술의 적용을 받아 저항과 피드백 메커니즘을 분자 분석을 할 수 있습니다. 응답 데이터는 종양 분자 프로필에 종양 몰 대 (즉, 단백질, 종양 바이오 마커의 발현, 돌연변이) 상호 연구 (응답 상관되면ecular 프로필) 환자의 결과를 개선하기위한 노력으로, 특정 약물에 반응 할 가능성 환자를 선택하는 데 사용될 수있다. 가장 중요한 것은, 임상 약물 개발 (예., 옵션 생검)에서 전처리 CNB의 생체 반응이 환자의 반응에 상관 관계 (및 검증) 할 수 있습니다 (즉, 후 처리 CNB) 및 약물 유지 (약동학 (PK) 평가) 16, 17. (; Hsp70에게 유도 즉, PD) 및 투여 량과 16,17 스케줄링에 알려 본 임상 연구에서 생체 기술의 사용은 종양 반응뿐만 아니라 확인 타겟 특이성을 확인할 수 있었다.
생체 외 기술은 대부분의 고형 종양 유형 의무뿐만 아니라 혈액 유래 암 전이 (예를 들면, 림프종의 림프절 전이) 마이너 과제를 제시 특정 종양 유형에 대한 프로토콜에 약간의 조정을 가진. 예를 들어, 췌장 종양은 높은 S를 갖는 경향나쁨 암세포 표현이 섹션에서 발생할 수있는 종양 세포의 비율에 troma. 종양의 암세포 풍부한 지역의 조달은 총 분석에 할 수 없습니다. 따라서 종양 표본에서 여러 개의 작은 입방 형 영역 (4 / 아가 임베딩 금형)을 포함하고, 종양 세포가 풍부한 생체 섹션의 확률을 증가 동시에 절단 할 수있는 가능성이 단점을 극복한다.
우리의 데이타는 강하게 전임상 약물 개발 (도 1)에서 생체 기술의 사용을 지원한다. 응답 (IC50)과 함께 섹션이 효과 약물 노출이 분비 인자 (예를 들면, 사이토 카인, 엑소 좀), 저항과 피드백 메커니즘과 중요한에이 대체 가능성 분석, 대사 체학, 조합 치료 전략에 대해 분석 할 수 복제, 오프 대상에 통보 효과 (즉, 정상 및 양성 세포). Hsp90i 사용이 특정 연구에서, SPE 타겟팅cificity 및 '오프 - 타겟 효과'의 식별은 단지 키 (10)에 변형 악성 암세포에서 발견되는 '종양의 Hsp90'의 특징적인 풀이 있다는 전제에 기초한다. 이 생체 Hsp90i 처리 된 부분의 양성 소엽이 변경되지 않은 남아 결과 섹션 (삽입, 그림 1A)에 제시되어있다. 현장 (DCIS)에서 관련 유관 암종 (데이터가 표시되지 않음) 변경되지 않은 채 남아있는 반면 그림 1에 반영 동일한 기본 종양의 다른 섹션에 동일한 중요성, 중, 10 μM (치료 관련이없는 용량) 처리 부분은 IDC 둥지의 완전 반응을 보였다 . 연구의이 줄 미래의 조사는이 글의 범위를 벗어난다. 그러나,이 발견은 특정 종양에 대해 '악성 형질 전환'또는 IDC 시험편에 연관된 DCIS의 질병 진행의 상태에 알린다HSP90 작용과 약물 개발에 생체 외 기법을 사용하는 유틸리티를 지원 chaperoning.
생체 기술의 또 다른 응용 프로그램은 종양 이종 이식 모델에서 사전 효과 분석에 사용 (예., 생체 PDX의 절편) 신약 개발의 약동학 / 약력학 (PK / PD) 관련 수행하기 전에, 비용이 많이 드는 데이터를 확인하는 것입니다 의 생체 내 (in vivo) 연구 - 허용 더 많은 정보 비용 효율적인 생체 내 약물의 효능 연구.
주요 단계 및 생체 기술의 전위 제한 요소는 조달 및 절편이다. 종양 표본 조달 (즉., 일차 종양 / 전이) 생존을 최고 수준으로 종양의 영역을 식별하기에 세심한주의로 신속하게 수행되어야한다. 큰 종양은 심하게 볼 수 없습니다 괴사 중부 지역을하는 경향이있다. 따라서, 조달 조직 F롬 가장 바깥 쪽 테두리는 가능한 표본을 얻는 확률을 증가시킨다. , 단면에 원하는 두께 정밀도 슬라이스 수집에 대해서는 (예., 200 μM)은 크게 (인해 매우 작은 사이즈로 CNBs 제외) 종양 밀도 / 탄력에 의해 영향을 받는다. 예를 들어, 침윤성 암은 일반적으로 침윤성 소엽 암종 달리 훨씬 더 조밀하다. 조밀 한 종양 조직은 적당한 저항을 제공한다 - 영구 매립 매체 부재 - 블레이드, 덜 조밀 한 종양 조직하지 못하다. 저밀도 종양 조직 유형의 예로는 침윤성 소엽 암종, 점액 성 암종 및 위암 종양 유형에 한정되지 않는다. 이러한 잠재적 인 제한을 극복하기 위해, 고장 처리 적절한 블레이드 속도 및 주파수가 필요하다. 일관된 정밀 슬라이스 단면 두께는, 단면 처리 과정을 통해, 약물 반응의 정확한 평가에 중요하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Leica VT1000s | Leica | 14047235613 | |
| UltraPure agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 4% and 6% before use |
| Injector blade | Ted Pella | 121-4 | |
| MEM with Penicillin + Streptomycin | Media Core Facilities (MSKCC) | The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center | |
| Scalpel no. 10 | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Disposable forceps | Cole-Parmer | 84011182 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Science | 70181 | |
| FBS (heat inactivated) | Gemini | 100106 | |
| 24 well plates | Corning | 3524 | |
| Formalin (10%) | Sigma Diagnostics | SDHT501128 | |
| 16% Formaldehyde solution | Thermo Scientific | 28908 | |
| Embedding microsettes | Simport | M503-2 | |
| Ethanol (70%) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 15-462-2SQ | |
| Microwave | General Electric | ModelJES2051DNBB | |
| Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) | Sigma-Aldrich | E1505-5G | |
| 10 mm dishes | BD Falcon | 353003 | |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 |
References
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