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Medicine

Ex-vivo-Ansprechen auf die Behandlung von Primärtumoren und / oder assoziierten Metastasen für die präklinische und klinische Entwicklung von Therapeutika

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Gegründet Krebszelllinien und Heterotransplantate waren die Hauptstütze der Krebsforschung in den letzten Jahrzehnten. Jedoch schlägt letzten Beweis, dass therapeutische Reaktion wird durch die Tumorzelle Mikro beeinflusst. Daher haben wir eine ex vivo-Analyse des Primärtumorproben für die Arzneimittelentwicklung Zwecke entwickelt.

Introduction

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Entwicklung wirksamer Krebstherapeutika hat sich als äußerst schwierig. Krebszelllinien und Tumor Explantate - ebenso wie Heterotransplantate wurden in der Krebsforschung seit über einem halben Jahrhundert 1,2,3 verwendet. Bis heute ist die molekulare Analyse von Arzneimittelempfindlichkeit und Widerstand in beiden etablierten Krebszelllinien und Patienten abgeleitete Xenografts (PDX) unverzichtbar. Jedoch ist der Test-Verbindungen in etablierte Krebszelllinien oft nicht prädiktiv für die Wirksamkeit in vivo, und die entsprechenden in vivo-Untersuchungen an Tieren, insbesondere in PDX Modelle, ist sehr teuer und zeitaufwendig. Die Grenzen dieser Modellsysteme, nämlich der Unfähigkeit, über den Einfluss der nativen Mikroumgebung der Tumorprogression und der Reaktion auf therapeutische Strategien zu informieren, hat das Forschungsfeld, um zusätzliche Methoden, um diese Analysen zu entwickeln Kompliment geführt. Der letzten, ist erhöhte Aufmerksamkeit in Richtung Ex-vivo-Analyse von Patienten TUM bezahltoder Explantaten 4, 5 aufgrund der besseren Verständnis, dass Krebs therapeutische Antwort nicht exklusiv ist, um die inhärente molekulare Zusammensetzung von Krebszellen, sondern wird stark durch die Tumorzelle Mikro 6, 7 eine Funktion, die nicht durch herkömmliche Kultivierungsverfahren und rekapitulieren beeinflusst / oder PDX. Ex-vivo-Analyse in der obigen Kontext (dh., Einfluss der benachbarten Umgebung von Tumorzellen Mikroumgebung) impliziert Bewertung von lebensfähigen primären Tumor / Metastasen Abschnitte, statt ex vivo Analyse zellulärer Isolate 8, 9.

Wir berichten hier über einen Ex-vivo-Technik (dh., Präzise geschnittenen frischen Gewebeschnitten) der beiden Patienten Primärtumoren und Metastasen assoziiert (dh Lymphknoten), die treu informiert über Antwort (IC50), Off-Target-Effekte und ermöglicht für die molekulare Analyse von Widerstand und Feedback-Mechanismen. Zusätzlich wird ein Korrelat Analyse therapeUTIC Empfindlichkeit / Resistenz gegen Biomarker und Genexpressionsprofil kann in dem Bemühen, Patienten eher zu dem experimentellen Medikament von Interesse reagieren zu identifizieren durchgeführt werden (dh., hohe Medikamentenantwort passt Patienten mit bestimmten biologischen Profil). Anwendung der Ex-vivo-Technik und Bewertung in einer Multi-Parameter-Mode ist Bewegung in Richtung Patientenauswahl und die allgemeine Verbesserung der klinischen Ergebnisse.

Ex-vivo-Behandlung Response-Analyse konnte ein Standardwerkzeug in der präklinischen und klinischen Entwicklung von Krebstherapeutika zu werden und wird als ein Schritt hin zu einer personalisierten Medizin Ansatz in der therapeutischen Entwicklungsstrategien in Betracht gezogen.

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Protocol

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HINWEIS: Patientengewebebeschaffung wurde durch institutionell Review Board (IRB) zugelassenen -zugelassene Biospecimen und Klinische Protokolle (Protokoll-Nummern 09-121 und 11-041, beziehungsweise) am Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Gewebebeschaffung

  1. Beschaffung von Patienten Primärtumor / Metastasen
    HINWEIS: Bis heute hat dieses Protokoll auf chirurgisch entfernt Pankreas, Magen-und Brusttumorarten, sowie, Lymphom Metastasen durchgeführt.
    1. Richten Sie die OP-Team, um die Probe per Kurier oder Rohrpostsystem der Pathologie-Abteilung in dicht verschlossenen und sterile dicht Kunststoffbeutel in sterilen Probenspritzwassergeschützte Behälter zu liefern. Richten Sie die OP-Team, um die Probe im frischen Zustand ohne Formalin oder Fixiermittel zu transportieren.
    2. Richten Sie den Pathologen oder Pathologe Assistent der frischen Probe ernten mit sterilen Technik, die incLudes Verwendung von sterilen Handschuhen und Instrumente unter einer Steril.
    3. Notieren Sie sich die Erntezeit der beschafften Probe, die streng unter 30 min von der Beendigung des chirurgischen Eingriffs gehalten wird. Unter Berücksichtigung der Effekte kalten Ischämie, Proben nehmen Sie nicht aus reseziert Proben mit einer kalten Ischämiezeit von> 30 min 18.
    4. Leiten der Pathologie Personal an eine primäre Tumorprobe von etwa 0,5 cm3 bis 1,0 cm 3 in einem Abzug mit laminarer Strömung zu entfernen, um eine sterile Umgebung aufrechtzuerhalten. Wenn möglich, wählen Tumorgewebe von der Peripherie der Läsion Indexpotential Frank zentrale Nekrose (Zelltod) zu vermeiden.
      HINWEIS: Die nekrotischen Gewebe kann grob durch eines der folgenden Kriterien erkennbar sein: Verlust von Farbe oder Blässe des Gewebes; Verlust von Kraft, in dem nekrotischen Gewebe ist weich und brüchig; eine deutliche Abgrenzung zwischen nekrotischen und lebensfähiges Gewebe.
    5. Richten Sie die pathologist oder Pathologe Assistent peripheren Gewebe, das im Überschuss (chirurgische Ablage) ist nach sofortiger Abtastung des Tumor für Diagnostik liefern. Die Probe wird in einem 15 ml sterilen konischen Zentrifugenröhrchen mit annähernd 5 ml Minimalmedium (MEM), das 1% Antibiotika (Penicillin und Streptomycin).
    6. Falls vorhanden (zB Lymphknoten Achsel Schwanz Mastektomie Probe), beschaffen grob positive Lymphknoten assoziiert Probe der gleichen Größe (0,5 cm 3 bis 1,0 cm 3) und zu vergleichen, um das Ansprechen auf Medikamente des Primärtumors. Wie die Primärtumorprobe, legen die zugehörigen Lymphknoten Probe in einem 15 ml sterilen konischen Zentrifugenröhrchen mit annähernd 5 ml Minimalmedium (MEM), das 1% Antibiotika (Penicillin und Streptomycin).
    7. Wenn die Größe der chirurgischen Probe Genehmigungen (zB Mastektomie Probe), zu entfernen (entfernt von Primärtumor) einer Probe von normalem Gewebe (dhnormalen dicht / Faser Brustparenchym) und in eine 15 ml sterilen konischen Zentrifugenröhrchen mit etwa 5 ml Minimalmedium (MEM), die 1% Antibiotika für nur Übertragungszwecken. Nach dem Transfer auf die Laboreinrichtungen, übertragen Sie die "normalen" Probe einem Kryoröhrchen, "Snap" einzufrieren und an einem -80 ° C Gefrierschrank für zukünftige molekulare Analysen.
    8. Legen Sie alle Proben auf nassem Eis und sofort in den Laborraum für ex vivo frischem Gewebe Schnitte zu transportieren. Abschnitt nicht die normale Probe, sondern in einem -80 ° C nicht speichern Gefrierschrank für zukünftige molekulare Analysen. Übertragen einen Teil des Primärtumors und der zugehörigen Metastasen in einem Kryoröhrchen, "Snap" einzufrieren und an einem -80 ° C Gefrierschrank für zukünftige molekulare Analysen.
  2. Beschaffung von Gewebe aus klinischen Studien (zB optional Kernnadelbiopsien (CNB))
    HINWEIS: Wir erhalten Tumorgewebe von Patientenauf klinische Protokolle, die ihre Zustimmung zu einer CNB einer zugänglichen Tumormetastasierung vor Beginn der Therapie zu unterziehen geben eingeschrieben. CNBs bis heute haben sich auf Patienten mit Brust-, Randzone Lymphom, Mantelzell-Lymphom, Metastasen paraganglioma, des Gebärmutterhalses (Plattenepithelkarzinom) und Eierstockkrebs durchgeführt.
    1. Haben klinische Personal aus Interventionelle Radiologie oder Fachabteilung führen eine Vorbehandlung Stanzbiopsie und platzieren Sie die Probe in einem 15 ml konischen sterile Zentrifugenröhrchen mit etwa 5 ml Minimalmedium (MEM), die 1% Antibiotika (Penicillin und Streptomycin).
    2. Legen Sie die Biopsie auf nassem Eis und sofort auf den Laborraum für ex vivo frischem Gewebe Schnitte zu transportieren.

2. Herstellung von Materialien für Schnitte und Vibratom Einstellungen

  1. Vorbereitung der Materialien für die Schnitte
    1. Stellen Sie einen 4% igen Lösung durch Zugabe von 4 g agastieg auf 100 ml PBS. Autoklaven (Zykluseinstellungen: flüssig, 121 ° C, 30 min, 15 Pfund pro Quadratzoll) die Lösung vor dem ersten Gebrauch. Für nachfolgende Verwendungen, legen Sie die 4% Agarose in der Mikrowelle auf (hohe Hitze für 30 Sekunden-Intervallen) vor jeder Verwendung zu verflüssigen und kühlen angemessen auf ~ 25 ° C (dh warm an) bewusst, dass Agarose erstarrt bei RT.
    2. Verwenden Sie die 4% Agarose als nicht-ständiges Einbettung Gewebe Medien. Wenn die 4% Agarose ausreichend abgekühlt ist und sich noch in einem flüssigen Zustand mit einer sterilen Pinzette Platzieren der Gewebeprobe in einem Einbettmedium Form gießen und in 4% Agarose.
    3. Die Gewebeprobe in der Nähe (ca. 2 mm Abstand), aber nicht direkt in der Schneidfläche Wand der Einbettung Form. Die 4% Agarose beginnt schnell zu verfestigen, damit entsprechend der Gewebeprobe zu positionieren schnell. Während des Schneidens, halten Sie die 4% Agarose in einem 55 ° C Wasserbad in Lösung zu halten.
    4. Zu einem 24-Well-Platte für Schnittanalyse, 1 ml of Vollmedien (dh MEM + 10% fötales Rinderserum + 1% Antibiotika) in jede Vertiefung. Halten Sie die 24-Well-Platte bei RT (~ 25 ° C) während der Dauer der Schneiden.
  2. Vorbereitung der Vibratom Einstellungen
    1. Verwendung der vibrierenden Mikrotom, stellen Sie die Geschwindigkeit, mit der die Klinge nähert die Probe [0 (0,00 mm / s) auf 10 (2,5 mm / sec)] und die Frequenz der Klinge [0 (0 Hz) bis 10 (100 Hz) ]. Passen Sie die Einstellungen nach der Beschaffenheit des Gewebes (dh Dichte / Festigkeit).
    2. Für einen primären Brusttumor von invasiven duktalen Karzinom, passen Sie die Einstellungen bis 6 und 3, Geschwindigkeit und Häufigkeit auf. Für weniger dicht / Firma Tumorgewebe, reduziert sich die Geschwindigkeit entsprechend zu erhöhen und Frequenz.
    3. Stellen Sie die Schnittdicke innerhalb der Grenzen Instrument (1-999 um). Für diese Analysen, stellen Sie die Schnittdicke auf 200 um.
    4. Montieren Sie die Agarose eingebettete Probe mit einer dünnen Schicht aus flüssigem Klebstoff auf der Objektplatte that in einem Reservoir von Medien, die in nassem Eis eingeschlossen ist taucht.

3. Gewebe Schnitte, Behandlung & Analysen

  1. Sofort nach Schneiden mit einer sterilen Pinzette und in eine Multi-Well-Platte mit 1 ml Vollmedium entfernen Sie die präzise geschnittenen Abschnitte. Wenn genügend Abschnitte sind für die Antwort und korrelativen Analysen erworben, legen Sie die Multi-Well-Platte zur Behandlung Reaktion in einem Gewebekulturbrutschrank bei Standardgewebekulturbedingungen eingestellt.
  2. Nehmen mehrere Steuerabschnitte, die die behandelten Bereiche in dem Bemühen, eine dosisabhängige Reaktion zu bestätigen, im Gegensatz zu kultivierten Artefakte Buchstütze. Führen Schneiden schnell Gewebe (~ 30 - 40 min), der in jedes nachteiligen Auswirkungen der kalten Ischämiezeit (~ 2-4 h), 18. Führen Behandlung der Abschnitte erst nach einer Eingewöhnungszeit 1 Stunde.
  3. Nach der Eingewöhnungszeit 1 Stunde, fügen steigenden Dosen (therapeutisch relevant ist;
  4. Nach der Behandlung entfernt alle Abschnitte steril und Formalin-fix, indem der Gewebeabschnitt in einer Röhre, die entweder 10% gepuffertem Formalin und Stelle bei RT O / N oder in einem Rohr, enthaltend 4% Paraformaldehyd (Verdünnung 16% Paraformaldehyd aus einem Fläschchen mit PBS für eine endgültige Konzentration von 4%) und Platz bei RT für 2 Stunden.
    1. Fix größeren Gewebeschnitten (zB., ~ 6 mm x 4 mm) 200 um dick in 10% Formalin O / N bei RT. Beheben kleinere Abschnitte (beispiels., 1 mm x 1 mm), 200 um dick, in 4% Paraformaldehyd 2 h bei RT.
      HINWEIS: Für eine effiziente Penetration der Fixierungs das Volumen von fixative sollte das Volumen des Gewebes 20x werden. Angesichts, dass dieses Protokoll zu extrem kleinen Gewebe Größen (zB 6 mm 3 Gewebe = 6 ul Volumen), für Sicherung der richtige Fixierung Verwendung von 1 ml Fixiermittel für alle Gewebe Größen.
    2. Nach der Fixierung müssen die Gewebeproben in Paraffin durch die Pathologie-Abteilung Personal eingebettet. Abschnitt Probe Paraffinblöcke auf geladene Objektträger zu Hämatoxylin und Eosin gefärbt und bewertet immunhistochemisch (zB Apoptose) sein.

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Representative Results

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Für diese Studie wurde die Ex-vivo-Technik in einem korrelativen Analyse der therapeutischen Empfindlichkeit / Widerstand eines Hitzeschockprotein 90-Inhibitor (Hsp90i) verwendet. In einer präklinischen Bewertung dieses Hsp90i, den Primärtumor Brustkrebs, einem ER + invasive duktale Karzinom (IDC) und die zugehörigen Lymphknoten-Metastasen wurden ex vivo zur Behandlung Reaktion analysiert   (Abbildung 1). Mehrere 200 um serielle Schnitte wurden mit Vehikel allein und steigenden Dosen (0,25, 0,50, 1,0 und 2,5 uM) des Hsp90i behandelt. Die Daten in Abbildung 1 für Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) und Hämatoxylin & Eosin (H & E) gefärbten Schnitten nach einer Behandlungsdauer von 48 Stunden. Die Kontrolle (nur Vehikel) behandelt Abschnitt zeigt lebensfähige IDC Nester während die 2,5 uM behandelten Gewebeschnitt führte zu einer 40% Induktion von Apoptose, wie durch Atom morphologischen Veränderungen beobachtet (dh pyknotischen Kernen / apopTotic Debris) (1A). Apoptose wurde in der Primärtumor durch Desoxyribonukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL)-Analyse bestätigt (Daten nicht gezeigt). IC50 von Antwortdaten von der grafischen Darstellung Apoptose Prozent gegen die Konzentration des Arzneimittels berechnet. Deutlich, die Chaperon Hsp90 spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinstabilisierung und Homöostase der kritischen Signalwege der normalen und Krebszellen 10. Die Fähigkeit zur Behandlung von Krebs in Hsp90 beruht auf der Erkenntnis, dass maligne Zellen stark von der chaperoning Funktion von Hsp90, insbesondere in dem Bemühen, Spannungszustände der unwirtlichen Umgebungen bei metastatischen Progression stoßen. Im Wesentlichen hängt stark von Hsp90-Funktion, was zu einer selektiven anzielbare Pool von 'onkogenen' Hsp90 11 werden Krebszellen. Im Einsatz, 1A, neben gutartigen Läppchen mit verbundenen Acini und Kanal unverändert bleibt in der gleiche 2,5 uM Hsp90i behandelten Abschnitt. Nach unserer Kenntnis ist dies das erste Mal, Hsp90 Krebs-Spezifität wird visuell in Hsp90i Antwort Bewertung von Primärtumoren und Metastasen assoziiert eingefangen. Diese Feststellung des unveränderten gutartig / normale Zellen als in benachbarten gutartige Läppchen von IDC (Abbildung 1A) sowie Gefäße innerhalb der umgebenden gutartige Brustdrüsengewebe des Primärtumors gesehen und zugehörigen Lymphknotenmetastasen (Daten nicht gezeigt) hat in verschiedenen rekapituliert worden Tumorarten (zB Brust-, Magen-und Lymphom Metastasen).

Eine begleitende Lymphknotenmetastase dieser Primärtumor zeigte eine vollständige Reaktion nur in den IDC-Nester, die lose verbunden waren (1B). IDC Nester, die eng Sphäroiden, jedoch lebensfähig blieb wie durch TUNEL (Abbildung 1c) bestätigt gebildet. Zusätzliche Analyse der lebensfähigen IDC Sphäroiden mittels Immunfluoreszenz zeigte,eine anhaltende oder wieder Expression des Zell-Zell-Adhäsionsmolekül, E-Cadherin (Abbildung 1C). Dieser Befund ist konsistent mit anhaltender Überexpression von E-Cadherin-Zugabe zu dem metastatischen Potential oder metastasierten Effizienz in der hochmalignen, tödliche entzündliche Brustkrebs 12, 13 reflektiert. Obwohl interessant ist dieses Ergebnis über den Rahmen dieses Dokuments. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Lymphknoten (LN) IDC Sphäroiden wurden in Kultur für einen Zeitraum von 2 Wochen aufrechterhalten und verleiht somit Glauben an die Stärke des mit dem Ex-vivo-Technik, um sowohl die Empfindlichkeit / Widerstand in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu studieren.

Die ex vivo-Technik wurde auch in einer klinischen Studie zur Kernnadelbiopsien (CNBs) zum Nachweis von Ziel-Hemmung in Tumoren 16,17 eingesetzt. Patienten, die Zustimmung, eine Vorbehandlung Stanzbiopsie (CNB) Verfahren durchgeführt (Abbildung 2). Vergleichbarauf die präklinische Bewertung von Primärtumoren ist die Ex-vivo-Technik verwendet, um die Empfindlichkeit oder eine Reaktion in der CNB von zugänglichen Metastasen zu bestimmen. Mehrere 200 um serielle Schnitte der CNB wurden nur und zunehmenden Dosen (0,25, 0,50, 1,0 und 2,5 uM) des Hsp90i Vehikel behandelt. Die Zahl der in Ex-vivo-Beurteilung verwendet Hsp90i Dosen wird durch die Größe der CNB diktiert. Allerdings werden alle Anstrengungen unternommen, um das Spektrum der Dosen oben vorgeschlagen zu verwenden. Wie der Ex-vivo präklinische Bewertung kann Antwort ausgewertet und später im Vergleich zu den tatsächlichen des Ansprechens des Patienten (dh Analysen Korrelat Abbildung 2), wie sie nach der Behandlung CNB pharmakokinetischen (PK) bestimmt, dh, Drogenbindung als über Flüssigchromatographie gemessen Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) analysiert als auch in PET-Bildgebung Patienten (Abbildung 2) 16,17. Bisher Analysen mit Hilfe der Ex-vivo-Technik, die in diesem caufgedruckten Studie hat auf verschiedenen Tumorarten (zB Brust, Randzone Lymphom, Mantelzell-Lymphom, Metastasen paraganglioma, Gebärmutterhals-und Eierstockkrebs) 16, 17. Volle Korrelat Analyse der Umsetzung der Ex-vivo-Technik weiter veranschaulicht den Nutzen dieser Technik, die in durchgeführt wurde klinischen Arzneimittelentwicklung.

Figur 1
Abbildung 1. Ex-vivo-Response-Analyse eines ER + Brustkrebs. (A, links) zeigt tragfähige Nester invasive duktale Karzinom (IDC) (Hämatoxylin und Eosin gefärbt; Maßstab 100 um). Bei der Behandlung (A, rechts) mit 2,5 um Hsp90i gibt es eine Induktion von ~ 40% apoptotische Reaktion (pyknotische Kerne / apoptotischen Schutt; Pfeile) (Hämatoxylin und Eosin gefärbt; Maßstab 100 um). Gutartige Läppchen g> (A, Einsatz) bleiben unverändert nach der Behandlung (Hämatoxylin und Eosin gefärbt; Maßstab 200 um). Die Steuerung eines zugehörigen Lymphknoten (LN) (B, links) zeigt ein kleines Maß an Apoptose (Hämatoxylin und Eosin gefärbt; Maßstab 100 um), während die behandelten Abschnitt (B, rechte Felder) zeigen einen Bereich von metastasierendem IDC Nester mit vollständigem Ansprechen (Hämatoxylin und Eosin gefärbt; Maßstab, im Uhrzeigersinn 2 mm, 300 um, 200 um und 200 um). Jedoch fest IDC Sphäroiden (Spheroids; Sp) aus dem gleichen Abschnitt (C, links) zeigen wenig, wenn überhaupt, die Apoptose durch TUNEL-Analyse gezeigt lebensfähige Rest mit einer gleichzeitigen (Maßstab 200 um) (C, rechts) über -Ausdrucks von E-Cadherin (Vergrßerung 100x).> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Umsetzung der Ex-vivo-Technik, die in einer klinischen Studie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Krebs Biologen vor großen Herausforderungen, wenn man versucht, wirksame therapeutische Strategien zu entwickeln. Testen von Medikamenten in der Entwicklung auf etablierte Krebszelllinien nicht genau in vivo Reaktion und in vivo Versuchen an PDX Modelle sind arbeitsintensiv und sehr teuer. Angesichts des Vorstehenden wird die Anwendung der Ex-vivo-Techniken der Primärtumoren Patienten 14, 15 wird nun neben der molekularen Analyse von etablierten Tumorzelllinien und von einem Patienten abgeleitete Xenografts (PDX) positioniert ist.

Dieses Papier nimmt die Anwendung der Ex-vivo-Technik auf eine neue Höhe, dass die Technik informiert treu auf Antwort (IC50), Off-Target-Effekte und ermöglicht für die molekulare Analyse von Widerstand und Feedback-Mechanismen. Wenn Antwortdaten werden auf den Tumor molekulare Profil korreliert (dh die Proteinexpression von Tumor-Biomarkern Mutationen) der Korrelationsstudie (Antwort gegen Tumor molecular Profil) kann verwendet werden, um Patienten mit größerer Wahrscheinlichkeit auf ein bestimmtes Medikament ansprechen zu wählen, in dem Bemühen, Behandlungsergebnisse zu verbessern. Am wichtigsten ist, in der klinischen Arzneimittelentwicklung (dh., Optional Biopsien), ex vivo Antwort der Vorbehandlung CNB kann in Ansprechen des Patienten korreliert werden (und validiert) (dh nach der Behandlung CNB) und Drogen Retention (pharmakokinetischen (PK)-Auswertung) 16,17. Die Verwendung der Ex-vivo-Technik, die in dieser klinischen Studie war in der Lage, Tumor-Antwort sowie confirm Zielspezifität zu bestimmen (dh, PD; Hsp70-Induktion) und informieren über die Dosierung und Terminierung 16,17.

Die ex vivo-Verfahren ist offen für die meisten soliden Tumorarten sowie hämatogenen Metastasen (zB Lymphknotenmetastasen von Lymphomen) mit leichten Anpassungen des Protokolls für bestimmte Tumortypen, die kleinere Herausforderungen. Zum Beispiel Tumore des Pankreas dazu neigen, eine hohe s habentroma Tumorzellquote, die in den Abschnitten, die schlechte Darstellung von Krebszellen haben führen können. Beschaffung von Krebszellen reichen Gebieten der Tumor nicht an den Brutto Analyse vorgenommen werden. Daher, um dieses potentielle Schwach mehrere kleinere kubische Bereiche der Tumorprobe eingebettet werden kann (4 / Agarose-Einbettungsform) und gleichzeitig geschnitten Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer Tumorzelle ex vivo-reichen Abschnitt überwinden.

Unsere Daten unterstützen nachdrücklich die Nutzung der Ex-vivo-Technik in der präklinischen Arzneimittelentwicklung (Abbildung 1). Zusammen mit Antwort (IC50), replizieren Schnitte für alternative Lebensfähigkeitstests, Metabolomics, kombinatorische Therapiestrategien, Wirkung Arzneimittelexposition hat auf sezernierte Faktoren (zB Zytokine, Exosomen), Widerstand und Feedback-Mechanismen und vor allem untersucht werden, informieren auf Off-Target- Wirkungen (dh normalen und benignen Zellen). In dieser speziellen Studie, die eine Hsp90i verwendet, Ziel specificity und Identifizierung von "Off-Target-Effekte ist der Schlüssel auf der Prämisse, dass es einen markanten Pool von 'onkogenen Hsp90' nur in Krebszellen auf die maligne Transformation 10 gefunden wird. Dies wird im Ergebnisteil (Insert, 1A), wo gutartige Läppchen von einem Ex-vivo-Hsp90i behandelt Abschnitt blieb unverändert präsentiert. Von gleicher Bedeutung, in einem anderen Abschnitt der gleichen Primärtumor in Abbildung 1 reflektierte gefunden, eine 10 um (therapeutisch irrelevant Dosis) behandelt Abschnitt zeigte eine vollständige Reaktion von IDC Nester wohin verbunden duktalen Carcinoma in situ (DCIS) blieb unverändert (Daten nicht gezeigt) . Zukünftige Untersuchungen in diesem Forschungs gehen über den Rahmen dieses Papiers. , Informiert aber diese besondere Feststellung über den Zustand der "malignen Transformation" oder Fortschreiten der Krankheit von assoziierten DCIS in IDC Proben, in Bezug auf die onkogeneHsp90 chaperoning funktioniert und unterstützt den Nutzen der mit der Ex-vivo-Technik, die in der Arzneimittelentwicklung.

Eine weitere Anwendung der Ex-vivo-Technik ist die Verwendung in der Vor-Wirksamkeitsanalyse in Tumorxenotransplantat Modelle (dh., Ex vivo Schnitte von PDX) in der Arzneimittelentwicklung, um die pharmakokinetischen / pharmakodynamischen (PK / PD) Daten vor der Durchführung beteiligt sind, festzustellen, kostspielige In-vivo-Studien - so dass für eine fundierte, kostengünstige In-vivo-Wirksamkeit von Medikamenten Studie.

Die wichtigsten Schritte und mögliche limitierende Faktoren der Ex-vivo-Technik sind die Beschaffung und Schnitte. Beschaffung der Tumorprobe (dh., Primärtumor / Metastasen) muss zügig mit viel Liebe zum Identifizieren eines Bereichs des Tumors mit dem höchsten Grad der Rentabilität durchgeführt werden. Großen Tumoren neigen dazu, nekrotischen zentralen Bereichen, die nicht grob sichtbar sind. Daher Beschaffung Gewebe fROM Die äußersten Rand erhöht Wahrscheinlichkeit eine lebensfähige Probe. Bezüglich Schneiden, Sammeln Präzisionsschnitten in der gewünschten Dicke (z., 200 um) stark von Tumor Dichte / Festigkeit (ohne CNBs aufgrund der extrem kleinen Größe) beeinflusst. Zum Beispiel ist invasiven duktalen Karzinom der Regel im Gegensatz zu invasiven lobulären Karzinomen viel dichter. Dichten Tumorgewebe liefert entsprechende Widerstand - in Abwesenheit von Dauer Einbettung Medien - auf die Klinge, während weniger dichte Tumorgewebe nicht. Beispiele der weniger dichten Tumorgewebearten umfassen, sind aber nicht invasiven lobulären Karzinomen, muzinöses Karzinome und Magentumortypen beschränkt. Um dieses Potenzial Beschränkung zu überwinden, ist die Fehlersuche mit entsprechenden Messerdrehzahl und Frequenz erforderlich. Gleichbleibende Präzision-Schnittdicke geschnitten, in der gesamten Schneidevorgang, ist entscheidend für die genaue Beurteilung der Reaktion auf Arzneimittel.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>Ex-vivo-Ansprechen</em> auf die Behandlung von Primärtumoren und / oder assoziierten Metastasen für die präklinische und klinische Entwicklung von Therapeutika
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Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

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