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Medicine

Ex Vivo respuesta al tratamiento de los tumores primarios y / o Asociados Metástasis de Preclínica y Desarrollo Clínico de Terapéutica

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Establecido líneas celulares de cáncer y xenoinjertos han sido el pilar de la investigación del cáncer durante las últimas décadas. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que la respuesta terapéutica está fuertemente influenciado por el microambiente de las células tumorales. Por lo tanto, hemos desarrollado un análisis ex vivo de las muestras de tumor primario con fines de desarrollo de fármacos.

Introduction

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El desarrollo de la terapéutica del cáncer eficaces ha demostrado ser extremadamente difícil. Líneas celulares de cáncer y explantes tumorales -, así como xenoinjertos se han utilizado en la investigación del cáncer durante más de medio siglo 1,2,3. Hasta la fecha, el análisis molecular de sensibilidad a los fármacos y la resistencia en las dos líneas celulares de cáncer establecidos y xenoinjertos derivados del paciente (PDX) es indispensable. Sin embargo, las pruebas de los compuestos en líneas celulares de cáncer establecidas a menudo no es predictivo de la eficacia in vivo, y los correspondientes estudios in vivo en animales, especialmente en los modelos de PDX, es muy caro y consume mucho tiempo. Las limitaciones de estos sistemas de modelo, a saber, la incapacidad para informar sobre la influencia del microambiente nativo en la progresión tumoral y la respuesta a estrategias terapéuticas, ha llevado al campo de la investigación para desarrollar métodos adicionales para complementar estos análisis. De reciente, se está prestando mayor atención a ex vivo análisis de tum pacienteo explantes 4, 5, debido a la mayor comprensión de que la respuesta terapéutica del cáncer no es exclusivo de la composición molecular inherente de las células cancerosas, sino que está fuertemente influenciado por el microambiente de las células tumorales 6, 7 una función que no puede ser recapitulado por métodos de cultivo tradicionales y / o PDX. análisis ex vivo en el contexto anterior (es decir., influencia de la célula tumoral adyacente microambiente circundante) implica la evaluación de secciones de tumor / metástasis primarias viables, en lugar de análisis ex vivo de los aislamientos celulares 8, 9.

Se presenta aquí en una técnica ex vivo (es decir., Secciones de precisión en rodajas frescas de tejido) de los tumores primarios de pacientes y metástasis asociados (es decir, los ganglios linfáticos) que informa fielmente de la respuesta (IC50), fuera de objetivo efectos y permite molecular análisis de los mecanismos de resistencia y de retroalimentación. Además, un análisis correlativo de therapeUTIC sensibilidad / resistencia en función de biomarcadores y genes perfil de expresión se puede realizar en un esfuerzo por identificar a los pacientes más propensos a responder al fármaco experimental de interés (es decir., respuesta de alta drogas coincide paciente con especial perfil biológico). Aplicación de la técnica ex vivo y la evaluación de una manera multi-parámetro es movimiento hacia la selección de los pacientes y la mejora general de los resultados clínicos.

Ex vivo análisis de la respuesta al tratamiento podría convertirse en una herramienta estándar en el desarrollo preclínico y clínico de la terapéutica del cáncer y está concebido como un paso hacia un enfoque de medicina personalizada en las estrategias de desarrollo terapéutico.

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Protocol

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NOTA: la obtención de tejidos del paciente fue autorizada mediante junta de revisión institucional (IRB): aprobado muestras biológicas y Protocolos Clínicos (números 09-121 y 11-041 de Protocolo, respectivamente) en el Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering.

Adquisiciones 1. Tissue

  1. Adquisición de paciente del tumor primario / metástasis
    NOTA: Hasta la fecha, este protocolo se ha realizado sobre tipos pancreáticos, gástricos y de tumor de mama extirpado quirúrgicamente, así como, las metástasis de linfoma.
    1. Dirigir el equipo quirúrgico para entregar la muestra por el mensajero o el sistema de tubo neumático al departamento de Patología en bien cerrado y estéril bolsa espécimen de plástico a prueba de fugas en contenedores a prueba de derrames estéril. Dirigir el equipo quirúrgico para el transporte de la muestra en estado fresco sin formalina o fijador.
    2. Dirigir el patólogo o patólogo asistente para cosechar las muestras frescas utilizando una técnica estéril, que incuso ludes de guantes y los instrumentos estériles en una campana de flujo laminar.
    3. Registre el tiempo de recolección de la muestra adquiridos, que se mantiene rigurosamente en 30 minutos de la finalización de la intervención quirúrgica. Teniendo en cuenta los efectos de la isquemia fría, no tome muestras de las piezas resecadas con un tiempo de isquemia fría> 30 min 18.
    4. Dirigir el personal del Departamento de Patología de quitar una muestra de tumor primario de aproximadamente 0,5 cm 3 a 1,0 cm 3 en una campana de flujo laminar para mantener un ambiente estéril. Cuando sea posible, elija el tejido tumoral de la periferia de la lesión índice para evitar posibles franca necrosis central (muerte celular).
      NOTA: El tejido necrótico puede ser groseramente reconocible por cualquiera de los siguientes criterios: pérdida de color o palidez del tejido; pérdida de fuerza en la que el tejido necrótico es blando y friable; una demarcación clara entre el tejido necrótico y viable.
    5. Dirigir el pathologist o asistente patólogo para proporcionar el tejido periférico que está en exceso (descarte quirúrgico) después del muestreo inmediata del tumor para la evaluación de diagnóstico. Colocar la muestra en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml estéril que contiene aproximadamente 5 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contenía 1% de antibióticos (penicilina y estreptomicina).
    6. Si está disponible (por ejemplo, los ganglios linfáticos de la cola axilar de la muestra de mastectomía), procurar un espécimen extremadamente positivos los ganglios linfáticos asociados del mismo tamaño (0,5 cm 3-1,0 cm 3) y se compara con la respuesta al fármaco de tumor primario. Al igual que la muestra de tumor primario, colocar la muestra de ganglios linfáticos asociados en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml estéril que contiene aproximadamente 5 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contenía 1% de antibióticos (penicilina y estreptomicina).
    7. Si el tamaño de los permisos de la pieza quirúrgica (por ejemplo, muestras de mastectomía), eliminar (distante del tumor primario) una muestra de tejido normal (es decir,/ parénquima normal denso fibroso de mama), y meterlo en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml estéril que contiene aproximadamente 5 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contenía 1% de antibióticos sólo con fines de transferencia. Después de la transferencia de las instalaciones de laboratorio, transferir la muestra "normal" para una congelación criovial 'snap' y guárdelo en un -80 ° C congelador para futuros análisis moleculares.
    8. Coloque todas las muestras en hielo húmedo y transportar inmediatamente al espacio de laboratorio para ex vivo seccionar los tejidos frescos. No la sección de la muestra normal, sino más bien almacenar en un congelador -80 ° C para futuros análisis moleculares. Transferir una porción del tumor primario y la metástasis asociada a una congelación criovial 'snap' y guárdelo en un -80 ° C congelador para futuros análisis moleculares.
  2. Adquisición de tejido a partir de estudios clínicos (por ejemplo, las biopsias con aguja gruesa opcional (CNB))
    NOTA: Nosotros obtenemos los tejidos tumorales de pacientesregistrados en protocolos clínicos que dan su consentimiento para someterse a un CNB de una metástasis de tumores accesibles antes del inicio de la terapia. CNB, hasta la fecha, se han realizado en pacientes con cáncer de mama, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, paraganglioma metastásico, el cuello uterino (células escamosas) y cáncer de ovario.
    1. Haga que el personal clínico de radiología intervencionista o departamento pertinente realizar una biopsia con aguja gruesa de pre-tratamiento y colocar la muestra en un 15 ml tubo de centrífuga cónico estéril que contiene aproximadamente 5 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contenía 1% de antibióticos (penicilina y estreptomicina).
    2. Coloque la muestra de biopsia en el hielo húmedo y transportar inmediatamente al espacio de laboratorio para ex vivo seccionar los tejidos frescos.

2 Preparación de Materiales para Ajustes de sección y Vibratome

  1. Preparación de los materiales para seccionar
    1. Hacer una solución de agarosa al 4% mediante la adición de 4 g de AGAse elevó a 100 ml de PBS. Autoclave (ajustes de ciclo: líquidos, 121 ° C, 30 min, 15 libras por pulgada cuadrada) la solución antes del primer uso. Para usos posteriores, coloque la agarosa al 4% en el microondas para licuar (fuego alto durante intervalos de 30 segundos) antes de cada uso y enfriar adecuadamente a ~ 25 ° C (es decir, caliente al tacto) consciente de que agarosa solidifica a temperatura ambiente.
    2. Utilice la agarosa al 4% como media del tejido incrustar no permanente. Cuando la agarosa al 4% se ha enfriado lo suficiente y todavía está en un estado líquido, con una pinza estéril colocar la muestra de tejido en un molde de inclusión y se vierte en la agarosa al 4%.
    3. Coloque la muestra de tejido estrechos (~ 2 mm de distancia), pero no directamente en la pared de la superficie de corte del molde de inclusión. La agarosa 4% empezará a solidificar rápidamente, por lo tanto, posicionar apropiadamente la muestra de tejido rápidamente. Durante el corte, mantenga la agarosa al 4% en un 55 ° C baño de agua para mantener en solución.
    4. Para una placa de 24 pocillos para el análisis de la sección, añadir 1 ml of medio completo (es decir, MEM + 10% de suero fetal bovino + 1% de antibióticos) a cada pocillo. Mantenga la placa de 24 pocillos a temperatura ambiente (~ 25 ° C) durante toda la duración de la sección.
  2. Preparación de Configuración Vibratome
    1. Usando el microtomo vibrante, ajustar la velocidad a la que la cuchilla se acerca la muestra [0 (0,00 mm / s) a 10 (2,5 mm / seg)] y la frecuencia de la cuchilla de [0 (0 Hz) a 10 (100 Hz) ]. Ajuste la configuración de acuerdo a la textura del tejido (es decir, la densidad / firmeza).
    2. Para un tumor primario de mama de carcinoma ductal invasivo, ajustar la configuración a 6 y 3, la velocidad y frecuencia, respectivamente. Para el tejido tumoral menos denso / firme, reducir la velocidad y aumentar la frecuencia en consecuencia.
    3. Ajuste el espesor de la sección dentro de los límites del instrumento (1-999 micras). Para estos análisis, establecer el espesor de corte a 200 micras.
    4. Montar el espécimen de agarosa embebido usando una capa delgada de adhesivo líquido sobre la platina del that se sumerge en un depósito de papel que está encerrado en hielo húmedo.

3. Tissue seccionamiento, Tratamiento y Análisis

  1. Retire las secciones de precisión en rodajas inmediatamente después de seccionar utilizando una pinza estéril y colocar en una placa de múltiples pocillos con 1 ml de medio completo. Cuando se adquieren secciones suficientes para la respuesta y análisis correlativos, colocar la placa de múltiples pocillos para la respuesta al tratamiento en un incubador de cultivo de tejido fijado en condiciones de cultivo de tejidos estándar.
  2. Tome varias secciones de control que SUJETALIBROS las secciones tratadas en un esfuerzo para confirmar la respuesta dependiente de la dosis en comparación con los artefactos cultivadas. Realizar tejido seccionado rápidamente (~ 30 - 40 min), bien dentro de los efectos perjudiciales del tiempo de isquemia fría (~ 2 - 4 horas) 18. Realizar el tratamiento de las secciones sólo después de un período de aclimatación de 1 hora.
  3. Tras el periodo de aclimatación de 1 hora, añadir dosis crecientes (terapéuticamente relevante;
  4. Después del tratamiento, retirar todas las secciones en condiciones estériles y formalina-fix mediante la colocación de la sección de tejido en un tubo que contenía 10% de formalina tamponada y lugar a TA O / N o en un tubo que contiene 4% de paraformaldehído (16% de paraformaldehído diluir de un vial con PBS para una concentración final de 4%) y el lugar a TA durante 2 h.
    1. Fijar secciones de tejido más grandes (por ejemplo., ~ 6 mm x 4 mm) 200 m de espesor en 10% de formalina tamponada O / N a TA. Fijar secciones más pequeñas (por ejemplo., 1 mm x 1 mm) 200 m de espesor en paraformaldehído al 4% durante 2 horas a RT.
      NOTA: Para la penetración eficiente de fijador el volumen de fixative debe 20x el volumen de tejido. Dado que este protocolo resulta en tamaños muy pequeños de tejido (por ejemplo, 6 mm 3 tejido = 6 l de volumen), para la garantía de uso adecuado de fijación 1 ml de fijador para todos los tamaños de tejido.
    2. Tras la fijación tienen las muestras de tejido en parafina embebidos por el personal del Departamento de Patología. Sección espécimen bloques de parafina sobre portaobjetos cargados a ser hematoxilina y eosina tiñen y evaluada por inmunohistoquímica (por ejemplo, la apoptosis).

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Representative Results

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Para este estudio, se utilizó la técnica ex vivo en un análisis correlativo de terapéutica de sensibilidad / resistencia de un inhibidor de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90i). En una evaluación preclínica de este Hsp90i, el tumor primario del cáncer de mama, una ER + carcinoma ductal invasivo (IDC), y asociado metástasis en los ganglios linfáticos se analizaron ex vivo para la respuesta al tratamiento   (Figura 1). Múltiples 200 m de serie de secciones fueron tratados con vehículo solo y dosis crecientes (0,25, 0,50, 1,0 y 2,5 M) de la Hsp90i. Los datos en la Figura 1 representa fijado con formalina, secciones incluidas en parafina (FFPE) y hematoxilina y eosina (H & E) manchadas después de un período de tratamiento de 48 h. El control (vehículo solo) sección tratada muestra nidos IDC viables mientras que la sección de tejido tratada 2,5 M dio lugar a una inducción de 40% de la apoptosis como se ve por los cambios morfológicos nucleares (es decir, núcleos picnóticos / APOPescombros Totic) (Figura 1A). La apoptosis se confirmó adicionalmente en el tumor primario por desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) análisis (datos no mostrados). IC50 se calculó a partir de los datos de respuesta mediante la representación gráfica por ciento de la apoptosis frente a la concentración de la droga. Significativamente, la chaperona, Hsp90 juega un papel clave en la estabilización de proteínas y la homeostasis de las vías de señalización críticos de ambas células normales y cancerosas 10. La posibilidad de dirigir Hsp90 en el cáncer se basa en el hallazgo de que las células malignas en gran medida dependen de la función de Hsp90 chaperoning, especialmente en un esfuerzo para superar los estados de estrés de ambientes inhóspitos encontrados durante la progresión metastásica. En esencia, las células cancerosas se vuelven altamente dependiente de la función Hsp90 resultante en una piscina selectiva de targetable 'oncogénico' Hsp90 11. En el inserto, la Figura 1A, lóbulo benigna adyacente con acinos y conductos asociado permanece inalterada in la misma sección tratada con Hsp90i 2,5 M. A nuestro entender, esta es la primera vez que este tipo de cáncer-especificidad Hsp90 es capturado visualmente en Hsp90i respuesta-evaluación de los tumores primarios y metástasis asociadas. Este hallazgo de células benignas / normales inalteradas como se ve en lóbulos benignas adyacentes de IDC (Figura 1A), así como los vasos dentro del parénquima circundante benigna de la mama del tumor primario y metástasis de ganglios linfáticos asociada (datos no mostrados) se ha recapitulado en varios diferente tipos de tumores (por ejemplo, de mama, gástrico y metástasis de linfoma).

Un metástasis en los ganglios linfáticos de acompañamiento de este tumor primario mostró una respuesta completa sólo en los nidos de IDC que se asociaron débilmente (Figura 1B). Nidos IDC que formaron esferoides apretados, sin embargo, permanecieron viables según lo confirmado por TUNEL (Figura 1C). Análisis adicional de los esferoides viables IDC por inmunofluorescencia reveladasuna expresión-re persistente o de la célula-célula de moléculas de adhesión, E-cadherina (Figura 1C). Este hallazgo es consistente con la persistencia, la sobre expresión de E-cadherina añadiendo a la eficacia potencial metastásico o metastásico como se refleja en el alto grado de malignidad, letal cáncer de mama inflamatorio 12, 13. Aunque interesante, este hallazgo es más allá del alcance de este documento. Sin embargo, es importante señalar que estos ganglios linfáticos (LN esferoides) de IDC se mantuvieron en cultivo durante un período de 2 semanas y por lo tanto le da credibilidad a la fuerza de la utilización de la técnica ex vivo para estudiar tanto la sensibilidad / resistencia en el desarrollo de fármacos preclínica.

La técnica ex vivo también se ha empleado en un estudio clínico en biopsias con aguja de núcleo (CNBS) para pruebas de inhibición diana en tumores 16,17. Los pacientes que consienten, tienen un procedimiento de pre-tratamiento de la biopsia con aguja gruesa (CNB) realizado (Figura 2). Comparablea la evaluación preclínica de los tumores primarios, la técnica ex vivo se utiliza para determinar la sensibilidad o respuesta en el CNB de metástasis accesibles. Múltiples 200 m de serie de secciones de la CNB fueron tratados con dosis única y crecientes (0,25, 0,50, 1,0 y 2,5 M) de la Hsp90i vehículo. El número de dosis Hsp90i utilizados en la evaluación ex vivo está dictada por el tamaño de CNB. Sin embargo, se hace todo lo posible para utilizar el espectro de dosis sugeridas anteriormente. Al igual que la evaluación preclínica ex vivo, la respuesta puede ser evaluada y más tarde en comparación con el real en la respuesta del paciente (es decir, análisis correlativos; Figura 2) como se determina por el post-tratamiento CNB farmacocinético (PK), es decir, la retención de fármaco tal como se mide por cromatografía líquida espectrometría de masas tándem (LC-MS / MS) analiza así como en formación de imágenes PET paciente (Figura 2) 16,17. Hasta la fecha, los análisis mediante la técnica ex vivo en este cDATOS CLÍNICOS estudio se ha realizado en múltiples tipos de tumores (por ejemplo, de mama, linfoma de la zona marginal, linfoma de células del manto, paraganglioma metastásico, el cuello uterino y cáncer de ovario) 16, 17. análisis correlativo completo la aplicación de la técnica ex vivo adicional ejemplifica la utilidad de esta técnica en el desarrollo de fármacos clínicos.

Figura 1
Figura 1. ex vivo análisis de la respuesta de un cáncer de mama ER +. (A, panel izquierdo) muestra nidos viables de carcinoma ductal invasivo (IDC) (hematoxilina y eosina manchado; bar escala de 100 micras). Tras el tratamiento (A, panel derecho) con 2,5 M de Hsp90i hay una inducción de ~ 40% respuesta apoptótica (núcleos picnóticos / restos apoptóticos; flechas) (hematoxilina y eosina manchado; barra de escala 100 micras). Lobulillos benignos g> (A, inserto) se mantienen inalterados después del tratamiento (Hematoxilina y eosina manchado; barra de escala de 200 micras). El control de un nodo asociado linfáticos (LN) (B, panel izquierdo) muestra un pequeño nivel de apoptosis (hematoxilina y eosina manchado; escala de barra 100 m), mientras que la sección tratada (B, paneles de la derecha) muestran un área de IDC metastásico nidos con respuesta completa (Hematoxilina y eosina manchado; barra de escala, las agujas del reloj 2 mm, 300 m, 200 my 200 m). Sin embargo, esferoides IDC apretados (esferoides; SP) de la misma sección (C, panel izquierdo) muestran poca, si alguna, la apoptosis, como se muestra por el análisis TUNEL restante viable con un concomitante (barra de escala 200 micras) (C, panel derecho) a lo largo -expresión de E-cadherina (100X).> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 Esquema de la aplicación de la técnica ex vivo en un estudio clínico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Biólogos del cáncer se enfrentan a retos significativos al intentar desarrollar estrategias terapéuticas eficaces. Prueba de fármacos en desarrollo en las líneas celulares de cáncer establecidas no puede reflejar con precisión en la respuesta in vivo e in vivo en modelos PDX son mano de obra intensiva y muy caro. Teniendo en cuenta lo anterior, la aplicación de técnicas ex vivo de los tumores primarios del paciente 14, 15 se posiciona al lado del análisis molecular de líneas celulares de cáncer establecidos y xenoinjertos derivados del paciente (PDX).

Este documento toma la aplicación de la técnica ex vivo a una nueva altura en que la técnica informa sobre la respuesta fielmente (IC50), efectos fuera de objetivo y permite el análisis molecular de los mecanismos de resistencia y de retroalimentación. Cuando los datos de respuesta se correlaciona con el perfil molecular del tumor (es decir, la expresión de proteínas de biomarcadores tumorales, mutaciones) el estudio correlativo (vs. respuesta mol tumorperfil ecular) se puede utilizar para seleccionar a los pacientes más propensos a responder a un fármaco en particular, en un esfuerzo para mejorar los resultados del paciente. Más significativamente, en el desarrollo de fármacos clínicos (es decir., Biopsias opcional), ex vivo la respuesta de pretratamiento CNB puede ser correlacionada con (y validado) en la respuesta del paciente (es decir, post-tratamiento CNB) y la retención de fármaco (farmacocinética (PK) de evaluación) 16,17. El uso de la técnica ex vivo en este estudio clínico fue capaz de determinar la respuesta del tumor, así como confirmar la especificidad diana (es decir, PD; Hsp70 inducción) e informar de la dosis y la programación de 16,17.

La técnica ex vivo es susceptible a la mayoría de tipos de tumores sólidos, así como metástasis de cáncer de transmisión sanguínea (por ejemplo, metástasis en los ganglios linfáticos de linfoma) con ligeros ajustes en el protocolo para ciertos tipos de tumores que presentan desafíos menores. Por ejemplo, los tumores del páncreas tienden a tener un alto stroma proporción de células del tumor, que puede resultar en secciones que tienen representación celular de cáncer de pobre a. Adquisición de ricas áreas de células cancerosas del tumor no se puede hacer en el análisis bruto. Por lo tanto para superar este inconveniente potencial múltiples áreas cúbicos más pequeños de la muestra de tumor puede ser incorporado (molde 4 / agarosa-incrustación) y se seccionaron, simultáneamente, aumenta la probabilidad de una sección rica en células tumorales ex vivo.

Nuestros datos apoyan firmemente el uso de la técnica ex vivo en el desarrollo de fármacos preclínicos (Figura 1). Junto con la respuesta (IC50), replican secciones pueden ser analizados para los ensayos de alternativas de viabilidad, la metabolómica, estrategias terapéuticas combinatorias, la exposición al fármaco efecto tiene sobre los factores secretados (por ejemplo, citoquinas, exosomas), los mecanismos de resistencia y la regeneración y los importante, informan en fuera de objetivo efectos (es decir, normales y células benignas). En este estudio en particular que utiliza un Hsp90i, apuntar especificity e identificación de "efectos fuera de la meta 'se basa en la premisa fundamental de que hay una piscina distintivo de' Hsp90 oncogénico 'sólo se encuentra en las células cancerosas después de la transformación maligna 10. Esto se presenta en la sección de resultados (insertar, Figura 1A) donde lóbulos benignos de una sección tratada con Hsp90i ex vivo se mantuvo inalterada. De igual importancia, que se encuentra en otra sección del mismo tumor primario se refleja en la Figura 1, a 10 M (dosis terapéuticamente irrelevante) sección tratados mostraron respuesta completa de los nidos de IDC, mientras que el carcinoma ductal asociada in situ (CDIS) no han sufrido modificaciones (datos no mostrados) . Las futuras investigaciones en esta línea de investigación están más allá del alcance de este documento. Sin embargo, este hallazgo particular, informa sobre el estado de 'transformación maligna' o progresión de la enfermedad de carcinoma ductal in situ asociado en muestras de IDC, con respecto a la oncogénicoHsp90 chaperón funcionamiento y apoya la utilidad de usar la técnica ex vivo en el desarrollo de fármacos.

Una aplicación adicional de la técnica ex vivo es su uso en el análisis pre-eficacia en modelos de xenoinjertos tumorales (es decir., Ex vivo seccionamiento de PDX) en el desarrollo de fármacos para determinar la farmacocinética / farmacodinámica (PK / PD) de datos antes de realizar involucrados, costoso en estudios in vivo - lo que permite una más informada, rentable estudio la eficacia del fármaco in vivo.

Los pasos clave y factores limitantes potenciales de la técnica ex vivo son la adquisición y seccionamiento. La adquisición de la muestra de tumor (es decir., Tumor primario / metástasis) debe realizarse con prontitud con especial atención a la identificación de un área del tumor con el más alto grado de viabilidad. Los tumores grandes tienden a tener áreas centrales necróticas que no son groseramente visible. Por lo tanto, la adquisición de tejido from el borde más externa aumenta la probabilidad de obtener un espécimen viable. Con respecto a seccionar, la recogida de las rebanadas de precisión en el grosor deseado (por ejemplo., 200 micras) está muy influenciada por la densidad de tumor / firmeza (excluyendo CNBs debido al tamaño extremadamente pequeño). Por ejemplo, carcinoma ductal invasivo es típicamente mucho más denso en contraste con carcinoma lobular invasivo. Tejido tumoral denso proporciona una resistencia apropiada - en ausencia de medios de incrustación permanente - a la hoja, mientras que el tejido tumoral menos denso no. Ejemplos de tipos de tejidos menos densos tumorales incluyen, pero no se limitan a carcinoma lobular invasivo, carcinomas mucinosos y tipos de tumores gástricos. Para superar esta limitación potencial, se requiere solución de problemas con velocidad de la cuchilla y la frecuencia adecuadas. Espesor de la sección de precisión en rodajas consistente, durante todo el proceso de seccionamiento, es crítico para la evaluación precisa de la respuesta al fármaco.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

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References

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Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

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