Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

الاستجابة للعلاج خارج الحي من الأورام الابتدائية و / أو أسوشيتد الانبثاث لما قبل السريرية والسريرية التنمية من التداوي

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

كانت خطوط الخلايا السرطانية وإنشاء xenografts الدعامة الأساسية لأبحاث السرطان على مدى العقود العديدة الماضية. ومع ذلك، تشير الأدلة مؤخرا أن الاستجابة العلاجية وتتأثر الى حد كبير المكروية الخلايا السرطانية. لذلك، قمنا بتطوير تحليل العينات خارج الحي الورم الرئيسي لأغراض تطوير الأدوية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد ثبت تطوير علاجات فعالة لمرض السرطان تكون صعبة للغاية. خطوط الخلايا السرطانية والأورام إإكسبلنتس - وكذلك xenografts استخدمت في أبحاث السرطان لأكثر من نصف قرن 1،2،3. حتى الآن، فإن التحليل الجزيئي للحساسية المخدرات والمقاومة في كل من أنشأ خطوط الخلايا السرطانية وxenografts المستمدة من المريض (PDX) أمر لا غنى عنه. ومع ذلك، واختبار المركبات في خطوط الخلايا السرطانية أنشئت ليست في كثير من الأحيان التنبؤي من فعالية في الجسم الحي، وما يقابلها من الدراسات المجراة على الحيوانات، وخاصة في نماذج PDX، مكلفة للغاية وتستغرق وقتا طويلا. القيود المفروضة على هذه الأنظمة النموذجية، وهي عدم القدرة على الإبلاغ عن تأثير المكروية الأم في تطور الورم والاستجابة للاستراتيجيات العلاجية، أدى مجال البحوث لتطوير أساليب إضافية لتكمل هذه التحليلات. من الأخيرة، ويولى الاهتمام المتزايد نحو فيفو السابقين تحليل توم المريضأو إإكسبلنتس 4، 5 نتيجة لفهم أكبر أن سرطان الاستجابة العلاجية ليست حكرا على التركيبة الجزيئية الكامنة من الخلايا السرطانية بل وأثرت كثيرا المكروية الخلايا السرطانية 6 و 7 وهي الميزة التي لا يمكن تلخيصها بواسطة طرق زراعة التقليدية و / أو PDX. خارج الحي التحليل في سياق أعلاه (أي.، تأثير الخلايا السرطانية المجاورة المحيطة المكروية) يعني تقييم أقسام الورم / ورم خبيث الأولية قابلة للحياة، بدلا من فيفو السابقين تحليل العزلات الخلوية 8، 9.

نحن التقرير هنا على تقنية فيفو السابقين (أي.، المقاطع شرائح الدقة جديدة الأنسجة) كل من الأورام الأولية المرضى والانبثاث المرتبطة (أي الغدد الليمفاوية) التي يبلغ بإخلاص على استجابة (IC50)، بعيدا عن الهدف الآثار ويسمح للالجزيئية تحليل آليات المقاومة وردود الفعل. بالإضافة إلى ذلك، تحليل مترابط من therapeحساسية utic / المقاومة مقابل العلامات البيولوجية والجينات الشخصية التعبير لا يمكن أن يؤديها في محاولة لتحديد المرضى أكثر عرضة للرد على المخدرات التجريبية من الفائدة (أي، استجابة عالية المخدرات مباريات مع المريض معين الشخصية البيولوجي). تطبيق هذه التقنية خارج الحي والتقييم بطريقة متعددة المعلمة هو التحرك نحو اختيار المريض والتحسن العام من النتائج السريرية.

يمكن أن يصبح خارج الحي العلاج تحليل استجابة أداة موحدة في تطوير قبل السريرية والسريرية لعلاجات السرطان وتصور كخطوة نحو نهج الطب الشخصي في استراتيجيات التنمية العلاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: وأذن المشتريات الأنسجة للمريض من خلال مجلس مراجعة المؤسسية (IRB) وافق عليها Biospecimen والبروتوكولات السريرية (أرقام بروتوكول 09-121 11-041 و، على التوالي) في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان.

1. الأنسجة المشتريات

  1. شراء المريض الورم الأساسي / ثانوي لورم خبيث
    ملاحظة: حتى الآن، وقد تم تنفيذ هذا البروتوكول على البنكرياس والمعدة وورم الثدي أنواع ازالتها جراحيا، وكذلك، الانبثاث سرطان الغدد الليمفاوية.
    1. توجيه الفريق الجراحي لتقديم عينة عن طريق البريد أو نظام أنبوب هوائي لقسم علم الأمراض في مغلقة بإحكام ومعقمة كيس من البلاستيك عينة مانعة للتسرب داخل حاوية معقمة واقية من تسرب. توجيه الفريق الجراحي لنقل العينة في ولاية جديدة مع عدم وجود الفورمالين أو مثبت.
    2. توجيه مساعد الطبيب الشرعي أو الطبيب الشرعي لجني العينة الطازجة باستخدام تقنية معقمة، والتي المؤتمر الوطني العراقيludes استخدام القفازات والأدوات المعقمة تحت غطاء تدفق الصفحي.
    3. تسجيل وقت الحصاد للعينة المشتراة، التي يتم الاحتفاظ بدقة أقل من 30 دقيقة من الانتهاء من العملية الجراحية. مع الأخذ بعين الاعتبار تأثيرات نقص التروية الباردة، لا تأخذ عينات من العينات مقطوعة مع الوقت الدماغية البارد> 30 دقيقة 18.
    4. توجيه موظفي وزارة علم الأمراض لإزالة عينة الورم الأولية حوالي 0.5 سم 3-1،0 سم 3 في غطاء تدفق الصفحي للحفاظ على بيئة معقمة. عندما يكون ذلك ممكنا، واختيار ورم الأنسجة من محيط الآفة مؤشر لتجنب نخر المركزي (موت الخلايا) صريح المحتملين.
      ملاحظة: قد تكون الأنسجة الميتة التعرف بشكل فاضح من قبل أي من المعايير التالية: فقدان اللون أو شحوب الأنسجة. فقدان القوة في النسيج الميت التي هي لينة وقابلة للتفتيت. ترسيم واضح بين الأنسجة الميتة وقابلة للحياة.
    5. توجيه pathologiشارع أو مساعد الطبيب الشرعي لتوفير الأنسجة الطرفية التي هي في الزائد (تجاهل الجراحية) بعد أخذ العينات مباشرة من الورم لتقييم التشخيص. وضع العينة في 15 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي المخروطية التي تحتوي على حوالي 5 مل من الحد الأدنى الضروري وسائل الإعلام (MEM) التي تحتوي على 1٪ المضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين).
    6. إذا كان متوفرا (على سبيل المثال، العقدة الليمفاوية الإبطية الذيل من عينة استئصال الثدي) وشراء الإيجابية بشكل صارخ عينة العقدة الليمفاوية المرتبطة من نفس الحجم (0.5 سم 3-1،0 سم 3) ومقارنة لاستجابة المخدرات من الورم الرئيسي. مثل عينة الورم الرئيسي، ضع المرتبطة العينة العقدة الليمفاوية في 15 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي المخروطية التي تحتوي على حوالي 5 مل من الحد الأدنى الضروري وسائل الإعلام (MEM) التي تحتوي على 1٪ المضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين).
    7. إذا كان حجم العينة تصاريح الجراحية (على سبيل المثال، عينة استئصال الثدي)، وإزالة (بعيدة عن الورم الرئيسي) عينة من الأنسجة الطبيعية (أي،طبيعية كثيفة / حمة الثدي الليفي) ووضعت في 15 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي مخروطي يحتوي على حوالي 5 مل من وسائل الإعلام الأساسية الدنيا (MEM) التي تحتوي على 1٪ المضادات الحيوية لأغراض النقل فقط. وبعد نقلها إلى مرافق المختبرات، ونقل «طبيعية» عينة إلى cryovial، 'المفاجئة' تجميد وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية لالتحليلات الجزيئية المستقبلية.
    8. وضع جميع العينات على الجليد الرطب ونقل على الفور إلى مساحة المختبر لخارج الحي باجتزاء الأنسجة الطازجة. لا القسم العينة العادية ولكن بدلا تخزين في الفريزر -80 درجة مئوية لالتحليلات الجزيئية المستقبلية. نقل جزء من الورم الرئيسي والانبثاث المرتبطة إلى cryovial، 'المفاجئة' تجميد وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية لالتحليلات الجزيئية المستقبلية.
  2. شراء أنسجة من الدراسات السريرية (مثل خزعات إبرة الأساسية اختياري (المصرف الوطني الكرواتي))
    ملاحظة: نحصل على أنسجة الورم من المرضىالمسجلين على البروتوكولات السريرية الذين يعطون موافقتهم على الخضوع لCNB من الانبثاث ورم الوصول قبل بداية العلاج. CNBs، حتى الآن، وقد أجريت على المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي وسرطان الغدد الليمفاوية منطقة هامشية، عباءة خلية سرطان الغدد الليمفاوية، المستقتمات النقيلي، عنق الرحم (الخلايا الحرشفية) وسرطان المبيض.
    1. لدينا الموظفين السريري من التداخلي أو الدائرة المختصة إجراء خزعة إبرة الأساسية قبل المعالجة ووضع العينة في 15 مل العقيمة المخروطية أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على حوالي 5 مل من الحد الأدنى الضروري وسائل الإعلام (MEM) التي تحتوي على 1٪ المضادات الحيوية (البنسلين والستربتومايسين).
    2. وضع عينة الخزعة على الجليد الرطب ونقل على الفور إلى مساحة المختبر لخارج الحي باجتزاء الأنسجة الطازجة.

2. إعداد مواد لإعدادات باجتزاء وVibratome

  1. إعداد مواد لباجتزاء
    1. جعل حل الاغاروز 4٪ وذلك بإضافة 4 ز الآغاارتفع إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني. الأوتوكلاف (إعدادات الدورة: السائل، 121 ° C، 30 دقيقة، 15 جنيه لكل بوصة مربعة) الحل قبل الاستخدام الأول. للاستخدامات اللاحقة، ضع الاغاروز 4٪ في الميكروويف لتسييل (حرارة عالية لمدة 30 فترات ثانية) قبل كل استخدام وتبريد مناسب ل~ 25 ° C (أي لمسة دافئة) تضع في اعتبارها أن الاغاروز يتصلب في RT.
    2. استخدام الاغاروز 4٪ والأنسجة تضمين وسائل الاعلام غير الدائمين. عندما يبرد الاغاروز 4٪ بما فيه الكفاية، وهو لا يزال في حالة سائلة، مع ملقط معقم تضع عينة الأنسجة في قالب التضمين وتصب في الاغاروز 4٪.
    3. ضع عينة الأنسجة وثيقة (~ 2 مم بعد) ولكن ليس مباشرة على الحائط سطح القطع من العفن التضمين. ستبدأ الاغاروز 4٪ إلى ترسيخ بسرعة، لذا ضع على نحو ملائم عينة الأنسجة بسرعة. خلال باجتزاء، والحفاظ على الاغاروز 4٪ في 55 ° C حمام الماء للحفاظ في الحل.
    4. الى 24 لوحة جيدا لتحليل القسم، إضافة 1 مل سو وسائل الإعلام كاملة (أي MEM + بقري جنيني 10٪ مصل + 1٪ المضادات الحيوية) إلى كل بئر. الحفاظ على 24 لوحة جيدا في RT (~ 25 درجة مئوية) طوال مدة باجتزاء.
  2. إعداد إعدادات Vibratome
    1. باستخدام مشراح تهتز، ضبط السرعة التي نصل نهج العينة [0 (0.00 ملم / ثانية) إلى 10 (2.5 ملم / ثانية)] وتواتر شفرة [0 (0 هرتز) إلى 10 (100 هرتز) ]. ضبط الإعدادات وفقا لنسيج من أنسجة (أي الكثافة / الحزم).
    2. لورم الثدي الأولي من سرطان الأقنية الغازية، وضبط الإعدادات إلى 6 و 3 والسرعة والتردد على التوالي. لأقل كثافة / نسيج الورم ثابتة، وانخفاض سرعة وزيادة تواتر وفقا لذلك.
    3. تعيين سمك الباب في حدود الصك (1-999 ميكرون). لهذه التحليلات، تعيين القسم سمك في 200 ميكرون.
    4. جبل العينة جزءا لا يتجزأ من الاغاروز باستخدام طبقة رقيقة من مادة لاصقة السائل على ثا القرص عينةور المغمورة في خزان وسائل الإعلام التي المغطى في الجليد الرطب.

3. الأنسجة باجتزاء، معالجة وتحليل

  1. إزالة المقاطع شرائح الدقة فور باجتزاء باستخدام ملقط معقم ووضعه في لوحة متعددة جيدا مع 1 مل من وسائل الإعلام كاملة. عندما يتم الحصول أقسام كافية للاستجابة والتحليلات المترابطة، ووضع لوحة متعددة جيدا لاستجابة العلاج في حاضنة زراعة الأنسجة وضعت في ظروف زراعة الأنسجة القياسية.
  2. اتخاذ أقسام تحكم متعددة غلاف أقسام المعالجة في محاولة لتأكيد استجابة تعتمد على الجرعة بدلا من القطع الأثرية مثقف. أداء الأنسجة باجتزاء بسرعة (~ 30 - 40 دقيقة)، وأيضا داخل أي آثار ضارة من الوقت الدماغية البارد (~ 2-4 ساعة) 18. أداء أقسام علاج إلا بعد فترة التأقلم 1 ساعة.
  3. بعد فترة التأقلم 1 ساعة، إضافة زيادة جرعات (ذات الصلة علاجيا.
  4. بعد العلاج، وإزالة جميع أقسام تحت ظروف معقمة والفورمالين الإصلاح من خلال وضع قسم الأنسجة في أنبوب يحتوي على إما 10٪ مخزنة الفورمالين ومكان في RT O / N أو في أنبوب يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (تمييع بارافورمالدهيد 16٪ من قارورة مع برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 4٪) ووضعت في RT لمدة 2 ساعة.
    1. إصلاح أقسام الأنسجة أكبر (على سبيل المثال، ~ 6 مم × 4 ملم) 200 ميكرون سميكة في 10٪ من الفورمالين مخزنة O / N في RT. إصلاح أقسام أصغر (على سبيل المثال، 1 مم × 1 مم) 200 ميكرون سميكة في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 2 ساعة على RT.
      ملاحظة: لاختراق كفاءة تثبيتي حجم وixative يجب 20X حجم الأنسجة. وبالنظر إلى أن هذه النتائج البروتوكول في أحجام صغيرة للغاية الأنسجة (6 مم، مثلا الأنسجة 3 = 6 حجم ميكرولتر)، لضمان الاستخدام السليم تثبيت 1 مل من تثبيتي لجميع الأحجام الأنسجة.
    2. بعد التثبيت لديك عينات الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من قبل موظفي قسم أمراض. القسم عينة كتل البارافين على الشرائح المحملة على أن يكون الهيماتوكسيلين ويوزين الملون وتقييمها immunohistochemically (مثل موت الخلايا المبرمج).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لهذه الدراسة، تم استخدام هذه التقنية المجراة سابقا في تحليل مترابط من حساسية العلاجية / مقاومة بروتين الصدمة الحرارية 90 المانع (Hsp90i). في التقييم قبل السريرية لهذا Hsp90i، الورم الرئيسي سرطان الثدي، وهو ER + الغازية سرطان الأقنية (IDC)، وما يرتبط بها من الانبثاث العقدة الليمفاوية تم تحليلها خارج الحي للاستجابة العلاج   (الشكل 1). تم علاج 200 ميكرون أقسام متعددة التسلسلية مع السيارة فقط وزيادة جرعات (0.25، 0.50، 1.0 و 2.5 ميكرومتر) من Hsp90i. البيانات في الشكل 1 يمثل-الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من المقاطع البارافين (FFPE) والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) ملطخة بعد فترة العلاج 48 ساعة. سيطرة (السيارة فقط) قسم المعالجة معارض أعشاش IDC قابلة للحياة في حين أدى قسم الأنسجة 2.5 ميكرومتر العلاج في الحث 40٪ من موت الخلايا المبرمج كما يراها التغيرات المورفولوجية النووية (أي تغلظي نوى / APOPالحطام totic) (الشكل 1A). وقد تأكد موت الخلايا المبرمج أكثر في الورم الرئيسي من محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز وسم نهاية dUTP نيك (النفق) التحليل (لا تظهر البيانات). يتم احتساب IC50 من البيانات استجابة الرسوم البيانية موت الخلايا المبرمج في المئة مقابل تركيز الدواء. بشكل ملحوظ، كوصي، Hsp90 يلعب دورا رئيسيا في استقرار البروتين والتوازن في مسارات إشارات حاسمة لكلا الطبيعية والخلايا السرطانية 10. القدرة على استهداف Hsp90 في سرطان تعتمد على الاستنتاج أن الخلايا الخبيثة يعتمد بشكل كبير على وظيفة المرافقة من Hsp90، وخاصة في محاولة للتغلب على الدول شدد البيئات القاسية التي واجهتها خلال التقدم النقيلي. في جوهرها، تصبح الخلايا السرطانية تعتمد اعتمادا كبيرا على وظيفة Hsp90 مما أدى إلى تجمع انتقائي استهدافا من "أنكجنيك" Hsp90 11. في إدراج، الشكل 1A، فصيص حميدة المجاور مع عنيبات ​​والقناة المرتبطة يبقى دون تغيير طن نفس 2.5 ميكرومتر قسم Hsp90i المعاملة. على حد علمنا، هذه هي المرة الأولى التي يتم التقاط هذه Hsp90 السرطان خصوصية بصريا في Hsp90i استجابة تقييم الأورام الأولية والانبثاث المرتبطة بها. وقد لخص هذه النتيجة من / الخلايا الطبيعية حميدة دون تغيير كما رأينا في فصيصات حميدة المجاورة IDC (الشكل 1A)، وكذلك السفن داخل المحيطة حمة الثدي الحميدة الورم الأساسي وما يرتبط بها من الانبثاث العقدة الليمفاوية (لا تظهر البيانات) في عدة مختلفة أنواع الأورام (مثل الثدي والمعدة وسرطان الغدد الليمفاوية الانبثاث).

أظهر المصاحب الانبثاث العقدة الليمفاوية من هذا الورم الرئيسي استجابة كاملة فقط في أعشاش IDC التي كانت مرتبطة بشكل فضفاض (الشكل 1B). أعشاش IDC التي شكلت الكروية ضيقة، ومع ذلك، لا يزال صالحا ما أكده النفق (الشكل 1C). تحليل إضافي للالكروية IDC قابلة للحياة من خلال كشف المناعيواستمرار أو إعادة التعبير للخلية خلية جزيء التصاق، E-كادهيرين (الشكل 1C). وتتوافق هذه النتيجة مع استمرار، والإفراط في التعبير عن E-كادهيرين إضافة إلى الكفاءة المحتملة أو النقيلي المنتشر على النحو المبين في خبيث للغاية، قاتلة سرطان الثدي الالتهابي 12 و 13. على الرغم من أن اهتمام هذه النتيجة هو خارج نطاق هذه الورقة. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذه العقدة الليمفاوية الأجسام الشبه الكروية (LN) IDC واستمرت في الثقافة لمدة 2 اسابيع، وبالتالي يضفي مصداقية على قوة باستخدام تقنية فيفو السابقين لدراسة كل حساسية / مقاومة في تطوير العقاقير قبل السريرية.

كما تم توظيف هذه التقنية المجراة سابقا في دراسة سريرية على خزعات إبرة الأساسية (CNBs) عن أدلة على تثبيط الأورام المستهدفة في 16،17. المرضى الذين موافقة، لديها ما قبل المعالجة إبرة الخزعة الأساسية (المصرف الوطني الكرواتي) تنفيذ الإجراء (الشكل 2). مقارنةلتقييم قبل السريرية للأورام الأولية، ويستخدم تقنية فيفو السابقين لتحديد حساسية أو استجابة في CNB الانبثاث الوصول إليها. تم علاج 200 ميكرون أقسام متعددة المسلسل الى CNB مع السيارة فقط، وزيادة جرعات (0.25، 0.50، 1.0 و 2.5 ميكرومتر) من Hsp90i. وأملت عدد الجرعات المستخدمة في تقييم Hsp90i فيفو السابقين حسب حجم المصرف الوطني الكرواتي. ومع ذلك، يتم بذل كل جهد ممكن لاستخدام الطيف الجرعات المقترحة أعلاه. مثل التقييم قبل السريرية المجراة سابقا، والاستجابة يمكن تقييمها وبعد مقارنة الفعلية في استجابة المريض (أي تحليلات المترابطة، الشكل 2) على النحو الذي يحدده المصرف الوطني الكرواتي بعد المعالجة الدوائية (PK)، أي الاحتفاظ المخدرات كما تم قياسها عبر اللوني السائل جنبا إلى جنب الطيف الكتلي (LC-MS / MS) يحلل وكذلك في التصوير PET المريض (الشكل 2) 16،17. حتى الآن، تحليلات باستخدام تقنية فيفو السابقين في هذا جوقد أجريت الدراسة على linical أنواع الأورام متعددة (على سبيل المثال، وسرطان الثدي، سرطان الغدد الليمفاوية منطقة هامشية، سرطان الغدد الليمفاوية الخلية عباءة، المستقتمات النقيلي وعنق الرحم وسرطان المبيض) 16، 17. تحليل كامل المتلازم تنفيذ تقنية فيفو السابقين مزيد مثالا على فائدة هذه التقنية في تطوير العقاقير السريرية.

الشكل 1
الرقم 1. خارج الحي تحليل استجابة سرطان الثدي ER +. (A، لوحة اليسار) يعرض أعشاش قابلة للحياة من سرطان الأقنية الغازية (IDC) (هيماتوكسيلين ويوزين الملون، شريط مقياس 100 ميكرون). على العلاج (A، اللوحة اليمنى) مع 2.5 ميكرومتر من Hsp90i هناك تحريض استجابة أفكارك ~ 40٪ (نوى تغلظية / الحطام أفكارك، السهام) (هيماتوكسيلين ويوزين الملون، على نطاق وشريط 100 ميكرون). فصيصات حميدة ز> (A، ملحقة) تبقى دون تغيير بعد العلاج (هيماتوكسيلين ويوزين الملون، شريط مقياس 200 ميكرون). سيطرة عقدة المرتبطة الليمفاوية (LN) (B، اللوحة اليسرى) يعرض مستوى صغير من موت الخلايا المبرمج (هيماتوكسيلين ويوزين الملون، على نطاق وشريط 100 ميكرون)، في حين تعامل القسم (B، لوحات اليمين) تظهر مساحة النقيلي IDC أعشاش مع استجابة كاملة (هيماتوكسيلين ويوزين الملون، شريط النطاق، في اتجاه عقارب الساعة 2 مم، 300 ميكرون، 200 ميكرون و 200 ميكرون). ومع ذلك، IDC الكروية ضيقة (الأجسام الشبه الكروية، س) من نفس القسم (C، اللوحة اليسرى) تظهر قليلا، إن وجدت، موت الخلايا المبرمج كما يتضح من تحليل النفق تبقى قابلة للحياة مع ما يصاحب ذلك (مقياس شريط 200 ميكرون) (C، اللوحة اليمنى) على الإعراب من E-كادهيرين (التكبير 100X).> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تخطيطي لتنفيذ فيفو السابقين التقنية في دراسة سريرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تواجه الأحياء السرطان تحديات كبيرة عند محاولة وضع استراتيجيات علاجية فعالة. يمكن اختبار المخدرات في التنمية على خطوط الخلايا السرطانية أنشئت لا تعكس بدقة ردا المجراة في التجارب المجراة على نماذج PDX هي عمالة كثيفة ومكلفة للغاية. نظرا لأعلاه، تطبيق فيفو السابقين تقنيات مريض الأورام الأولية 14 و 15 يتم وضع الآن بجانب التحليل الجزيئي للخطوط الخلايا السرطانية وإنشاء xenografts المستمدة من المريض (PDX).

تأخذ هذه الورقة تطبيق هذه التقنية خارج الحي إلى ارتفاع جديد في هذا الأسلوب يعلم بإخلاص على استجابة (IC50)، بعيدا عن الهدف الآثار، ويسمح للتحليل الجزيئي للآليات المقاومة وردود الفعل. عندما يرتبط البيانات استجابة للورم الشخصية الجزيئية (أي البروتين التعبير عن المؤشرات الحيوية الورم، والطفرات) الدراسة المترابطة (مقابل استجابة الورم مولالملف الشخصي ecular) يمكن استخدامه لتحديد المرضى أكثر عرضة للرد على دواء معين، في محاولة لتحسين نتائج المرضى. الأهم من ذلك في تطوير العقاقير السريرية (أي.، الخزعات اختياري)، فيفو السابقين استجابة المعالجة CNB يمكن ربطها (والتحقق من صحتها) في استجابة المريض (أي بعد العلاج CNB) والاحتفاظ المخدرات (الدوائية (PK) التقييم) 16،17. كان استخدام هذه التقنية المجراة سابقا في هذه الدراسة السريرية قادرة على تحديد استجابة الورم وكذلك تأكيد خصوصية المستهدف (أي PD، HSP70 الحث) وتبلغ على جرعة وجدولة 16،17.

هذه التقنية خارج الحي وهي قابلة لمعظم أنواع الأورام الصلبة وكذلك الانبثاث السرطان المنقولة عن طريق الدم (مثل الانبثاث العقدة الليمفاوية سرطان الغدد الليمفاوية) مع تعديلات طفيفة في بروتوكول لأنواع معينة الورم تحديات طفيفة. على سبيل المثال، وأورام البنكرياس تميل إلى أن تكون ق عاليةtroma نسبة الخلايا السرطانية، التي يمكن أن تؤدي في الفروع التي لديها ضعف تمثيل الخلايا السرطانية. شراء الخلايا السرطانية المناطق الغنية للورم لا يمكن إجراء تحليل على الإجمالي. لذلك للتغلب على هذا القصور المحتملة متعددة المجالات مكعب أصغر من عينة الورم يمكن تضمين (4 /-تضمين الاغاروز العفن) ومقطوع في وقت واحد زيادة احتمال حدوث القسم خلايا الورم الغنية خارج الحي.

بياناتنا تدعم بشدة استخدام تقنية فيفو السابقين في تطوير العقاقير قبل السريرية (الشكل 1). جنبا إلى جنب مع استجابة (IC50)، وتكرار يمكن تحليلها أقسام لفحوصات بديلة جدوى، الايض، والاستراتيجيات العلاجية اندماجي، والتعرض له تأثير المخدرات على عوامل يفرز (على سبيل المثال، السيتوكينات، exosomes)، وآليات المقاومة وردود الفعل والأهم من ذلك، على إعلام بعيدا عن الهدف آثار (أي الطبيعية والخلايا حميدة). في هذه الدراسة الخاصة التي استخدمت Hsp90i، جمعية مهندسي البترول تستهدفcificity وتحديد "تأثيرات خارج الهدف 'هو مفتاح الحل القائم على فرضية أن هناك مجموعة مميزة من" Hsp90 أنكجنيك "لا توجد إلا في الخلايا السرطانية على التحول الخبيث 10. وتقدم هذه النتائج في القسم (إدراج، الشكل 1A) حيث ظلت فصيصات حميدة من قسم فيفو السابقين Hsp90i المعاملة دون تغيير. ذات أهمية متساوية، وجدت في قسم آخر من الورم الرئيسي نفسه تنعكس في الشكل 1، أظهرت 10 ميكرومتر (جرعة علاجية غير ذات صلة) قسم المعالجة استجابة كاملة من أعشاش IDC في حين بقي يرتبط سرطان الأقنية في الموقع (DCIS) دون تغيير (لا تظهر البيانات) . التحقيقات المستقبلية في هذا الخط من البحوث هي خارج نطاق هذه الورقة. ومع ذلك، يبلغ هذا الاستنتاج بشكل خاص على حالة "التحول الخبيث" أو تطور المرض من DCIS المرتبطة في عينات IDC، فيما يتعلق أنكجنيكHsp90 المرافقة تعمل وتدعم جدوى استخدام هذه التقنية المجراة سابقا في تطوير العقاقير.

تطبيق إضافي لهذه التقنية خارج الحي هو استخدامها في تحليل ما قبل فعالية في نماذج طعم أجنبي الورم (أي.، فيفو السابقين باجتزاء من PDX) في تطوير العقاقير الدوائية لتحديد / الديناميكا الدوائية (PK / PD) البيانات قبل تنفيذ المعنية، مكلف الدراسات المجراة - السماح لأكثر استنارة، في دراسة نجاعة الأدوية فيفو فعالة من حيث التكلفة.

الخطوات الرئيسية والعوامل التي تحد المحتملة لهذه التقنية المجراة سابقا هي المشتريات وباجتزاء. شراء عينة الورم (أي.، الورم الرئيسي / الانبثاث) يجب تنفيذ على وجه السرعة مع إيلاء اهتمام وثيق لتحديد منطقة الورم وفقا لأعلى درجة من قدرتها على البقاء. الأورام الكبيرة تميل إلى أن تكون المناطق الوسطى الميتة التي لا تظهر بشكل صارخ. لذا، شراء و الأنسجةمدمج الحافة الخارجية الأكثر يزيد احتمال الحصول على عينة قابلة للحياة. فيما يتعلق باجتزاء، وجمع شرائح الدقة في سمك المطلوب (على سبيل المثال، 200 ميكرون) وتتأثر الى حد كبير كثافة الورم / الحزم (باستثناء CNBs نظرا لحجم صغير للغاية). على سبيل المثال، سرطان الأقنية الغازية هو عادة أكثر كثافة على عكس الغازية مفصص سرطان. توفر نسيج الورم كثيفة المقاومة المناسبة - في غياب وسائل الاعلام التضمين الدائم - إلى شفرة، في حين نسيج الورم أقل كثافة لا. وتشمل الأمثلة على أنواع الأنسجة السرطانية أقل كثافة ولكن لا تقتصر على سرطان الغازية مفصص، سرطان مخاطية المعدة وأنواع الورم. للتغلب على هذا القيد المحتملين، مطلوب مع سرعة شفرة المناسبة والتردد اطلاق النار المتاعب. ، شرائح سمك الباب الدقة ثابت، طوال عملية باجتزاء، هو أمر حاسم لتقييم دقيق للاستجابة المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Ambrose, E. J. Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture. Experimental Cell Research. 15, (58), 332-345 (1958).
  2. Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat. New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).
  3. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  4. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors. Cell Cycle. 11, (14), 2756-2761 (2012).
  5. Bray, K., et al. Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer. Molecular Cancer Research. 7, (9), 1487-1496 (2009).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  7. Nakasone, E. S., et al. Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).
  8. Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia. PNAS. 111, (8), 3092-3097 (2014).
  9. Vidal, S. J., et al. Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples. J. Vis. Exp. (85), e51332 (2014).
  10. Wanping, X., Neckers, L. Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).
  11. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90. Nature Chemical Biology. 7, (11), 818-826 (1038).
  12. Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer. American Journal of Pathology. 161, (2), 619-628 (2002).
  13. Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism. Oncotarget. 4, (3), 446-462 (2013).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).
  16. Jhaveri, K., et al. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).
  17. Gerecitano, J. F., et al. Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71. Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).
  18. Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).
الاستجابة للعلاج <em>خارج الحي</em> من الأورام الابتدائية و / أو أسوشيتد الانبثاث لما قبل السريرية والسريرية التنمية من التداوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter