Summary
Lignées de cellules cancéreuses établies et les xénogreffes ont été le pilier de la recherche sur le cancer au cours des dernières décennies. Cependant, des données récentes suggèrent que la réponse thérapeutique est fortement influencée par le micro-environnement des cellules tumorales. Par conséquent, nous avons développé une analyse ex vivo des échantillons de tumeurs primaires à des fins de développement de médicaments.
Introduction
Développement de traitements efficaces contre le cancer s'est avéré être extrêmement difficile. lignes de cancer des cellules et des explants de tumeur - ainsi que les xénogreffes ont été utilisées dans la recherche sur le cancer pour plus d'un demi siècle 1,2,3. A ce jour, l'analyse moléculaire de la sensibilité aux médicaments et la résistance dans les deux lignées de cellules cancéreuses établies et des xénogreffes provenant de patients (PDX) est indispensable. Cependant, le test de composés sur des lignées cellulaires de cancer établies n'est pas souvent prédictifs de l'efficacité in vivo, et correspondant à des études in vivo chez les animaux, en particulier dans les modèles PDX, est très coûteux et prend du temps. Les limites de ces systèmes modèles, à savoir l'incapacité d'informer sur l'influence du micro-environnement natif dans la progression tumorale et la réponse à des stratégies thérapeutiques, a conduit le domaine de la recherche afin de développer des méthodes supplémentaires pour compléter ces analyses. Récente, une attention accrue est accordée à une analyse ex vivo de son tour maladeou explants 4, 5 en raison de la plus grande compréhension que la réponse thérapeutique du cancer n'est pas exclusif à la composition moléculaire inhérente des cellules cancéreuses mais est fortement influencée par le microenvironnement des cellules tumorales 6, 7 une fonction qui ne peut être récapitulé par des méthodes de culture traditionnelles et / ou PDX. analyse ex vivo dans le contexte ci-dessus (c.-à-., l'influence de la tumeur adjacente entourant cellule microenvironnement) l'évaluation des sections tumeur / métastases primaires viables implique, plutôt que ex vivo l'analyse d'isolats cellulaires 8, 9.
Nous rapportons ici sur une technique ex vivo (c.-à-., Sections de précision tranches fraîches tissus) des deux tumeurs primaires de patients et métastases associées (par exemple, les ganglions lymphatiques) qui informe fidèlement réponse (IC50), les effets hors-cible et permet de moléculaire analyse des mécanismes de résistance et de rétroaction. En outre, une analyse corrélative de therapeUTIC sensibilité / résistance en fonction de biomarqueurs et profil d'expression génique peut être réalisée dans un effort pour identifier les patients les plus susceptibles de répondre à la drogue expérimentale d'intérêt (c.-à-., la réponse médicamenteuse élevée correspond à des patients en particulier le profil biologique). Application de la technique et l'évaluation ex vivo dans un mode multi-paramètre est un mouvement vers la sélection des patients et l'amélioration globale des résultats cliniques.
Analyse ex vivo de la réponse au traitement pourrait devenir un outil standard dans le développement préclinique et clinique de traitements contre le cancer et est envisagée comme une étape vers une approche de médecine personnalisée dans les stratégies de développement thérapeutique.
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Protocol
REMARQUE: l'obtention de tissus des patients a été autorisé par l'examen institutionnel (CISR) -approved des échantillons biologiques et des protocoles cliniques (numéros de protocole 09-121 et 11-041, respectivement) au Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
1. tissus achats
- Achat de patients tumeur primaire / métastases
NOTE: A ce jour, ce protocole a été effectuée sur les types enlevés chirurgicalement pancréatiques, gastriques et tumeurs du sein, ainsi que, les métastases de lymphome.- Diriger l'équipe chirurgicale de livrer l'échantillon par courrier ou par système de tube pneumatique au département de pathologie dans étanche et stérile sac d'échantillons de plastique étanche dans le conteneur anti-éclaboussures stérile. Diriger l'équipe chirurgicale pour transporter les échantillons à l'état frais sans formol ou fixateur.
- Diriger le pathologiste ou un pathologiste assistant de récolter les échantillons frais en utilisant une technique stérile, qui incl'utilisation de gants de ludes et des instruments stériles sous une hotte à flux laminaire.
- Noter le temps de la récolte de l'échantillon d'un marché, qui est tenue rigoureuse de moins de 30 minutes de la fin de la procédure chirurgicale. En tenant compte des effets de l'ischémie froide, ne pas prendre des échantillons de pièces de résection chirurgicale avec un temps d'ischémie froide> 30 min 18.
- Diriger le personnel Département de Pathologie de retirer un échantillon de tumeurs primaires d'environ 0,5 cm3 à 1,0 cm 3 sous une hotte à flux laminaire afin de maintenir un environnement stérile. Lorsque cela est possible, choisir un tissu tumoral à partir de la périphérie de la lésion d'indice pour éviter la nécrose centrale (mort cellulaire) franc potentiel.
NOTE: Le tissu nécrotique peut être grossièrement reconnaissable par l'un des critères suivants: perte de la couleur ou la pâleur des tissus; perte de force dans laquelle les tissus nécrosés est douce et friable; une ligne de démarcation nette entre le tissu nécrotique et viable. - Diriger le pathologier ou le pathologiste assistant pour fournir les tissus périphériques qui est en excès (rejets chirurgicale) après prélèvement immédiat de la tumeur pour une évaluation diagnostique. Placer l'échantillon dans un tube à centrifuger conique de 15 ml stérile contenant environ 5 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 1% d'antibiotiques (pénicilline et streptomycine).
- Si elle est disponible (par exemple, les ganglions lymphatiques axillaires de la queue de l'échantillon ayant subi une mastectomie), se procurer un échantillon nettement positifs des ganglions lymphatiques associés de la même taille (0,5 cm3 à 1,0 cm 3) et comparer à la réponse aux médicaments de la tumeur primitive. Comme les échantillons de tumeurs primaires, de placer l'échantillon de ganglion lymphatique associé à un tube à centrifuger conique de 15 ml stérile contenant environ 5 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 1% d'antibiotiques (pénicilline et streptomycine).
- Si la taille de permis de spécimens chirurgicaux (par exemple, l'échantillon de mastectomie), supprimer (éloigné de la tumeur primaire) un échantillon de tissu normal (c'est-à-parenchyme normale dense / fibreux sein) et le placer dans un tube à centrifuger conique de 15 ml stérile contenant environ 5 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 1% d'antibiotiques à des fins de transfert. Après le transfert des équipements de laboratoire, transférer l'échantillon «normal» à un, gel et magasin cryovial «de rupture» dans un congélateur à -80 ° C pour les analyses moléculaires futures.
- Placez tous les échantillons sur la glace mouillée et transporter immédiatement à l'espace de laboratoire ex vivo sectionnement de tissu frais. Ne section de l'échantillon normal, mais plutôt stocker dans un congélateur à -80 ° C pour les analyses moléculaires futures. Transférer une partie de la tumeur primaire et les métastases associée à un, gel et magasin cryovial «de rupture» dans un congélateur à -80 ° C pour les analyses moléculaires futures.
- Le prélèvement de tissu à partir d'études cliniques (par exemple, base facultative biopsies (CNB))
NOTE: Nous obtenons les tissus tumoraux de patientsinscrits sur les protocoles cliniques qui donnent leur consentement à subir une CNB d'une métastase de la tumeur accessible avant le début de la thérapie. CNB, à ce jour, ont été réalisées sur des patients atteints sein, le lymphome de la zone marginale, lymphome à cellules du manteau, paragangliome métastatique, col de l'utérus (cellules squameuses) et des ovaires.- Ont le personnel clinique de radiologie interventionnelle ou département concerné effectuent un noyau biopsie à l'aiguille de pré-traitement et le spécimen dans un tube de 15 ml à centrifuger conique stérile contenant environ 5 ml de milieu essentiel minimum (MEM) contenant 1% d'antibiotiques (pénicilline et la streptomycine).
- La biopsie sur la glace mouillée et transporter immédiatement à l'espace de laboratoire ex vivo sectionnement de tissu frais.
2 Préparation du matériel pour les paramètres de sectionnement et Vibratome
- Préparation du matériel pour la coupe
- Faire une solution d'agarose à 4% par addition de 4 g de agarose de 100 ml de PBS. Autoclave (paramètres du cycle: liquides, 121 ° C, 30 min, 15 livres par pouce carré), la solution avant la première utilisation. Pour les utilisations ultérieures, placez le 4% d'agarose dans un micro-ondes pour liquéfier (température élevée des intervalles de 30 s) avant chaque utilisation et laisser refroidir de manière appropriée à ~ 25 ° C (c'est à dire, chaud au toucher) conscient que agarose se solidifie à température ambiante.
- Utilisez les 4% d'agarose comme un média enrobage de tissus non-permanent. Lorsque le 4% d'agarose a suffisamment refroidi et est encore à l'état liquide, avec des pinces stériles placer l'échantillon de tissu dans un moule et versez l'intégration dans les 4% d'agarose.
- Placer l'échantillon de tissu à proximité (~ 2 mm de distance), mais pas directement sur la paroi de la surface de coupe du moule enrobage. L'agarose 4% va commencer à se solidifier rapidement, donc positionner de manière appropriée l'échantillon de tissu rapidement. Pendant la coupe, gardez le 4% d'agarose dans un bain-marie à 55 ° pour rester en solution.
- Pour une plaque de 24 puits pour l'analyse de l'article, ajouter 1 ml of milieu complet (c.-à-MEM + 10% de sérum foetal bovin + 1% d'antibiotique) à chaque puits. Conservez la plaque de 24 puits à température ambiante (~ 25 ° C) pendant toute la durée de la coupe.
- Préparation des paramètres Vibratome
- Utilisation du microtome vibrant, régler la vitesse à laquelle la lame se rapproche de l'échantillon [0 (0,00 mm / s) à 10 (2,5 mm / s)] et la fréquence de la lame [0 (0 Hz) et 10 (100 Hz) ]. Ajustez les paramètres en fonction de la texture du tissu (c'est à dire, la densité / fermeté).
- Pour une tumeur du sein primaire de carcinome canalaire invasif, ajuster les paramètres à 6 et 3, respectivement la vitesse et la fréquence. Pour le tissu tumoral moins dense / entreprise, réduire la vitesse et augmenter la fréquence en conséquence.
- Réglez l'épaisseur de coupe dans les limites de l'instrument (1 - 999 um). Pour ces analyses, définir l'épaisseur de coupe à 200 um.
- Placer l'échantillon d'agarose-intégré à l'aide d'une fine couche de colle liquide sur le disque de tha échantillont est immergé dans un réservoir de médias qui est enfermé dans la glace mouillée.
3. tissus sectionnement, traitement et analyses
- Retirez les sections de précision tranché immédiatement après la coupe à l'aide de pinces stériles et les placer dans une plaque multi-puits avec 1 ml de milieu complet. Lorsque les sections suffisantes sont acquises pour une réponse et des analyses corrélatives, placer la plaque multi-puits pour la réponse au traitement dans un incubateur de culture de tissu fixé à des conditions de culture de tissu standard.
- Prendre plusieurs sections de contrôle que les serre-livres sections traitées en vue de confirmer la réponse dose-dépendante par rapport à des objets en culture. Effectuer tissu coupe rapidement (~ 30 - 40 min), bien en deçà des effets néfastes de temps froid ischémique (~ 2 - 4 heures) 18. Effectuer le traitement des sections uniquement après une période d'acclimatation de 1 heure.
- Après la période d'acclimatation d'une heure, ajouter des doses croissantes (thérapeutiquement pertinent;
- Après le traitement, supprimer toutes les sections dans des conditions stériles et le formol fix en plaçant la coupe de tissu dans un tube contenant soit 10% de formaline tamponnée au lieu et à TA O / N ou à un tube contenant du paraformaldéhyde 4% (dilution de 16% de paraformaldéhyde à partir d'un flacon avec du PBS à une concentration finale de 4%) et le mettre à la température ambiante pendant 2 heures.
- Fixer des coupes de tissus plus grandes (par exemple., ~ 6 mm x 4 mm) 200 um d'épaisseur sur 10% de formol tamponné O / N à la température ambiante. Fixer sections plus petites (par ex., 1 mm x 1 mm) de 200 um d'épaisseur dans du paraformaldéhyde 4% pendant 2 heures à température ambiante.
REMARQUE: Pour une pénétration efficace de fixateur le volume de fixative convient 20X le volume du tissu. Etant donné que ce protocole conduit à de très petites tailles (par exemple des tissus, des tissus de 6 mm 3 de volume = 6 pi), pour garantir l'utilisation d'une fixation appropriée ml de fixatif pour toutes les tailles de tissu. - Après fixation ont les échantillons de tissus inclus en paraffine par le personnel du ministère de pathologie. Section spécimen blocs de paraffine sur des lames chargées d'être hématoxyline et éosine teinté et évalué par immunohistochimie (par exemple, l'apoptose).
- Après le traitement, supprimer toutes les sections dans des conditions stériles et le formol fix en plaçant la coupe de tissu dans un tube contenant soit 10% de formaline tamponnée au lieu et à TA O / N ou à un tube contenant du paraformaldéhyde 4% (dilution de 16% de paraformaldéhyde à partir d'un flacon avec du PBS à une concentration finale de 4%) et le mettre à la température ambiante pendant 2 heures.
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Representative Results
Pour cette étude, la technique ex vivo a été utilisé dans une analyse de corrélation thérapeutique sensibilité / résistance d'un inhibiteur de la protéine de choc thermique 90 (Hsp90i). Dans une évaluation préclinique de cette Hsp90i, la tumeur primaire de cancer du sein, un ER + carcinome canalaire invasif (IDC), et associé métastase des ganglions lymphatiques ont été analysés ex vivo de la réponse au traitement (Figure 1). Plusieurs 200 um coupes en série ont été traités uniquement avec le véhicule et l'augmentation des doses (0,25, 0,50, 1,0 et 2,5 M) de la Hsp90i. Les données sur la figure 1 représente les sections, inclus dans la paraffine (FFPE) et hématoxyline et éosine (H & E) taché après un période de traitement de 48 heures fixés au formol. Le témoin (véhicule seul) de l'article traité montre nids IDC viables que la section de tissu traité 2,5 uM a entraîné une induction de 40% de l'apoptose comme on le voit par des changements morphologiques nucléaires (par exemple, des noyaux pycnotiques / apopdébris Totic) (Figure 1A). L'apoptose a été confirmée dans la tumeur primaire par la désoxynucléotidyl transferase terminale dUTP nick étiquetage d'extrémité (TUNEL) analyse (données non présentées). IC50 est calculé à partir des données de réponse en représentant graphiquement l'apoptose pour cent par rapport à la concentration du médicament. De manière significative, le chaperon Hsp90 joue un rôle essentiel dans la stabilisation de la protéine et l'homéostase des voies de signalisation importantes des deux cellules normales et cancéreuses 10. La capacité de cibler Hsp90 dans le cancer repose sur la constatation que les cellules malignes sont fortement tributaires de la fonction chaperonne de Hsp90, en particulier dans un effort pour surmonter Unis ont souligné des environnements inhospitaliers rencontrés au cours de la progression métastatique. En substance, les cellules cancéreuses deviennent hautement dépendante de la fonction de Hsp90 entraîne une piscine sélectif être ciblé de "oncogène" 11 Hsp90. Dans la pièce, la figure 1A, lobule bénigne adjacente avec acini et conduit associé reste inchangé in la même section Hsp90i traité 2,5 uM. À notre connaissance, c'est la première fois que cette Hsp90 cancer spécificité est capturé visuellement en réponse Hsp90i-évaluation des tumeurs primaires et des métastases associées. Cette conclusion de cellules bénignes / normales intactes comme on le voit dans lobules bénignes adjacentes IDC (figure 1A) ainsi que les navires dans le parenchyme mammaire bénigne environnante de la tumeur primitive et associée métastases ganglionnaires (données non présentées) a été récapitulées dans plusieurs différents types de tumeurs (par exemple, du sein, de l'estomac et les métastases de lymphome).
Un accompagnement métastase ganglionnaire de cette tumeur primaire a montré une réponse complète que dans les nids IDC qui ont été vaguement associés (figure 1B). Nids IDC qui formaient sphéroïdes serrés, cependant, restaient viables comme l'a confirmé par TUNEL (figure 1C). Des analyses supplémentaires des sphéroïdes IDC viables révélés par immunofluorescenceun ré-expression persistante ou de la molécule d'adhérence cellule-cellule, la E-cadhérine (Figure 1C). Ce résultat est cohérent avec la persistance, sur-expression de la E-cadhérine ajoutant à l'efficacité potentielle ou métastatique métastatique comme en témoigne l', cancer très malin mortel sein inflammatoire 12, 13. Bien qu'intéressante, cette constatation est au-delà de la portée de ce document. Cependant, il est important de noter que ces ganglions lymphatiques sphéroïdes (LN) IDC ont été maintenues en culture pendant une période de 2 semaines et donne ainsi du crédit à la force de l'utilisation de la technique ex vivo pour étudier à la fois la sensibilité / résistance dans le développement pré-clinique du médicament.
La technique ex vivo a également été utilisé dans une étude clinique sur les biopsies de base (CNB) pour la recherche de l'inhibition de la cible dans les tumeurs 16,17. Les patients qui consentent, ont une procédure de pré-traitement aiguille de biopsie (CNB) réalisée (Figure 2). Comparablepour l'évaluation préclinique de tumeurs primaires, la technique ex vivo est utilisée pour déterminer la sensibilité ou de la réponse à la CNB de métastases accessibles. Plusieurs 200 um coupes en série de la CNB ont été traités uniquement avec le véhicule et des doses croissantes (0,25, 0,50, 1,0 et 2,5 uM) de la Hsp90i. Le nombre de doses Hsp90i utilisés dans l'évaluation ex vivo est déterminée par la taille de CNB. Cependant, tous les efforts sont faits pour utiliser le spectre de doses suggérées ci-dessus. Comme le précliniques ex vivo évaluation, d'intervention peut être évaluée et plus tard par rapport à l'effectif dans la réponse du patient (c.-à-analyses corrélatives; Figure 2) tel que déterminé par un post-traitement CNB pharmacocinétique (PK), c'est à dire, la rétention du médicament tel que mesuré par chromatographie en phase liquide spectrométrie de masse (LC-MS / MS) analyse ainsi que dans l'imagerie TEP patient (figure 2) 16,17. À ce jour, les analyses utilisant la technique ex vivo dans ce cétude CLINIQUE a été réalisée sur plusieurs types de tumeurs (par exemple, du sein, marginal lymphome de la zone, le lymphome à cellules du manteau, paragangliome métastatique, col de l'utérus et des ovaires) 16, 17. analyse corrélative pleine mise en œuvre de la technique ex vivo en outre exemplifie l'utilité de cette technique dans développement clinique du médicament.
Figure 1: Ex vivo analyse de la réponse d'un cancer du sein ER +. (A, panneau de gauche) affiche nids viables de carcinome canalaire invasif (IDC) (hématoxyline et éosine colorés; barre d'échelle 100 um). Lors du traitement (A, panneau de droite) avec 2,5 M de Hsp90i il ya une induction de ~ 40% de réponse apoptotique (noyaux pyknotiques / débris apoptotiques; flèches) (hématoxyline et éosine colorés; barre d'échelle 100 um). Lobules bénignes
Figure 2: Schéma de mise en œuvre de la technique ex vivo dans une étude clinique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
biologistes du cancer font face à des défis importants en essayant de développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Test de médicaments en développement sur des lignées cellulaires de cancer établis ne peut pas refléter avec précision en réponse vivo et in vivo sur des modèles PDX sont laborieux et très coûteux. Compte tenu de ce qui précède, l'application de techniques ex vivo de tumeurs primaires du patient 14, 15 est maintenant positionnée à côté de l'analyse moléculaire des lignées de cellules établies et les xénogreffes du cancer du patient dérivées (PDX).
Le présent document prend l'application de la technique ex vivo à une nouvelle hauteur dans la technique qui informe fidèlement la réponse (CI50), les effets hors-cible et permet l'analyse moléculaire des mécanismes de résistance et de rétroaction. Lorsque des données de réponse est en corrélation avec le profil moléculaire de la tumeur (par exemple, l'expression des protéines de marqueurs tumoraux, mutations) l'étude corrélative (réponse de la tumeur par rapport molecular profil) peut être utilisé pour sélectionner les patients les plus susceptibles de répondre à un médicament particulier, dans un effort pour améliorer les résultats des patients. Plus important encore, dans le développement de médicaments cliniques (c.-à-., Des biopsies en option), ex vivo réponse de prétraitement CNB peut être corrélé à (et validé) la réponse du patient (c.-à post-traitement CNB) et la rétention du médicament (pharmacocinétique (PK) évaluation) 16,17. L'utilisation de la technique ex vivo dans cette étude clinique a été capable de déterminer la réponse de la tumeur ainsi que la cible confirmer la spécificité (c'est-à-PD; induction de Hsp70) et informer le dosage et la planification de 16,17.
La technique ex vivo se prête à la plupart des types de tumeurs solides ainsi que les métastases du cancer par le sang (par exemple, les métastases ganglionnaires de lymphome) avec de légers ajustements dans le protocole pour certains types de tumeurs qui présentent des défis mineurs. Par exemple, les tumeurs du pancréas ont tendance à avoir une forte stroma rapport à des cellules tumorales, ce qui peut entraîner des sections qui ont une mauvaise représentation de la cellule cancéreuse. Achat de riches zones de cellules de cancer de la tumeur ne peut être effectué à l'analyse brute. Par conséquent, pour remédier à cet inconvénient potentiel des zones multiples petits cubes de l'échantillon de tumeur peut être intégré (4 moule / de l'agarose-enrobage) et sectionnées en même temps l'augmentation de la probabilité d'une section riche ex vivo de cellules de la tumeur.
Nos données appuient fortement l'utilisation de la technique ex vivo dans le développement préclinique de médicaments (figure 1). Ainsi que la réponse (IC50), reprennent les articles peuvent être analysés pour des essais de remplacement de la viabilité, la métabolomique, les stratégies thérapeutiques combinatoires, effet l'exposition au médicament a des facteurs sécrétés (par exemple, des cytokines, des exosomes), la résistance et les mécanismes de rétroaction et surtout, informer sur hors-cible effets (c'est à dire, normales et les cellules bénignes). Dans cette étude qui a utilisé un Hsp90i, cibler specifique ait et identification des «effets hors-cible» est la clé repose sur le postulat qu'il existe une piscine distinctif de «oncogène Hsp90 'ne se trouve que dans les cellules cancéreuses lors de la transformation maligne 10. Ceci est présenté dans la section des résultats (insert, figure 1A) où lobules bénignes d'une section ex vivo Hsp90i traités n'ont pas été modifiés. D'égale importance, qui se trouve dans une autre section de la même tumeur primaire se réfléchissant sur la figure 1, à 10 uM (dose thérapeutique pertinent) de section traitée ont montré une réponse complète de nids IDC alors associé un carcinome canalaire in situ (CCIS) est restée inchangée (données non présentées) . Les futures investigations dans cette ligne de recherche sont au-delà de la portée de ce document. Toutefois, ce résultat particulier informe sur l'état de la «transformation maligne ou progression de la maladie du CCIS associé de spécimens IDC, par rapport à l'oncogèneHsp90 chaperonner fonctionnement et soutient l'utilité de l'aide de la technique ex vivo dans le développement de médicaments.
Une application supplémentaire de la technique ex vivo est l'utilisation de l'analyse pré-efficacité dans des modèles de xénogreffes de tumeurs (c'est à dire., Ex vivo sectionnement de PDX) dans le développement de médicaments afin de déterminer la pharmacocinétique / pharmacodynamie (PK / PD) données avant d'effectuer impliqué, coûteux des études in vivo - permettant une plus informé, rentable étude in vivo l'efficacité des médicaments en.
Les étapes clés et les facteurs potentiels de limitation de la technique ex vivo sont les marchés et la coupe. Les marchés de l'échantillon de la tumeur (par exemple., Tumeur primitive / métastase) doit être effectuée rapidement avec une attention particulière à l'identification d'une zone de la tumeur avec le plus haut degré de viabilité. Grosses tumeurs ont tendance à avoir des zones centrales de nécrose qui ne sont pas nettement visibles. Par conséquent, le recrutement tissu from le bord extérieur le plus à augmenter la probabilité de l'obtention d'un échantillon viable. En ce qui concerne la coupe, la collecte de tranches de précision à l'épaisseur désirée (par exemple., 200 um) est fortement influencée par la densité de la tumeur / fermeté (hors CNB en raison de la très petite taille). Par exemple, un carcinome canalaire invasif est typiquement beaucoup plus dense à la différence de carcinome lobulaire invasif. Tissu tumoral dense offre une résistance appropriée - en l'absence de médias d'intégration permanente - à la lame, tandis que le tissu de la tumeur moins dense ne fonctionne pas. Des exemples de types de tissus tumoraux sont moins denses, mais ne sont pas limités à un carcinome lobulaire invasif, carcinome mucineux et des types de tumeurs gastriques. Pour surmonter cette limitation potentielle, dépannage à la vitesse de la lame appropriée et fréquence est nécessaire. Conformément épaisseur de coupe de précision en tranches, tout au long du processus de sectionnement, est essentielle pour une évaluation précise de la réponse aux médicaments.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Leica VT1000s | Leica | 14047235613 | |
| UltraPure agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 4% and 6% before use |
| Injector blade | Ted Pella | 121-4 | |
| MEM with Penicillin + Streptomycin | Media Core Facilities (MSKCC) | The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center | |
| Scalpel no. 10 | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Disposable forceps | Cole-Parmer | 84011182 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Science | 70181 | |
| FBS (heat inactivated) | Gemini | 100106 | |
| 24 well plates | Corning | 3524 | |
| Formalin (10%) | Sigma Diagnostics | SDHT501128 | |
| 16% Formaldehyde solution | Thermo Scientific | 28908 | |
| Embedding microsettes | Simport | M503-2 | |
| Ethanol (70%) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 15-462-2SQ | |
| Microwave | General Electric | ModelJES2051DNBB | |
| Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) | Sigma-Aldrich | E1505-5G | |
| 10 mm dishes | BD Falcon | 353003 | |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 |
References
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