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Medicine

Ex Vivo risposta al trattamento di tumori primari e / o associati per metastasi preclinici e sviluppo clinico di Therapeutics

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Fondata linee cellulari tumorali e xenotrapianti sono stati il ​​cardine della ricerca sul cancro negli ultimi decenni. Tuttavia, recenti evidenze suggeriscono che la risposta terapeutica è fortemente influenzata dal microambiente delle cellule tumorali. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una analisi ex vivo di campioni tumorali primarie per scopi di sviluppo della droga.

Introduction

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Lo sviluppo di terapie efficaci cancro ha dimostrato di essere estremamente impegnativo. Linee cellulari tumorali e espianti tumorali - così come xenotrapianti sono stati utilizzati nella ricerca sul cancro per oltre mezzo secolo 1,2,3. Ad oggi, l'analisi molecolare della sensibilità di droga e resistenza in entrambe le linee di cellule di cancro affermati e xenotrapianti di derivazione paziente (PDX) è indispensabile. Tuttavia, i test di composti in linee cellulari di cancro stabiliti spesso non è predittivo di efficacia in vivo, e corrispondenti studi in vivo negli animali, soprattutto nei modelli PDX, è molto costoso e richiede tempo. I limiti di questi sistemi modello, vale a dire l'impossibilità di informare l'influenza del microambiente nativo nella progressione tumorale e la risposta alle strategie terapeutiche, ha portato il campo di ricerca per sviluppare metodi aggiuntivi per complimentarmi con queste analisi. Di recente, accresciuta attenzione viene rivolta verso ex vivo analisi di tum pazienteo espianti 4, 5 a causa della maggiore comprensione che il cancro risposta terapeutica non è esclusiva alla composizione molecolare intrinseca delle cellule tumorali, ma piuttosto è fortemente influenzato dal microambiente delle cellule tumorali 6, 7, una caratteristica che non può essere riassunta con metodi di coltura tradizionali e / o PDX. ex vivo analisi nel contesto di cui sopra (ad esempio., influenza adiacente tumorale circostante microambiente cellulare) implica la valutazione delle sezioni tumore / metastasi primarie vitali, piuttosto che ex vivo analisi degli isolati cellulari 8, 9.

Riportiamo qui su una tecnica ex vivo (ad esempio., Sezioni di precisione-fette fresche di tessuto) di entrambi i tumori primari del paziente e metastasi associate (ad esempio, linfonodi) che segnala fedelmente alla risposta (IC50), gli effetti off-target e consente molecolare analisi dei meccanismi di resistenza e di feedback. Inoltre, l'analisi correlativa di therapeUTIC sensibilità / resistenza contro biomarker e profilo di espressione genica può essere eseguita in uno sforzo per identificare i pazienti più probabilità di rispondere al farmaco sperimentale di interesse (ad esempio., la risposta alle alte farmaco corrisponde paziente con particolare profilo biologico). Applicazione della tecnica ex vivo e la valutazione in modo multi-parametro è movimento verso la selezione dei pazienti e il miglioramento complessivo dei risultati clinici.

Trattamento ex vivo analisi di risposta potrebbe diventare uno strumento standard per lo sviluppo preclinico e clinico di terapie del cancro ed è immaginato come un passo verso un approccio di medicina personalizzata nelle strategie di sviluppo terapeutiche.

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Protocol

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NOTA: approvvigionamento dei tessuti del paziente è stato autorizzato attraverso la revisione bordo istituzionalmente (IRB) -approvato Biospecimen e protocolli clinici (numeri di protocollo 09-121 e 11-041, rispettivamente) al Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

Procurement 1 Tissue

  1. Approvvigionamento di paziente tumore primario / metastasi
    NOTA: Fino ad oggi, questo protocollo è stata eseguita su pancreatiche, gastriche e tipi di tumore al seno chirurgicamente rimosso, così come, metastasi linfoma.
    1. Dirigere il team chirurgico di consegnare il campione di corriere o sistema a tubo pneumatico per il reparto di Patologia in borsa tenuta esemplare di plastica ben chiuso e sterile nel contenitore a prova di fuoriuscita sterile. Dirigere la squadra chirurgica per trasportare il campione allo stato fresco senza formalina o fissante.
    2. Dirigere l'assistente patologo o patologo per raccogliere il campione fresco con tecnica sterile, che includes uso di guanti e strumenti sterili sotto una cappa a flusso laminare.
    3. Registrare il tempo di raccolta del campione procurati, che viene tenuto rigorosamente sotto 30 minuti dal completamento della procedura chirurgica. Prendendo in considerazione gli effetti di ischemia fredda, non prelevare campioni da campioni resecati con un tempo di ischemia fredda> 30 min 18.
    4. Dirigere il personale del Dipartimento di Patologia per rimuovere un campione del tumore primario di circa 0,5 centimetri 3-1,0 cm 3 in una cappa a flusso laminare per mantenere un ambiente sterile. Quando possibile, scegliere il tessuto tumorale dalla periferia della lesione indice per evitare possibili necrosi centrale (morte cellulare) frank.
      NOTA: Il tessuto necrotico può essere grossolanamente riconoscibile per uno dei seguenti criteri: perdita di colore o pallore del tessuto; perdita di forza in cui il tessuto necrotico è morbido e friabile; una demarcazione netta tra il tessuto necrotico e vitale.
    5. Dirigere il pathologist o assistente patologo per fornire tessuti periferici che è in eccesso (scarti chirurgica) dopo il prelievo immediato del tumore per la valutazione diagnostica. Porre il campione in un tubo da centrifuga da 15 ml sterile contenente circa 5 ml di supporti essenziale minimo (MEM) contenente 1% antibiotici (penicillina e streptomicina).
    6. Se disponibile (ad esempio, linfonodi ascellari di coda di campione mastectomia), procurarsi un grossolanamente positivi esemplare linfonodali associato della stessa dimensione (0,5 centimetri 3-1,0 cm 3) e confrontare la risposta ai farmaci del tumore primario. Come il campione del tumore primario, posizionare il campione associati linfonodi in un tubo da centrifuga da 15 ml sterile contenente circa 5 ml di supporto essenziale minimo (MEM) contenente 1% antibiotici (penicillina e streptomicina).
    7. Se la dimensione dei permessi campioni chirurgici (ad esempio, campioni mastectomia), rimuovere (distante da tumore primario) di un campione di tessuto normale (cioè,normale / parenchima denso fibroso seno) e posto in una provetta da centrifuga conica da 15 ml sterile contenente circa 5 ml di supporti minimi essenziali (MEM) contenenti 1% antibiotici solo a scopo di trasferimento. In seguito trasferimento alle strutture di laboratorio, di trasferire il campione 'normale' per un esageratamente, congelare 'scatto' e conservare in un freezer -80 ° C per le analisi molecolari futuri.
    8. Mettere tutti i campioni su ghiaccio bagnato e trasportare immediatamente allo spazio laboratorio per il sezionamento ex vivo tessuto fresco. Non tratto il campione normale, ma piuttosto conservare in un freezer -80 ° C per le analisi molecolari futuri. Trasferire una parte del tumore primitivo e metastasi associato ad una esageratamente, congelare 'scatto' e conservare in freezer -80 ° C per le analisi molecolari futuri.
  2. Approvvigionamento di tessuto da studi clinici (ad esempio, centrali opzionale biopsie (CNB))
    NOTA BENE: Otteniamo tessuti tumorali da pazientiiscritti ai protocolli clinici che danno il loro consenso a sottoporsi ad un CNB di una metastasi tumorale accessibili prima dell'inizio della terapia. CNB, ad oggi, sono stati effettuati su pazienti con mammella, linfoma della zona marginale, linfoma a cellule del mantello, paraganglioma metastatico, cervice (cellule squamose) e tumori ovarici.
    1. Disporre di personale clinici di Radiologia Interventistica o servizio competente di eseguire un pre-trattamento nucleo ago biopsia e posizionare il campione in un 15 ml sterile provetta da centrifuga conica contenente circa 5 ml di supporti essenziale minimo (MEM) contenente 1% antibiotici (penicillina e streptomicina).
    2. Posizionare il campione di biopsia su ghiaccio bagnato e trasportare immediatamente allo spazio laboratorio per il sezionamento ex vivo tessuto fresco.

2 Preparazione dei materiali per le impostazioni sezionamento e vibratome

  1. Preparazione dei materiali per il sezionamento
    1. Fare una soluzione di agarosio al 4% con l'aggiunta di 4 g di agasalito a 100 ml di PBS. Autoclave (Impostazioni ciclo: liquidi, 121 ° C, 30 min, a 15 libbre per pollice quadrato) la soluzione prima del primo utilizzo. Per gli usi successivi, posizionare l'agarosio 4% in un forno a microonde per liquefare (Alto calore per intervalli di 30 sec) prima di ogni utilizzo e raffreddare adeguatamente a ~ 25 ° C (cioè, caldo al tatto), consapevoli che agarosio solidifica a temperatura ambiente.
    2. Utilizzare l'agarosio 4% come un supporto di tessuto embedding non permanente. Quando l'agarosio 4% si è raffreddato a sufficienza ed è ancora in uno stato liquido, con una pinza sterile posizionare il campione di tessuto in uno stampo embedding e versare il agarosio 4%.
    3. Posizionare il campione di tessuto stretti (~ 2 mm di distanza), ma non direttamente sulla parete superficie di taglio dello stampo embedding. L'agarosio 4% inizierà a solidificarsi in fretta, quindi opportunamente posizionare il campione di tessuto in fretta. Durante il sezionamento, mantenere l'agarosio 4% in un bagno d'acqua a 55 ° C per mantenere in soluzione.
    4. Per una piastra a 24 pozzetti per l'analisi di sezione, aggiungere 1 ml of multimediale completo (ad esempio, MEM + 10% di siero fetale bovino + 1% antibiotici) in ciascun pozzetto. Mantenere la piastra a 24 pozzetti a temperatura ambiente (~ 25 ° C) per tutta la durata di sezionamento.
  2. Preparazione delle impostazioni vibratome
    1. Utilizzando il microtomo vibrante, impostare la velocità con cui la lama si avvicina il campione [0 (0,00 mm / sec) a 10 (2,5 mm / sec)] e la frequenza della lama [0 (0 Hz) a 10 (100 Hz) ]. Regolare le impostazioni in base alla consistenza del tessuto (ad esempio, densità / consistenza).
    2. Per un tumore mammario primario del carcinoma duttale invasivo, regolare le impostazioni a 6 e 3, la velocità e la frequenza rispettivamente. Per tessuto tumorale meno denso / ditta, diminuire la velocità e aumentare la frequenza di conseguenza.
    3. Impostare lo spessore di taglio entro i limiti dello strumento (1-999 micron). Per queste analisi, impostare lo spessore della sezione a 200 micron.
    4. Montare il campione agarosio-embedded utilizzando un sottile strato di adesivo liquido sul tha disco dei campionit è immerso in un serbatoio di media che è racchiuso nel ghiaccio bagnato.

3 Tissue sezionamento, trattamento e analisi

  1. Rimuovere le sezioni di precisione-affettato subito dopo il sezionamento con pinza sterile e posto in un piatto multi-bene con 1 ml di completo supporto. Quando le sezioni sono acquisite sufficienti per la risposta e le analisi correlative, posizionare la piastra multi-bene per la risposta al trattamento in un tessuto culturale incubatore fissato a condizioni di coltura dei tessuti normali.
  2. Prendere più sezioni di controllo che fermalibri sezioni trattate nel tentativo di confermare la risposta dose-dipendente al contrario di manufatti in coltura. Eseguire tessuto sezionamento rapidamente (~ 30 - 40 minuti), ben al di eventuali effetti negativi del freddo tempo ischemico (~ 2 - 4 ore) 18. Eseguire il trattamento delle sezioni solo dopo un periodo di acclimatazione 1 ora.
  3. Dopo il periodo di acclimatazione 1 ora, aggiungere dosi crescenti (terapeuticamente rilevanti;
  4. Dopo il trattamento, rimuovere tutte le sezioni in condizioni sterili e formalina-fix posizionando la sezione di tessuto in una provetta contenente sia il 10% formalina tamponata e posto a RT O / N o in una provetta contenente 4% paraformaldeide (diluito 16% paraformaldeide da un flaconcino con PBS per una concentrazione finale di 4%) e posto a temperatura ambiente per 2 ore.
    1. Fissare sezioni di tessuto di grandi dimensioni (ad es., ~ 6 mm x 4 mm) 200 micron di spessore in 10% formalina tamponata O / N a RT. Fissare sezioni più piccole (ad es. 1 mm x 1 mm) 200 micron di spessore in paraformaldeide al 4% per 2 ore a temperatura ambiente.
      NOTA: Per una penetrazione efficace del fissativo del volume di fixative opportuno 20X il volume del tessuto. Dato che il presente protocollo si traduce in dimensioni estremamente piccole di tessuto (ad esempio 6 mm 3 di tessuto = 6 ml di volume), per la garanzia di un uso corretto fissaggio 1 ml di fissativo per tutte le dimensioni del tessuto.
    2. Dopo fissazione hanno i campioni di tessuto incluso in paraffina da parte del personale del Dipartimento di Patologia. Sezione esemplare blocchi di paraffina su vetrini caricati per essere ematossilina e eosina macchiato e valutati immunoistochimica (ad esempio, apoptosi).

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Representative Results

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Per questo studio, la tecnica ex vivo è stato utilizzato in un'analisi correlativa terapeutico sensibilità / resistenza di un inibitore della heat shock protein 90 (Hsp90i). In una valutazione preclinica di questo Hsp90i, il cancro al seno tumore primario, un ER + invasivo carcinoma duttale (IDC), e associata metastasi linfonodali sono stati analizzati ex-vivo per la risposta al trattamento   (Figura 1). Più di 200 micron sezioni seriali sono stati trattati solo con veicoli e crescenti dosi (0,25, 0,50, 1,0 e 2,5 micron) del Hsp90i. I dati in figura 1 rappresenta fissate in formalina, sezioni in paraffina (FFPE) e ematossilina e eosina (H & E) tinto a seguito di un periodo di trattamento di 48 ore. Il controllo (solo veicolo) sezione trattata mostra nidi IDC vitali, mentre la sezione di tessuto trattato 2,5 micron determinato una induzione 40% di apoptosi come si è visto dai cambiamenti morfologici nucleari (ad esempio, picnotico nuclei / APOPdetriti totic) (Figura 1A). L'apoptosi è stata ulteriormente confermata nel tumore primario da terminale deossinucleotidil transferasi etichettatura fine dUTP nick (TUNEL) analisi (dati non riportati). IC50 è calcolata a partire dai dati di risposta da parte grafica apoptosi per cento in funzione della concentrazione del farmaco. Significativamente, il tuttofare, Hsp90 svolge un ruolo chiave nella stabilizzazione proteica e omeostasi dei percorsi critici di segnalazione di entrambe le cellule normali e tumorali 10. La capacità di indirizzare Hsp90 nel cancro si basa sulla constatazione che le cellule maligne pesantemente dipendono dalla funzione chaperoning di Hsp90, soprattutto nel tentativo di superare gli stati di stress degli ambienti inospitali incontrati durante la progressione metastatica. In sostanza, le cellule tumorali diventano fortemente dipendenti dalla funzione di Hsp90 risultante in una piscina targeting selettivo di 'oncogenica' Hsp90 11. Nel inserto, figura 1A, adiacente lobulo benigna con acini e del dotto associata rimane inalterato in la stessa sezione Hsp90i trattati con 2,5 micron. A nostra conoscenza, questa è la prima volta questa Hsp90 cancro-specificità viene catturato visivamente in Hsp90i risposta-valutazione dei tumori primari e delle metastasi associate. Questa scoperta di cellule benigne / normali inalterate come si è visto in lobuli adiacenti benigni di IDC (Figura 1A), così come i vasi all'interno del parenchima mammario benigno che circonda il tumore primario e associata metastasi linfonodali (dati non riportati) è stato ricapitolato le diverse attività tipi di tumore (ad esempio, della mammella, dello stomaco e metastasi linfoma).

Un accompagnamento metastasi linfonodale di questo tumore primario ha mostrato una risposta completa solo nei nidi IDC che sono stati liberamente associati (Figura 1B). Nidi IDC che formavano sferoidi stretti, tuttavia, rimasero vitale, come confermato dal TUNEL (Figura 1C). Ulteriori analisi degli sferoidi IDC vitali mediante immunofluorescenza rivelateuna persistente o ri-espressione del cellula-cellula molecola di adesione, E-caderina (Figura 1C). Questo risultato è coerente con persistente, over-espressione di E-caderina aggiungendo al potenziale metastatico o metastatico efficienza come risulta altamente maligno, letale cancro al seno infiammatorio 12, 13. Sebbene interessante, questo risultato va oltre lo scopo di questo documento. Tuttavia, è importante notare che questi linfonodi sferoidi (LN) IDC sono stati mantenuti in coltura per un periodo di 2 settimane e presta così credito alla forza con la tecnica ex vivo per studiare sia la sensibilità / resistenza nello sviluppo di farmaci preclinico.

La tecnica ex vivo è stato anche impiegato in uno studio clinico su biopsie nucleo ago (CNB) per la prova di inibizione bersaglio nei tumori 16,17. I pazienti che il consenso, hanno una procedura di pre-trattamento nucleo agobiopsia (CNB) eseguita (Figura 2). Comparabilealla valutazione preclinica dei tumori primari, la tecnica ex vivo viene utilizzato per determinare la sensibilità o risposta nel CNB di metastasi accessibili. Più di 200 micron sezioni seriali del CNB sono stati trattati con il solo e dosi crescenti (0,25, 0,50, 1,0 e 2,5 micron) del Hsp90i veicolo. Il numero di dosi Hsp90i utilizzati nella valutazione ex vivo è dettata dalla dimensione del CNB. Tuttavia, viene fatto ogni sforzo per utilizzare lo spettro delle dosi suggerite sopra. Come il preclinico ex vivo di valutazione, la risposta può essere valutato e successivamente rispetto alla effettiva risposta del paziente (ad esempio, analisi correlative; Figura 2), come determinato dalla post-trattamento CNB farmacocinetica (PK), vale a dire, la conservazione della droga come misurato tramite cromatografia liquida spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS) analizza nonché in PET paziente (Figura 2) 16,17. Ad oggi, analisi utilizzando la tecnica ex vivo in questo cLiniCAL studio è stato eseguito su diversi tipi di tumore (ad esempio, della mammella, linfoma della zona marginale, linfoma a cellule del mantello, paraganglioma metastatico, cervice e tumori ovarici) 16, 17. analisi correlativa piena attuazione ulteriormente la tecnica ex vivo esemplifica l'utilità di questa tecnica in lo sviluppo di farmaci clinico.

Figura 1
Figura 1 ex vivo analisi della risposta di un tumore al seno ER +. (A, diagramma di sinistra) mostra nidi vitali di carcinoma duttale invasivo (IDC) (ematossilina e eosina macchiato; bar scala di 100 micron). Dopo il trattamento (A, pannello di destra) con 2.5 mM di Hsp90i c'è una induzione di ~ 40% risposta apoptotica (nuclei picnotici / detriti apoptotica; frecce) (ematossilina e eosina macchiato; bar scala di 100 micron). Lobuli benigni g> (A, inserto) rimangono inalterate dopo il trattamento (ematossilina e eosina macchiato; barra della scala 200 micron). Il controllo di un nodo associato linfa (LN) (B, pannello di sinistra) mostra un piccolo livello di apoptosi (ematossilina e eosina macchiato; scala bar 100 micron), mentre la sezione trattata (B, pannelli di destra) mostrano una zona di metastatica IDC nidi con risposta completa (ematossilina e eosina macchiato, barra di scala, in senso orario 2 mm 300 micron, 200 micron e 200 micron). Tuttavia, stretti sferoidi IDC (Spheroids; Sp) dalla stessa sezione (C, pannello di sinistra) mostrano poco, se del caso, l'apoptosi, come dimostrato da analisi TUNEL rimanendo valida con un concomitante (scala bar 200 micron) (C, pannello di destra) su -expression di E-caderina (ingrandimento 100X).> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2 Schema di attuazione ex vivo tecnica in uno studio clinico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Biologi cancro devono affrontare sfide significative nel tentativo di sviluppare efficaci strategie terapeutiche. Test farmaci in sviluppo su linee cellulari di cancro stabilite non può riflettere con precisione in risposta vivo e in vivo su modelli PDX sono laborioso e molto costoso. Considerato quanto sopra, l'applicazione di tecniche ex vivo di paziente primaria tumori 14, 15 è ora posizionato accanto alla analisi molecolare di consolidate linee cellulari tumorali e xenotrapianti di derivazione paziente (PDX).

Questo documento tiene l'applicazione della tecnica ex vivo per una nuova altezza dal fatto che la tecnica informa fedelmente alla risposta (IC50), effetti off-target e consente l'analisi molecolare dei meccanismi di resistenza e di feedback. Quando i dati di risposta è correlata al profilo molecolare del tumore (cioè, l'espressione della proteina di marcatori tumorali, mutazioni) lo studio correlativo (vs risposta tumorale molprofilo ecular) può essere usato per selezionare i pazienti più probabilità di rispondere a un particolare farmaco, nel tentativo di migliorare i risultati dei pazienti. Più significativamente, in fase di sviluppo clinico di un farmaco (ad esempio., Biopsie opzionale), ex vivo di risposta di pretrattamento CNB può essere correlato a (e convalidato) in risposta del paziente (ad esempio, dopo il trattamento CNB) e la ritenzione farmaco (farmacocinetica (PK) di valutazione) 16,17. L'uso della tecnica ex vivo in questo studio clinico è stato in grado di determinare la risposta del tumore e confermano bersaglio specificità (cioè, PD; induzione Hsp70) e informa sul dosaggio e pianificazione 16,17.

La tecnica ex vivo è riconducibile alla maggior parte dei tipi di tumori solidi e metastasi tumorali attraverso il sangue (per esempio, le metastasi linfonodali di linfoma) con piccoli aggiustamenti nel protocollo per alcuni tipi di tumore che presentano sfide minori. Per esempio, tumori del pancreas tendono ad avere un elevato sTroma rapporto delle cellule tumorali, che può risultare in sezioni che presentano una scarsa rappresentazione delle cellule del cancro. Approvvigionamento di cellule di cancro ricche aree del tumore non può essere effettuato al momento dell'analisi lordo. Pertanto, per superare questo potenziale lacuna più piccole aree cubi rispetto al provino tumorali possono essere incorporati (4 / agarosio-embedding stampo) e sezionati contemporaneamente aumentando la probabilità di un ricco di cellule ex vivo sezione tumore.

I nostri dati supportano fortemente l'uso della tecnica ex vivo nello sviluppo di farmaci preclinico (Figura 1). Insieme alla risposta (IC50), replicano sezioni possono essere analizzati per test alternativi vitalità, la metabolomica, combinatori strategie terapeutiche, l'esposizione al farmaco ha effetto sui fattori secreti (ad esempio, citochine, exosomes), di resistenza e di feedback meccanismi e, soprattutto, informano on off bersaglio effetti (cioè, normali e cellule benigne). In questo particolare studio che ha utilizzato un Hsp90i, destinazione specificity e identificazione degli «effetti off-obiettivo» è la chiave basa sul presupposto che vi è una piscina distintivo di 'oncogenica Hsp90' trovato solo nelle cellule tumorali maligne su di trasformazione 10. Questo è presentato nella sezione risultati (insert, Figura 1A) dove lobuli benigni di una sezione ex vivo Hsp90i trattati sono rimaste inalterate. Di uguale importanza, che si trova in un'altra sezione dello stesso tumore primario riflette nella figura 1, a 10 mM (dose terapeuticamente irrilevante) sezione trattati hanno mostrato risposta completa di nidi IDC, mentre carcinoma duttale associata in situ (DCIS) è rimasto inalterato (dati non riportati) . Indagini future in questa linea di ricerca sono oltre lo scopo di questo documento. Tuttavia, questo particolare constatazione informa sullo stato di 'trasformazione maligna' o progressione della malattia di DCIS associato in campioni IDC, rispetto al oncogenoHsp90 chaperoning funzionante e sostiene l'utilità di utilizzare la tecnica ex vivo nello sviluppo di farmaci.

Una domanda ulteriore della tecnica ex vivo è l'uso in analisi pre-efficacia in modelli di xenotrapianto di tumore (ad esempio., Ex vivo sezionamento di PDX) nello sviluppo di farmaci per determinare la farmacocinetica / farmacodinamica (PK / PD) dati prima di eseguire coinvolti, costoso studi in vivo - consentire un più informato, conveniente studio in vivo l'efficacia dei farmaci.

I passaggi chiave ei potenziali fattori limitanti della tecnica ex vivo sono appalti e sezionamento. Approvvigionamento del campione tumorali (ad esempio., Tumore primario / metastasi) deve essere eseguita rapidamente con la massima attenzione ad individuare una zona del tumore con il più alto grado di redditività. Tumori di grandi dimensioni tendono ad avere aree centrali necrotiche che non sono grossolanamente visibile. Pertanto, procurare tessuto from il bordo più esterno aumenta la probabilità di ottenere una valida esemplare. Per quanto riguarda il sezionamento, la raccolta di fette di precisione allo spessore desiderato (ad es., 200 micron) è fortemente influenzata dalla densità del tumore / compattezza (escluso CNB a causa della dimensioni estremamente ridotte). Ad esempio, il carcinoma duttale invasivo è in genere molto più densa in contrasto con carcinoma lobulare invasivo. Tessuto tumorale Dense fornisce resistenza adeguata - in assenza di mezzi embedding permanente - alla lama, mentre il tessuto tumorale meno denso non lo fa. Esempi di tipi di tessuto tumorale meno dense includono ma non sono limitati a carcinoma lobulare invasivo, carcinomi mucinosi e tipi di tumore gastrico. Per superare questo potenziale limitazione, è necessario risoluzione dei problemi con adeguata velocità e la frequenza della lama. Coerentemente spessore della sezione di precisione-affettato, durante tutto il processo di sezionamento, è fondamentale per la valutazione accurata della risposta al farmaco.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>Ex Vivo</em> risposta al trattamento di tumori primari e / o associati per metastasi preclinici e sviluppo clinico di Therapeutics
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Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

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