Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo Treatment Response av primære svulster og / eller Associated metastaser for preklinisk og klinisk utvikling av legemiddel

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Etablerte kreftcellelinjer og xenografts har vært bærebjelken i kreftforskningen de siste tiårene. Imidlertid tyder nyere bevis på at terapeutisk respons er sterkt påvirket av svulsten celle mikromiljøet. Derfor har vi utviklet en ex vivo analyse av primære vevsprøver for narkotikautviklingsformål.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utvikle effektive kreftbehandling har vist seg å være svært utfordrende. Kreftcellelinjer og kreft eksplantater - samt xenografts har blitt brukt i kreftforskning i over et halvt 1,2,3-tallet. Til dags dato, er den molekylære analyser av stoffet følsomhet og resistens i både etablerte kreftcellelinjer og pasient avledet xenografts (PDX) uunnværlig. Imidlertid er testing av forbindelsene i etablerte kreftcellelinjer ofte ikke prediktiv for in vivo effekt, og tilsvarende in vivo-studier i dyr, spesielt i PDX-modeller, er svært kostbart og tidkrevende. Begrensningene av disse modellsystemer, nemlig den manglende evnen til å informere på påvirkning av den opprinnelige mikromiljøet i tumorprogresjon og respons på terapeutiske strategier har ført til forskning området på å utvikle andre metoder for å komplimentere disse analysene. Av nyere, er forsterket oppmerksomhet mot ex vivo analyse av pasient tumeller eksplantater 4, 5 på grunn av den større forståelse at kreft terapeutisk respons er ikke eksklusivt for den iboende molekylær sammensetning av kreftceller, men heller er sterkt påvirket av tumorcellemikro 6, 7 en funksjon som ikke kan rekapitulert av tradisjonelle dyrkningsmetoder og / eller PDX. Ex vivo-analyse i ovennevnte sammenheng (f.eks. innflytelse av tilstøtende omgir tumorcelle-mikromiljøet) innebærer vurdering av levedyktige primære tumor / metastase seksjoner, i stedet for ex vivo analyse av cellulære isolater 8, 9.

Vi rapporterer her på en ex vivo teknikk (ie., Presisjon-skiver fersk vevssnitt) av både pasient primære svulster og tilknyttede metastaser (dvs. lymfeknuter) som trofast informerer på respons (IC50), off-target effekter og gir mulighet for molekylær analyse av motstand og tilbakekoblingsmekanismer. I tillegg er en samsvarende analyse av therapeUtic følsomhet / resistens mot biomarkør og genuttrykk profilen kan utføres i et forsøk på å identifisere pasienter mer sannsynlig å svare på den eksperimentelle narkotika av interesse (ie., høye medikamentrespons kamper pasient med særlig biologisk profil). Anvendelse av den ex vivo teknikk og vurdering i en multi-parameter mote er bevegelse mot pasientens utvalg og generell forbedring av de kliniske resultater.

Ex vivo behandlingsrespons analyse kunne bli en standard verktøy i preklinisk og klinisk utvikling av kreftbehandling, og er tenkt som et skritt mot et personlig medisin tilnærming i terapeutiske utviklingsstrategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Pasient vev anskaffelser ble autorisert gjennom institusjonelt review board (IRB) -godkjent Biospecimen og kliniske protokoller (protokoll tall 09-121 og 11-041, henholdsvis) ved Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

1. Tissue Procurement

  1. Anskaffelse av pasientens primærtumor / metastase
    MERK: Til dags dato har denne protokollen blitt utført på kirurgisk fjernet bukspyttkjertelen, mage og bryst krefttyper, samt, lymfom metastaser.
    1. Rett kirurgisk team for å levere prøven med bud eller pneumatisk rør system til patologi avdelingen i tett lukket og sterilt lekkasjesikker plast prøven bag innenfor steril spill tett beholder. Rett kirurgisk team for å transportere prøven i frisk tilstand uten formalin eller fiksativ.
    2. Rett patolog eller patolog assistent til å høste nye prøver ved hjelp av steril teknikk, som includes bruk av sterile hansker og instrumenter under en laminær hette.
    3. Noter innhøstingstidspunktet av de innhentede prøven, som holdes under 30 grundig min fra fullføringen av den kirurgiske prosedyren. Tatt i betraktning effektene av kulde iskemi, ikke ta prøver fra resekterte prøver med en kald iskemisk tid> 30 min 18.
    4. Rett patologi personell til å fjerne en primærtumor eksemplar av ca 0,5 cm 3 til 1,0 cm 3 i en laminær hette for å opprettholde et sterilt miljø. Når det er mulig, velger tumorvev fra periferien til indeks lesjon for å unngå potensiell frank sentral nekrose (celledød).
      MERK: nekrotisk vev kan være grovt gjenkjennelig med noen av følgende kriterier: tap av farge eller blekhet av vev; tap av styrke i hvilken nekrotisk vev er myk og lettsmuldrende; en tydelig avgrensning mellom nekrotisk og levedyktig vev.
    5. Rett pathologist eller patolog assistent for å gi perifert vev som er i overkant (kirurgisk forkast) etter umiddelbar prøvetaking av svulsten for diagnostisk vurdering. Plasser prøven i en 15 ml steril konisk sentrifugerør inneholdende omtrent 5 ml av minimum essensielt medium (MEM) inneholdende 1% antibiotika (penicillin og streptomycin).
    6. Hvis det er tilgjengelig (f.eks lymfeknute av aksillær halen av mastektomi prøven), anskaffe et grovt positive forbundet lymfeknute eksemplar av samme størrelse (0,5 cm 3 til 1,0 cm 3) og sammenligne med narkotika respons av primærtumor. I likhet med de primære tumor prøven, plassere de tilhørende lymfeknute prøven i en 15 ml steril konisk sentrifugerør inneholdende omtrent 5 ml av minimum essensielt medium (MEM) inneholdende 1% antibiotika (penicillin og streptomycin).
    7. Hvis størrelsen på kirurgisk prøvetillatelser (f.eks mastektomi prøven), fjern (fjernt fra primærtumor) en prøve av normalt vev (dvs.,normal tett / fiber bryst parenchyma) og plasser i en 15 ml sterilt koniske sentrifugerør inneholder ca 5 ml av minimum essensielle media (MEM) inneholder 1% antibiotika for overføringsformål. Etter overføring til laboratoriefasiliteter, overføre den "normale" prøven til en cryovial, 'snap' fryse og lagre i en -80 ° C fryser for fremtidige molekylære analyser.
    8. Legg alle prøvene på våt is og umiddelbart transportere til laboratoriet plass for ex vivo frisk vev snitting. Ikke del den normale prøven men heller lagre i en -80 ° C fryser for fremtidige molekylære analyser. Overføre en del av primærtumor og tilhørende metastasering til en cryovial, 'snap' fryse og lagre i en -80 ° C fryser for fremtidige molekylære analyser.
  2. Anskaffelse av vev fra kliniske studier (f.eks valgfritt kjerne nål biopsier (CNB))
    MERK: Vi får tumorvev fra pasienterregistrert på kliniske protokoller som gir sitt samtykke til å gjennomgå en CNB av et tilgjengelig tumor metastaser før starten av behandlingen. CNBs, til dags dato, har blitt utført på pasienter med brystkreft, marginal sone lymfom, mantelcelllymfom metastatisk paragangliom, livmorhals (plateepitelkreft) og eggstokkreft.
    1. Har kliniske personell fra intervensjonsradiologi eller relevant avdeling utføre en pre-behandling kjerne nål biopsi og plassere prøven i en 15 ml sterilt koniske sentrifugerør inneholder ca 5 ml minimum essential media (MEM) inneholder 1% antibiotika (penicillin og streptomycin).
    2. Plasser biopsi prøven på våt is og umiddelbart transportere til laboratoriet plass for ex vivo frisk vev snitting.

2. Utarbeidelse av materialer for seksjonering og vibratome Innstillinger

  1. Klargjøring av materialer for Seksjonering
    1. Gjør en 4% agarose-løsning ved å tilsette 4 g agasteg til 100 ml med PBS. Autoklav (syklusinnstillinger: Væske, 121 ° C, 30 min, 15 pounds per kvadrattomme) oppløsningen nøye før første gangs bruk. For senere bruk, legg 4% agarose i en mikrobølgeovn å kondensere (Høy varme i 30 sek mellomrom) før hver gangs bruk og kjøle hensiktsmessig på ~ 25 ° C (dvs. varm å berøre) oppmerksom på at agarose stivner ved RT.
    2. Bruk 4% agarose som et ikke-permanent vev innebygging medier. Når de 4% agarose er tilstrekkelig avkjølt og er fortsatt i en flytende tilstand, med steril tang plassere vevspreparat i en embedding mugg og hell i 4% agarose.
    3. Plasser vevspreparat nær (~ 2 mm avstand), men ikke direkte på snittflaten veggen av embedding mold. Den 4% agarose vil begynne å stivne hurtig, og derfor hensiktsmessig å plassere vevspreparat raskt. Under skjæring, holde 4% agarose i et 55 ° C vannbad for å holde i oppløsning.
    4. Til en 24-brønns plate i seksjon analyse, tilsett 1 ml of komplett medium (dvs. MEM + 10% føtalt bovint serum + 1% antibiotika) til hver brønn. Hold 24-brønns plate ved RT (~ 25 ° C) under hele seksjonering.
  2. Utarbeidelse av vibratome Innstillinger
    1. Ved hjelp av den vibrerende mikrotomen, angir hastigheten som bladet nærmer prøven [0 (0,00 mm / sec) til 10 (2,5 mm / sek)] og frekvensen av bladet [0 (0 Hz) til 10 (100 Hz) ]. Juster innstillingene i henhold til strukturen på vev (dvs. tetthet / fasthet).
    2. For en primær brystsvulst av invasive ductal carcinoma, juster innstillingene til 6 og 3, hastighet og frekvens hhv. For mindre tett / fast svulstvev, redusere hastigheten og øke frekvensen tilsvarende.
    3. Sett snittykkelse innenfor instrument grenser (1 - 999 mm). For disse analysene, sette tykkelsen delen på 200 mikrometer.
    4. Monter agarose-innebygde prøven ved hjelp av et tynt lag av flytende klebemiddel på prøveplaten that er nedsenket i et reservoar av media som er innkapslet i våt is.

3. Tissue Seksjonering, Behandling og Analyser

  1. Fjern de presisjons-skiver seksjoner umiddelbart etter snitting ved hjelp av sterile pinsetter og plasser i en multi-brønn plate med 1 ml komplett medium. Når tilstrekkelige deler er anskaffet for respons og trene seg analyser, plasser multi-brønn plate for behandlingsrespons i en vev kultur inkubator satt til standard vev dyrkningsforhold.
  2. Ta flere kontrollenheter som sluttmarkøren de behandlede seksjoner i et forsøk på å bekrefte doseavhengig respons i motsetning til kultur gjenstander. Utfør vev seksjonering raskt (~ 30 - 40 min), godt innenfor eventuelle skadevirkninger av kald iskemisk tid (~ 2 - 4 timer) 18. Utfør behandling av seksjoner bare etter en 1 hr akklimatiseringsperiode.
  3. Etter 1 time akklimatiseringsperiode, legger økende doser (terapeutisk relevant;
  4. Etter behandling, fjerne alle seksjonene under sterile forhold og formalin-fix ved å plassere vev delen i et rør som inneholder enten 10% bufret formalin og sted RT O / N eller i et rør som inneholder 4% paraformaldehyde (fortynne 16% paraformaldehyde fra et hetteglass med PBS til en sluttkonsentrasjon på 4%) og sted ved RT i 2 timer.
    1. Løs større vevssnitt (f.eks., ~ 6 mm x 4 mm) 200 mikrometer tykt i 10% bufret formalin O / N ved RT. Løs mindre seksjoner (f.eks., 1 mm x 1 mm) 200 mikrometer tykt i 4% paraformaldehyd i 2 timer ved RT.
      MERK: For effektiv penetrering av fiksativ volumet av fixative bør 20x volum av vev. Gitt at denne protokollen resulterer i ekstremt små vev størrelser (f.eks 6 mm tre vev = 6 ul volum), for sikring av riktig fiksering bruk 1 ml av fiksativ for alle vev størrelser.
    2. Etter fiksering har vevsprøver parafininnebygd av patologi personell. Seksjon prøven parafinblokker på ladede lysbilder å være hematoxylin og eosin farget og vurderes immunohistochemically (f.eks, apoptose).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For denne studien ble den ex vivo teknikk som brukes i en samsvarende analyse av terapeutisk sensitivitet / motstand av et varmesjokkprotein 90 inhibitor (Hsp90i). I en preklinisk vurdering av denne Hsp90i, brystkreft primærtumor, en ER + invasiv duktalt karsinom (IDC), og tilhørende lymfeknute metastaser ble analysert ex vivo for behandlingsrespons   (Figur 1). Multiple 200 mikrometer seriesnitt ble behandlet med kjøretøy bare og økende doser (0,25, 0,50, 1,0 og 2,5 uM) av Hsp90i. Dataene i figur 1 representerer formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) og Hematoxylin og eosin (H & E) farget seksjoner etter en 48 timers behandlingsperioden. Kontrollen (kjøretøy only) behandlet delen viser levedyktige IDC reir mens 2,5 mikrometer behandlet vev delen resulterte i en 40% induksjon av apoptose som sett av kjernefysiske morfologiske endringer (dvs. pyknotic kjerner / APOPtotic rusk) (figur 1A). Apoptose ble ytterligere bekreftet i den primære svulsten ved terminal deoksynukleotidyl transferase dUTP Nick endemerking (TUNEL) analyse (data ikke vist). IC50 beregnes fra responsdata ved grafisk fremstilling av prosent apoptose versus konsentrasjon av medikamentet. Betydelig, anstand, spiller HSP90 en sentral rolle i protein stabilisering og homeostase av signalbaner av både normale celler og kreftceller 10. Evnen til å målrette HSP90 i kreft er avhengig av det funn at ondartede celler sterkt avhenge chaperoning funksjon av HSP90, særlig i et forsøk på å overvinne stressede tilstander av ugjestmilde miljøer som oppstår under metastatisk progresjon. I hovedsak kreftceller blir svært avhengig av HSP90 funksjon som resulterer i en målrettbar selektiv pool av 'onkogene' HSP90 11. I innsatsen, figur 1A, ved benign lobule med tilhørende acini og duct forblir uforandret in samme 2,5 mikrometer Hsp90i behandlet delen. Så vidt vi vet er dette første gang denne HSP90 kreft-spesifisitet er visuelt fanget i Hsp90i respons-vurdering av primære svulster og tilknyttede metastaser. Dette funn av uendrede godartede / normal celler som sett i tilstøtende benigne lobules av IDC (figur 1A), så vel som skip innenfor den omgivende godartet bryst parenchyma av primærtumor og tilhørende lymfeknutemetastaser (data ikke vist) har blitt rekapitulert i flere forskjellige tumortyper (for eksempel bryst, mage og lymfom metastaser).

En medfølgende lymfeknutemetastasering av denne primære tumor viste en fullstendig respons bare i IDC reir som ble løst forbundet (Figur 1b). IDC reir som dannet stramme sfæroider, derimot, forble levedyktig som bekreftes av TUNEL (figur 1C). Andre analyse av levedyktige IDC sfæroider ved immunfluorescens avslørten vedvarende eller re-ekspresjon av celle-celle adhesjonsmolekyl, E-cadherin (figur 1C). Dette funnet er i tråd med vedvarende, over-uttrykk for E-cadherin legge til metastatisk potensial eller metastaserende effektivitet som gjenspeiles i den svært ondartet, dødelig inflammatorisk brystkreft 12, 13. Selv interessant, er dette funnet utenfor omfanget av denne artikkelen. Det er imidlertid viktig å merke seg at disse lymfeknute (LN) IDC sfæroider ble opprettholdt i kultur i et tidsrom på 2 uker og dermed gir tilslutning til styrken ved hjelp av ex vivo-metode for å studere både sensitivitet / motstanden i preklinisk utvikling av legemidler.

Den ex vivo teknikken har også vært ansatt i en klinisk studie på kjerne nål biopsier (CNBs) for bevis for målet hemming i svulster 16,17. Pasienter som samtykke, har en pre-behandling kjerne nål biopsi (CNB) prosedyren utføres (figur 2). Sammenligntil preklinisk evaluering av primære tumorer, er ex vivo teknikk som brukes for å bestemme sensitiviteten eller responsen i CNB av tilgjengelig metastaser. Multiple 200 mikrometer seriesnitt av CNB ble behandlet med kjøretøyet og er økende doser (0,25, 0,50, 1,0 og 2,5 uM) av Hsp90i. Antallet Hsp90i doser brukt i ex vivo vurdering er diktert av størrelsen av CNB. Imidlertid er forpliktet til å bruke hele spekteret av doser foreslåtte ovenfor. I likhet med preklinisk ex vivo vurdering kan responsen bli evaluert og senere sammenlignet med faktisk i pasientens respons (dvs. korrelative analyser, figur 2) som bestemmes av post-behandling CNB farmakokinetiske (PK), dvs. narkotika oppbevaring målt via væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyser samt i pasient PET imaging (figur 2) 16,17. Til dags dato, analyser med ex vivo teknikk i denne cKLINISKE OPPLYSNINGER Studien er gjennomført på flere krefttyper (for eksempel bryst, marginal sone lymfom, mantelcelllymfom metastatisk paragangliom, livmorhals og eggstokkreft) 16, 17. Full correlative analyse gjennomføre ex vivo teknikken ytterligere eksemplifiserer nytten av denne teknikken i klinisk narkotika utvikling.

Figur 1
Figur 1. Ex vivo-responsanalyse av en ER + brystkreft. (A, Venstre panel) viser levedyktige reder av invasive ductal carcinoma (IDC) (Hematoxylin og eosin farget; skala bar 100 mikrometer). Ved behandling (A, høyre panel) med 2,5 uM i Hsp90i det er en induksjon av ~ 40% apoptotiske respons (pyknotic kjerner / apoptotisk rusk; piler) (Hematoxylin og eosin farget; skala bar 100 pm). Godartede lobules g> (A, innsats) forbli uendret etter behandling (Hematoxylin og eosin farget; skala bar 200 mikrometer). Styringen av en tilhørende lymfeknute (LN) (B, venstre panel) viser en liten grad av apoptose (Hematoxylin og eosin farget; skala bar 100 pm), mens den behandlede delen (B, høyre panel) viser et område av metastatisk IDC reir med komplett respons (Hematoxylin og eosin farget; skala bar, klokken 2 mm, 300 mikrometer, 200 mikrometer og 200 mikrometer). Men trange IDC sfæroider (Spheroids; Sp) fra den samme delen (C, venstre panel) viser liten, om noen, apoptose som vist ved TUNEL analyse gjenværende levedyktig med en samtidig (skala bar 200 mikrometer) (C, høyre panel) over ekspresjon av E-cadherin (forstørrelse 100X).> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk av gjennomføring av ex vivo teknikk i en klinisk studie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kreft biologer står overfor betydelige utfordringer når du forsøker å utvikle effektive terapeutiske strategier. Testing narkotika i utvikling på etablerte kreftcellelinjer kan ikke nøyaktig reflektere in vivo respons og in vivo eksperimenter på PDX modeller er arbeidskrevende og svært kostbart. Gitt de ovennevnte, tumorer ved anvendelse av ex vivo teknikker for primær pasienten 14, 15 er nå plassert ved siden av den molekylære analyser av etablerte cancercellelinjer og pasient-avledet xenografter (PDX).

Dette papiret foregår ved anvendelse av ex vivo teknikk til en ny høyde på at teknikken informerer trofast på respons (IC50), off-target effekter og tillater molekylær analyse av motstand og tilbakekoblingsmekanismer. Når respons data er korrelert til svulsten molekylær profil (dvs. protein uttrykk av tumor biomarkører, mutasjoner) den correlative studien (respons vs svulst molecular profil) kan brukes til å velge pasienter mer sannsynlig å svare på et bestemt legemiddel, i et forsøk på å bedre pasientens utfall. Viktigst i klinisk legemiddelutvikling (ie., Valgfrie biopsier), ex vivo respons forbehandling CNB kan være korrelert til (og validert) i pasientens respons (dvs. etter behandling CNB) og narkotika oppbevaring (farmakokinetiske (PK) evaluering) 16,17. Bruken av den ex vivo teknikk i denne kliniske studien var i stand til å bestemme tumorrespons, så vel som bekrefter spesifisiteten target (dvs, PD; Hsp70-induksjon) og informere om dosering og planlegging 16,17.

Den ex vivo teknikken er mottagelig for de fleste solide tumortyper samt blodbårne kreftmetastaser (for eksempel lymfeknutemetastaser av lymfom) med små justeringer i protokollen for visse krefttyper som presenterer mindre utfordringer. For eksempel svulster i bukspyttkjertelen har en tendens til å ha en høy sTroma for kreftcellenes ratio, noe som kan resultere i seksjoner som har dårlig kreftcelle representasjon. Anskaffelse av kreftcelle rike områder av svulsten kan ikke gjøres på brutto analyse. Derfor for å overvinne dette potensielle brist flere mindre kubiske områder fra tumor prøven kan være innebygd (4 / agarose-innebygging mold) og seksjonert samtidig øke sannsynligheten for en tumorcelle-rike ex vivo-delen.

Våre data sterkt støtte bruk av ex vivo teknikk i preklinisk narkotika utvikling (Figur 1). Sammen med respons (IC50), gjenskape deler kan analyseres for alternative levedyktighet analyser, metabolomics, kombinatoriske terapeutiske strategier, effekt legemiddeleksponering har på utskilling av faktorer (f.eks cytokiner, exosomes), motstand og tilbakekoblingsmekanismer og viktigere, informere på off-target effekter (dvs. normale og godartede celler). I denne studien som brukte en Hsp90i, målrette specificity og identifisering av "off-target effekter" er nøkkelen basert på premisset om at det er en særegen pool av 'onkogene HSP90' bare funnet i kreftceller på malign transformasjon 10. Dette fremkommer i resultatene delen (sett inn, figur 1A) der godartede lobules av en ex vivo Hsp90i behandlet delen forble uendret. Av like stor betydning, som finnes i en annen del av samme primære tumor reflektert i figur 1, en ​​10 uM (irrelevant terapeutisk dose) ble behandlet seksjon viste fullstendig reaksjon av IDC reir mens forbundet duktalt karsinom in situ (DCIS) forble uforandret (data ikke vist) . Framtidige undersøkelser i denne linjen av forskning er utenfor omfanget av denne artikkelen. Opplyser imidlertid denne spesielle funn om tilstanden i 'ondartet transformasjon "eller sykdomsprogresjon av forbundet DCIS i IDC prøver, med hensyn til den onkogeneHSP90 chaperoning fungerer og støtter nytten av å bruke ex vivo teknikk i legemiddelutvikling.

En ekstra anvendelse av ex vivo teknikken er bruk i pre-effekt analyse i tumor xenograft modeller (ie., Ex vivo seksjonering av PDX) i utvikling av legemidler for å bestemme den farmakokinetiske / farmakodynamiske (PK / PD) data før du utfører involvert, kostbare in vivo studier - noe som åpner for en mer informert, kostnadseffektiv in vivo legemidlets effekt studien.

De viktigste trinnene og potensielle begrensende faktorer av ex vivo teknikken er innkjøp og snitting. Anskaffelse av tumorprøve (dvs.. Primær tumor / metastase) må utføres expeditiously med hensyn til å identifisere et område av tumor med den høyeste grad av levedyktighet. Store svulster tendens til å ha nekrotiske sentrale områder som ikke er grovt synlig. Derfor anskaffe vev fra den ytterste kanten øker sannsynligheten for å få et levedyktig prøven. Med hensyn til snitting, samle presisjons skiver med ønsket tykkelse (f.eks., 200 mikrometer) er sterkt påvirket av tumor tetthet / fasthet (unntatt CNBs grunn av ekstremt liten størrelse). For eksempel er invasive ductal carcinoma vanligvis mye tettere i motsetning til invasiv lobular karsinom. Tett svulstvev gir passende motstand - i fravær av permanent embedding medier - til bladet, mens mindre tett svulstvev ikke. Eksempler på mindre tette tumorvev typer inkluderer, men er ikke begrenset til invasiv lobær karsinom, mucinøst karsinomer og gastrisk tumortyper. For å overvinne dette potensialet begrensning, er feilsøking med passende bladhastighet og frekvens nødvendig. Konsekvent presisjon-skiver delen tykkelse, gjennom seksjonering prosessen, er avgjørende for nøyaktig vurdering av narkotika respons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Ambrose, E. J. Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture. Experimental Cell Research. 15, (58), 332-345 (1958).
  2. Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat. New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).
  3. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  4. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors. Cell Cycle. 11, (14), 2756-2761 (2012).
  5. Bray, K., et al. Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer. Molecular Cancer Research. 7, (9), 1487-1496 (2009).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  7. Nakasone, E. S., et al. Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).
  8. Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia. PNAS. 111, (8), 3092-3097 (2014).
  9. Vidal, S. J., et al. Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples. J. Vis. Exp. (85), e51332 (2014).
  10. Wanping, X., Neckers, L. Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).
  11. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90. Nature Chemical Biology. 7, (11), 818-826 (1038).
  12. Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer. American Journal of Pathology. 161, (2), 619-628 (2002).
  13. Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism. Oncotarget. 4, (3), 446-462 (2013).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).
  16. Jhaveri, K., et al. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).
  17. Gerecitano, J. F., et al. Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71. Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).
  18. Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).
<em>Ex Vivo</em> Treatment Response av primære svulster og / eller Associated metastaser for preklinisk og klinisk utvikling av legemiddel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter