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Medicine

Ex Vivo resposta ao tratamento de tumores primários e / ou Associated Metástases para pré-clínica e clínica de Desenvolvimento Therapeutics

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Linhas celulares de cancro estabelecidos e xenotransplantes têm sido o esteio da pesquisa do câncer para as últimas décadas. No entanto, evidências recentes sugerem que a resposta terapêutica é muito influenciada pelo microambiente de células tumorais. Portanto, foi desenvolvida uma análise ex vivo de amostras de tumor primário para fins de desenvolvimento de drogas.

Introduction

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O desenvolvimento de cancro terapêutica eficazes provou ser extremamente desafiador. Linhas de câncer de células tumorais e explantes - bem como enxertos foram usados ​​em pesquisa sobre o câncer há mais de meio século 1,2,3. Até à data, a análise molecular de sensibilidade à droga e resistência em ambas as linhas celulares de cancro e xenoenxertos estabelecidas derivadas de pacientes (PDX) é indispensável. No entanto, o teste de compostos em linhas celulares de cancro estabelecidas muitas vezes não é de previsão de eficácia in vivo, e estudos in vivo correspondente em animais, especialmente em modelos de PDX, é muito cara e demorada. As limitações destes sistemas modelo, ou seja, a incapacidade para informar sobre a influência do microambiente nativo em progressão do tumor e a resposta de estratégias terapêuticas, levou o campo de investigação para o desenvolvimento de métodos adicionais para complementar estas análises. De recente, maior atenção está sendo pago para ex vivo de análise de tum pacienteou explantes 4, 5, devido à maior compreensão de que a resposta terapêutica do câncer não é exclusivo para a composição molecular inerente das células cancerosas mas é muito influenciada pelo microambiente celular tumor 6, 7 um recurso que não pode ser reproduzido por meio de métodos e de cultivo tradicionais / ou PDX. análise ex vivo, no contexto acima (ie., influência do microambiente adjacente célula tumoral circundante) implica a avaliação de seções tumor / metástase de primário viáveis, ao invés de ex vivo de análise de isolados celulares 8, 9.

Registramos aqui uma técnica ex vivo (ie., Seções cortado com precisão frescas de tecidos) de ambos os tumores primários de pacientes e metástases associadas (ou seja, os gânglios linfáticos), que informa fielmente na resposta (IC50), efeitos fora do alvo e permite molecular análise dos mecanismos de resistência e de feedback. Além disso, uma análise correlativa de therapeUTIC sensibilidade / resistência contra biomarcador e perfil de expressão do gene pode ser realizada em um esforço para identificar os pacientes com maior probabilidade de responder à droga experimental de interesse (ou seja., resposta de droga elevada corresponde paciente com particular perfil biológico). Aplicação da técnica ex vivo e avaliação de uma forma multi-parâmetro é movimento para a seleção dos pacientes e melhoria global dos resultados clínicos.

Análise ex vivo da resposta ao tratamento pode se tornar uma ferramenta padrão no desenvolvimento pré-clínico e clínico da terapêutica do câncer e é visto como um passo em direção a uma abordagem da medicina personalizada em estratégias de desenvolvimento de terapias.

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Protocol

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NOTA: colheita de tecidos do paciente, autorizado por conselho de revisão institucional (IRB) -aprovado Biospecimen e Protocolos Clínicos (números de protocolo 09-121 e 11-041, respectivamente) no Memorial Sloan Kettering Cancer Center.

Procurement 1 Tissue

  1. Aquisição de paciente primário tumor / metástase
    NOTA: Até à data, este protocolo foi realizado em pancreáticos, gástricos e tipos de tumor da mama removidos cirurgicamente, bem como, as metástases de linfoma.
    1. Direcionar a equipe cirúrgica para entregar a amostra por correio ou sistema de tubos pneumáticos para o departamento de Patologia em hermeticamente fechado e estéril saco plástico espécime à prova de vazamentos dentro de recipiente à prova de derrame estéril. Direcionar a equipe cirúrgica para transportar a amostra no estado fresco, sem formol ou fixador.
    2. Dirigir o patologista ou patologista assistente para colher a amostra frescos utilizando uma técnica estéril, que inclui uso de luvas e instrumentos esterilizados sob uma capela de fluxo laminar.
    3. Anote o tempo de colheita das amostras adquiridas, que é mantido rigorosamente menos de 30 min a partir da conclusão do procedimento cirúrgico. Levando-se em conta os efeitos de isquemia fria, não tome amostras de espécimes ressecados, com um tempo de isquemia fria de> 30 min 18.
    4. Dirigir o pessoal do Departamento de Patologia para remover uma amostra do tumor primário de aproximadamente 0,5 cm3 a 1,0 cm 3 de uma câmara de fluxo laminar, para manter um ambiente estéril. Quando possível, escolher o tecido do tumor a partir da periferia da lesão, para evitar potenciais índice de necrose central (morte celular) franca.
      NOTA: O tecido necrótico pode ser grosseiramente reconhecível por qualquer um dos seguintes critérios: a perda de cor ou palidez do tecido; perda de força em que o tecido necrosado é macio e friável; uma demarcação clara entre o tecido necrosado e viável.
    5. Dirigir o pathologiST ou assistente patologista para fornecer tecido periférico que é em excesso (descarte cirúrgico), após a recolha imediata do tumor para avaliação diagnóstica. Colocar a amostra num tubo de centrífuga cónico de 15 ml estéril contendo cerca de 5 ml de meio essencial mínimo (MEM) contendo 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina).
    6. Se estiver disponível (por exemplo, linfonodo axilar de cauda de espécime mastectomia), adquirir um grosseiramente positivos espécime gânglio linfático do mesmo tamanho (0,5 cm 3 a 1,0 cm 3) e comparar a resposta à droga do tumor primário. Como as amostras de tumor primário, colocar as amostras de nódulos linfáticos associados em um tubo de centrífuga cónico de 15 ml estéril contendo cerca de 5 ml de meio essencial mínimo (MEM) contendo 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina).
    7. Se o tamanho de licenças peça cirúrgica (por exemplo, espécime mastectomia), remova (distante do tumor primário) de uma amostra de tecido normal (ou seja,fibrosa parênquima normal densa / peito) e colocar em um tubo de centrífuga cônico de 15 ml estéril contendo aproximadamente 5 ml de meio essencial mínimo (MEM) contendo 1% de antibióticos apenas para fins de transferência. Após a transferência para as instalações de laboratório, transferir a amostra 'normal' para um, congelar e armazenar cryovial 'estalo' em um freezer -80 ° C para análises moleculares futuras.
    8. Coloque todas as amostras em gelo molhado e transportar imediatamente para o espaço de laboratório para ex vivo de corte de tecido fresco. Não secção do espécime normal, mas sim armazenar em um freezer -80 ° C para análises moleculares futuras. Transfira uma porção do tumor primário e de metástases associadas a um, congelar e armazenar criotubo "pressão" de uma temperatura de -80 ° C congelador para futuras análises moleculares.
  2. Aquisição de tecido a partir de estudos clínicos (por exemplo, biópsias com agulha grossa opcional (CNB))
    ATENÇÃO: Nós obter tecidos tumorais de pacientesmatriculados em protocolos clínicos que dão o seu consentimento se submeter a uma CNB de uma metástase de tumor acessíveis antes do início da terapia. CNBS, até à data, têm sido realizados em pacientes com câncer de mama, linfoma da zona marginal, linfoma de células do manto, paraganglioma metastático, colo do útero (de células escamosas) e ovário.
    1. Ter pessoal clínico de Radiologia Intervencionista ou departamento competente realizar uma biópsia com agulha pré-tratamento e colocar a amostra em um tubo de centrífuga de 15 ml cônico estéril contendo aproximadamente 5 ml de meio essencial mínimo (MEM) contendo 1% de antibióticos (penicilina e estreptomicina).
    2. Coloque a amostra de biópsia no gelo molhado e transportar imediatamente para o espaço de laboratório para ex vivo de corte de tecido fresco.

2 Preparação de materiais para corte e Vibratome Configurações

  1. Elaboração de Materiais para Seccionamento
    1. Adicione uma solução de agarose a 4% por adição de 4 g de agasubiu para 100 ml de PBS. Autoclave (configurações de ciclo: Líquido, 121 ° C, 30 min, 15 libras por polegada quadrada), a solução antes do primeiro uso. Para utilizações seguintes, coloque a agarose 4% em um micro-ondas para liquefazer (fogo alto por intervalos de 30 segundos) antes de cada utilização e resfriar adequadamente para ~ 25 ° C (ou seja, quente ao toque) consciente de que agarose solidifica à temperatura ambiente.
    2. Use a agarose 4% como uma mídia tecido incorporação não permanente. Quando a agarose 4% esfriou o suficiente e ainda está em estado líquido, com uma pinça estéril, colocar as amostras de tecido em um molde de incorporação e despeje a agarose 4%.
    3. Posicione a amostra de tecido estreitas (~ mm distância 2), mas não diretamente na parede superfície de corte do molde de incorporação. A agarose a 4% começa a solidificar rapidamente, por conseguinte, a posição apropriada do espécime de tecido rápida. Durante o corte, manter a agarose 4% em um banho de água a 55 ° C para se manter em solução.
    4. Para uma placa de 24 poços para análise secção, adicionar 1 ml de of meio completo (ou seja, de MEM + 10% de soro fetal de bovino 1% + antibióticos) a cada poço. Manter a placa de 24 cavidades à temperatura ambiente (~ 25 ° C) durante toda a duração do seccionamento.
  2. Preparação de Configurações Vibratome
    1. Usando o micrótomo vibratório, definir a velocidade a que a lâmina se aproxima da amostra [0 (0,00 mm / seg) a 10 (2,5 mm / seg)] e a frequência da lâmina [0 (0 Hz) a 10 (100 Hz) ]. Ajuste as configurações de acordo com a textura do tecido (ou seja, a densidade / firmeza).
    2. Para um tumor de mama primário de carcinoma ductal invasivo, ajuste as configurações de 6 e 3, velocidade e freqüência, respectivamente. Para o tecido do tumor menos denso / firme, diminuir a velocidade e aumentar a frequência em conformidade.
    3. Defina a espessura de corte dentro dos limites do instrumento (1-999 mm). Para estas análises, definir a espessura de corte de 200 m.
    4. Montar o espécime embebidas em agarose utilizando uma fina camada de cola líquida sobre o disco de amostra that está submerso em um reservatório de mídia que é envolto em gelo molhado.

3. Tissue Seccionamento, Tratamento e Análise

  1. Remova os cortes cortado com precisão imediatamente após corte usando uma pinça estéril e coloque em um prato multi-bem com 1 ml de meio completo. Quando as secções são adquiridos suficientes para resposta e análises de correlação, colocar a placa de multi-poços de resposta ao tratamento em uma incubadora de cultura de tecido fixado em condições de cultura de tecidos padrão.
  2. Tire várias secções de controlo que bookend as secções tratadas em um esforço para confirmar a resposta dependente da dose, em oposição aos artefactos cultivadas. Realizar tecido seccionamento rapidamente (~ 30 - 40 min), bem dentro de quaisquer efeitos prejudiciais de tempo de isquemia fria (~ 2-4 hr) 18. Realizar o tratamento de secções só depois de um período de aclimatação de 1 hora.
  3. Após o período de aclimatação de 1 hora, adicionar (doses terapeuticamente relevante aumentando;
  4. Após o tratamento, remover todas as secções em condições estéreis e formalina-fix, colocando a secção de tecido em um tubo contendo quer 10% de formalina tamponada e lugar à TA S / N ou em um tubo contendo paraformaldeído a 4% (16% de paraformaldeído diluir a partir de um frasco com PBS para uma concentração final de 4%) e lugar à temperatura ambiente durante 2 horas.
    1. Fixar as secções de tecido maiores (por exemplo,., ~ De 6 mm x 4 mm) de 200 um de espessura em 10% de formalina tamponada O / N à temperatura ambiente. Fix secções menores (por exemplo,. 1 mm x 1 mm) de 200 um de espessura, em 4% de paraformaldeído durante duas horas à temperatura ambiente.
      NOTA: Para a penetração eficiente de fixador o volume de fixative deve ser 20x o volume do tecido. Dado que este protocolo resulta em tamanhos extremamente pequenos de tecido (por exemplo, de 6 mm de tecido 3 = 6 ul de volume), para garantia de utilização adequada fixação 1 ml de fixador para todos os tamanhos de tecido.
    2. Após a fixação ter as amostras de tecido embebidas em parafina pelo pessoal do Departamento de Patologia. Seção espécime blocos de parafina em lâminas carregadas ser hematoxilina e eosina e avaliadas por imunohistoquímica (por exemplo, apoptose).

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Representative Results

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Para este estudo, a técnica ex vivo foi utilizado na análise de um correlativo de terapêutica sensibilidade / resistência de um inibidor da proteína de choque térmico 90 (Hsp90i). Em uma avaliação pré-clínica deste Hsp90i, o tumor primário de câncer de mama, um ER + ductal carcinoma invasivo (IDC), e associado metástases em linfonodos foram analisados ​​ex vivo para a resposta ao tratamento   (Figura 1). Vários 200 mM cortes seriados foram tratados apenas com veículo e crescentes doses (0,25, 0,50, 1,0 e 2,5 mM) do Hsp90i. Os dados da Figura 1 representa, cortes incluídos em parafina (FFPE) e hematoxilina e eosina (H & E) corado após um período de tratamento de 48 horas-fixado em formalina. O controle (veículo só) seção tratado mostra ninhos IDC viáveis ​​ao passo que a secção de tecido de 2,5 mM tratado resultou em uma indução de 40% de apoptose, como visto por alterações morfológicas nucleares (ie, picnótica núcleos / APOPdetritos totic) (Figura 1A). A apoptose também foi confirmada no tumor primário por desoxinucleotidil-transferase terminal de análise de marcação terminal dUTP nick (TUNEL) (dados não mostrados). IC50 é calculada a partir de dados de resposta representando graficamente a apoptose por cento versus concentração da droga. Significativamente, a chaperona, Hsp90 desempenha um papel fundamental na estabilização de proteínas e a homeostase de vias de sinalização crítica de ambas as células normais e cancerosas 10. A capacidade de direcionar Hsp90 no câncer se baseia na constatação de que as células malignas dependem fortemente da função chaperoning de Hsp90, especialmente em um esforço para superar estados estressados ​​de ambientes inóspitos encontrados durante a progressão metastática. Em essência, as células cancerosas se tornam altamente dependente da função de Hsp90 resultando em uma associação selectiva targetable de 'oncogénica' Hsp90 11. Na inserção, Figura 1A, lóbulo benigno adjacente com ácinos e dutos associados permanece inalterado in o mesmo 2,5 uM secção tratada com Hsp90i. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira vez que esse tipo de câncer especificidade Hsp90 é visualmente capturado em Hsp90i resposta-avaliação de tumores primários e metástases associados. Esta constatação de células intactas benignas / normais como visto em lóbulos benignas adjacentes de IDC (Figura 1A), bem como dentro de vasos do parênquima benigna da mama circundante do tumor primário e as metástases dos nódulos linfáticos associados (dados não mostrados), foi recapitulado em vários diferentes tipos de tumor (por exemplo, da mama, gástrico e de metástases linfoma).

Um metástases em linfonodos acompanhamento deste tumor primário apresentaram uma resposta completa só nos ninhos IDC que foram livremente associados (Figura 1B). Ninhos IDC que formaram esferóides apertados, no entanto, manteve-se viável como confirmado por TUNEL (Figura 1C). Análises adicionais dos esferóides IDC viáveis ​​por imunofluorescência reveladasum re-expressão persistente ou da molécula de adesão célula-célula, a E-caderina (Figura 1C). Este resultado é consistente com a persistência, a sobre-expressão da caderina-E somando-se a eficiência potencial metastático ou metastático que se reflete na altamente maligno, letal de câncer de mama inflamatório 12, 13. Apesar de interessante, este resultado está além do escopo deste artigo. No entanto, é importante notar que esses esferóides de nódulos linfáticos (LN) de CDI foram mantidas em cultura por um período de 2 semanas e, assim, confere credibilidade à força de usar a técnica ex vivo para estudar a sensibilidade / resistência em desenvolvimento pré-clínico de drogas.

A técnica ex vivo também tem sido empregada em um estudo clínico em biópsias com agulha grossa (CNBS) para evidência de inibição alvo em tumores 16,17. Pacientes que consentimento, têm um procedimento de pré-tratamento por biópsia por agulha (CNB) (Figura 2) realizadas. Comparávelpara a avaliação pré-clínica de tumores primários, a técnica ex vivo é utilizada para determinar a sensibilidade ou resposta do CNB de metástases acessíveis. Várias secções de 200 um em série do CNB foram tratados apenas com doses crescentes e (0,25, 0,50, 1,0 e 2,5 ^ M) do Hsp90i veículo. O número de doses Hsp90i utilizados na avaliação ex vivo é ditada pelo tamanho do CNB. No entanto, todo o esforço é feito para usar o espectro de doses sugeridas anteriormente. Como o pré-clínico de avaliação ex vivo, a resposta pode ser avaliada e, posteriormente, em comparação com a efectiva na resposta do paciente (isto é, as análises de correlação; Figura 2), conforme determinado pelo pós-tratamento CNB farmacocinético (PK), ou seja, a retenção de fármaco tal como medido por meio de cromatografia líquida espectrometria de massa tandem (LC-MS / MS), bem como as análises de imagem PET paciente (Figura 2) 16,17. Até à data, as análises usando a técnica ex vivo neste cestudo linical tem sido realizada em vários tipos de tumores (por exemplo, mama, linfoma marginal zona, linfoma de células do manto, paraganglioma metastático, colo do útero e ovário) 16, 17. análise correlativa completa implementação da técnica ex vivo mais exemplifica a utilidade desta técnica em o desenvolvimento clínico de drogas.

Figura 1
Figura 1 Análise ex vivo de resposta de um ER + câncer de mama. (A, painel esquerdo) mostra ninhos viáveis ​​de carcinoma ductal invasivo (IDC) (Hematoxilina e Eosina; barra de escala de 100 mm). Após o tratamento (A, painel da direita) com 2,5 uM de Hsp90i há uma indução de ~ 40% de resposta apoptótica (núcleos picnóticos / detritos apoptótica; setas) (Hematoxilina e Eosina; barra de escala de 100 um). Lóbulos benignos g> (A, insert) permanecem inalterados após o tratamento (HE manchado; barra de escala de 200 mm). O controlo de um nó associado a linfa (LN) (B, painel esquerdo) mostra um pequeno nível de apoptose (Hematoxilina e Eosina; barra de escala de 100 mm), enquanto que a secção de tratamento (B, painéis direitos) mostrar uma área de metastático IDC ninhos com resposta completa (hematoxilina e eosina; barra de escala, no sentido horário 2 mm, 300 um, 200 mM e 200 mm). No entanto, apertados esferóides IDC (esferóides; Sp) a partir do mesmo ponto (C, painel esquerdo) mostram pouca, se alguma, a apoptose, como demonstrado por análise de TUNEL permanecer viável com uma concomitante (barra de escala de 200 um) (C, painel da direita) ao longo -expression de E-caderina (aumento de 100X).> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 Esquema de implementação do ex vivo técnica em um estudo clínico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Biólogos câncer enfrentam desafios significativos ao tentar desenvolver estratégias terapêuticas eficazes. Testar medicamentos em desenvolvimento em linhas celulares de cancro estabelecidas não pode refletir com precisão em resposta vivo e in vivo em modelos PDX são trabalhoso e muito caro. Dado o acima, a aplicação de técnicas ex vivo de tumores primários do paciente 14, 15 está agora posicionada ao lado da análise molecular das linhas celulares de cancro e xenoenxertos estabelecidas derivadas de pacientes (PDX).

Este documento tem a aplicação da técnica ex vivo a uma nova altura em que a técnica informa fielmente em resposta (IC50), os efeitos fora do alvo e permite a análise molecular da resistência e mecanismos de feedback. Quando os dados de resposta está correlacionada com o perfil molecular do tumor (isto é, a expressão da proteína de biomarcadores tumorais, mutações) o estudo de correlação (resposta versus tumor molperfil ecular) pode ser utilizado para seleccionar os pacientes têm mais probabilidade de responder a um determinado medicamento, num esforço para melhorar os resultados do paciente. Mais significativamente, para o desenvolvimento clínico de drogas (isto é, as biópsias. Opcionais), ex vivo, a resposta de pré-tratamento pode ser correlacionada CNB (e validado) na resposta do paciente (isto é, pós-tratamento CNB) e retenção de droga (farmacocinético (PK) de avaliação) 16,17. A utilização da técnica ex vivo deste estudo clínico foi capaz de determinar a resposta do tumor, bem como confirmam a especificidade alvo (ou seja, PD; indução Hsp70) e informar sobre dosagem e agendando 16,17.

A técnica ex vivo é favorável à maioria dos tipos de tumores sólidos, bem como metástases do câncer transmitidas pelo sangue (por exemplo, metástases linfáticas de linfoma), com pequenos ajustes no protocolo para certos tipos de tumores que apresentam menores desafios. Por exemplo, os tumores do pâncreas tendem a ter um elevado stroma a proporção de células de tumor, o que pode resultar em secções que têm representação de células de cancro pobre. Aquisição de células de câncer ricas áreas do tumor não pode ser feita mediante análise bruta. Por conseguinte, para ultrapassar esta desvantagem potencial de várias áreas cúbicos menores de amostra de tumor pode ser incorporado (4 / incorporação de agarose-molde) e seccionados simultaneamente aumentar a probabilidade de um ex vivo secção rico em células de tumor.

Os nossos dados apoiam fortemente a utilização da técnica ex vivo em desenvolvimento pré-clínico de drogas (figura 1). Junto com a resposta (IC50), replicar seções podem ser analisadas em ensaios de alternativas de viabilidade, metabolômica, estratégias terapêuticas combinatória, exposição à droga tem efeito sobre os fatores secretados (por exemplo, citocinas, exossomos), mecanismos de resistência e de feedback e importante, informar sobre off-alvo efeitos (isto é, normais e células benignas). Neste estudo em particular que usou um Hsp90i, alvo specificidade e identificação dos "efeitos off-alvo" é chave baseada na premissa de que existe uma piscina distintivo de "Hsp90 oncogênico 'só encontrada em células de câncer sobre a transformação maligna 10. Isto é apresentado na seção de resultados (insert, Figura 1A), onde lóbulos benignos uma seção tratados com Hsp90i ex vivo permaneceu inalterado. De igual importância, encontrado em outra seção do mesmo tumor primário refletiu na Figura 1, a 10 mM (dose terapeuticamente irrelevante) seção tratados apresentaram resposta completa de ninhos IDC enquanto carcinoma ductal associada in situ (CDIS) permaneceu inalterada (dados não mostrados) . Futuras investigações nesta linha de pesquisa estão fora do escopo deste artigo. No entanto, este resultado em particular informa sobre o estado de "transformação maligna 'ou a progressão da doença de carcinoma ductal in situ em amostras de IDC associado, no que diz respeito à oncogénicaHsp90 chaperoning funcionamento e suporta a utilidade da utilização da técnica ex vivo no desenvolvimento de medicamentos.

Uma aplicação adicional da técnica ex vivo é o uso em análise de pré-eficácia em modelos de xenotransplante tumoral (ie., Ex vivo de corte de PDX) no desenvolvimento de medicamentos para determinar a farmacocinética / farmacodinâmica (PK / PD) de dados, antes de realizar envolvidos, caro estudos in vivo - permitindo uma mais informada, estudo in vivo a eficácia dos medicamentos de baixo custo.

Os principais passos e possíveis fatores limitantes da técnica ex vivo são procurement e de corte. Aquisições da amostra de tumor (ou seja., Tumor primário / metástase) deve ser realizada rapidamente com muita atenção para identificar uma área do tumor com o mais alto grau de viabilidade. Tumores grandes tendem a ter áreas centrais de necrose que não são grosseiramente visível. Portanto, a aquisição de tecido from a borda mais externa aumenta a probabilidade de obter uma amostra viáveis. No que diz respeito à secção transversal, e a recolha de precisão fatias com a espessura desejada (por ex., 200 mM) é grandemente influenciada pela densidade do tumor / firmeza (excluindo CNBS devido ao tamanho extremamente pequeno). Por exemplo, o carcinoma ductal invasivo é tipicamente muito mais densa, em contraste com o carcinoma lobular invasivo. Tecido tumoral densa oferece resistência adequada - em ausência de meios de incorporação permanente - para a lâmina, enquanto o tecido tumoral menos densa, não. Exemplos de tipos de tecidos tumorais menos densos incluem mas não se limitam a carcinoma lobular invasivo, carcinoma de mucina e os tipos de tumores gástricos. Para superar essa limitação potencial, é necessário com velocidade lâmina apropriada ea frequência de resolução de problemas. Espessura consistente seção cortado com precisão, todo o processo de corte, é fundamental para a avaliação precisa da resposta à droga.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

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References

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Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

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