Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

İlköğretim Tümörleri ve / veya klinik öncesi için İlişkili Metastazlarının ve Tedavi Klinik Geliştirme Ex Vivo Tedavisi Tepki

doi: 10.3791/52157 Published: October 2, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Kurulmuş kanser hücre hatları ve ksenogratflardır son birkaç yıldır kanser araştırma dayanak noktası olmuştur. Bununla birlikte, son bulgular terapötik tepki özellikle, tümör hücre mikro-ortamı tarafından etkilendiğini göstermektedir. Bu nedenle, ilaç geliştirme amaçları için primer tümör numunelerinin bir ex vivo analiz geliştirdik.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kanser terapötik olarak etkili geliştirilmesi son derece zor olduğu kanıtlanmıştır. Kanser hücre hatları ve tümör eksplant - hem de ksenograftları üzerinde yarım asır 1,2,3 kanser araştırmalarında kullanılmıştır. Bugüne kadar, ilaç hassasiyeti ve mukavemet hem de kurulmuş olan kanser hücre çizgileri ve hasta türetilmiş ksenograftlarının moleküler analizi (PDX) vazgeçilmezdir. Bununla birlikte, sabitlenen kanser hücresi hatlarında bileşiklerin testleri çoğu zaman in vivo etkinliğe işaret eden değildir ve özellikle de PDX modellerinde, hayvanlarda in vivo çalışmalarda da karşılık gelen çok pahalı ve zaman alıcı bir işlemdir. Bu model sistemlerde, tümör ilerlemesi ve tedavi stratejileri yanıt yerli mikroçevresinin etkisi hakkında bilgilendirmek için yani yetersizlik sınırlamalar, bu analizleri iltifat için ek yöntemler geliştirmek araştırma alanını açmıştır. Yakın zamandaki, artan dikkat hasta tum ex vivo analizi doğru ödeniyorKanser terapötik cevap, kanser hücrelerinin temel molekül bileşime özel değildir ama daha çok büyük, geleneksel yöntemler ile kültürleme değinmeyecek edilemez tümör hücresi mikro-6, 7 özelliği etkilenir olmasından dolayı daha iyi anlaşılması için eksplantlar ya da 4, 5 / veya PDX. yukarıdaki bağlamda ex vivo analizi (yani., bitişik çevreleyen tümör hücre mikro-etkisi) daha çok hücre izolatları 8, 9 ex vivo analizine göre, uygun bir primer tümör / metastaz bölme değerlendirilmesini gerektirir.

Biz de hasta primer tümörlerin (hassas dilimlenmiş taze doku bölümleri yani.) Ve ilişkili metastazlar (yani, lenf düğümleri) sadakatle yanıt üzerine bilgilendirir (IC50), hedef dışı etkileri bir ex vivo tekniği burada rapor ve moleküler sağlar direnci ve geri besleme mekanizmalarının analizi. Fototerapi ek olarak, bir analiz bağıntılıbiyomarkör ve gen ekspresyon profilinin karşı utic duyarlılık / direnç (yani., yüksek ilaç tepkisi belirli bir biyolojik profil ile hastayı maçları) ilgi deneysel ilaca cevap daha muhtemel hastaları belirlemek için bir çaba yapılabilir. Bir çok parametre moda ex vivo tekniği ve değerlendirme uygulama hasta seçimi ve klinik sonuçların genel iyileştirilmesine yönelik bir harekettir.

Ex vivo tedavi yanıtı analizi kanser tedavileri klinik öncesi ve klinik geliştirme standart bir araç haline gelebilir ve tedavi kalkınma stratejilerinde kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımına doğru bir adım olarak tasavvur edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: Hasta doku temini kurumsal inceleme kurulu (KİK) ile yetki verildi Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi'nde Biospecimen ve Klinik Protokolleri (Protokolü numaralarını sırasıyla 09-121 ve 11-041) -onaylı.

1. Doku İhale

  1. Hasta primer tümör / metastaz Alımı
    NOT: Bugüne kadar, bu protokol ameliyatla çıkarıldı pankreas, mide ve meme tümör türleri, yanı sıra, lenfoma metastaz üzerinde yapılmıştır.
    1. Steril sıvı dökülmelerine karşı dayanıklı bir kap içinde sıkıca kapatılmış ve steril sızdırmaz plastik numune torbaya Patoloji bölümünde kurye veya pnömatik tüp sistemi ile numune teslim Cerrahi ekibi yönlendirin. Hiçbir formalin veya sabitleştirici ile taze halde numune taşıma Cerrahi ekibi yönlendirin.
    2. Hangi inc, steril tekniği kullanarak taze örnek hasat patolog veya patolog yardımcısı yönlendirinLaminer akış kaputun altında steril eldiven ve araçların idarecisi kullanımı.
    3. Cerrahi prosedürün tamamlanmasından 30 dakika altında titizlikle tutulur tedarik numunenin, hasat zamanını kaydedin. Soğuk iskemi dikkate etkileri de dikkate alınarak,> 30 dakika 18 soğuk iskemi süresi ile rezeke numune yapmayız.
    4. Steril bir ortam sağlamak için, bir laminar akış başlığı içinde 1,0 cm3 yaklaşık 0,5 cm3 primer tümör örnek kaldırmak için, Patoloji Bölümü personelin doğrudan. Mümkün olduğunda, olası Frank santral nekroz (hücre ölümü) önlemek için indeks lezyonun çevresinden tümör dokusu seçin.
      NOT: nekrotik doku aşağıdaki kriterlerden herhangi biri tarafından fena halde tanınabilir olabilir: renk veya doku solukluk kaybı; nekrotik doku yumuşak ve kırılgan olduğu gücü kaybı; nekrotik ve canlı doku arasında belirgin bir sınır.
    5. Pathologi Doğrudanst veya patolog yardımcısı tanısal değerlendirme için tümörün hemen örnekleme sonra aşırı (cerrahi artıklar) ise periferik doku sağlayabilir. Yaklaşık 5 mi,% 1 antibiyotik (penisilin ve streptomisin) ihtiva eden en az temel ortam (MEM) içeren 15 ml'lik steril bir konik santrifüj tüpü içinde örnek yerleştirin.
    6. Mevcut (örneğin, mastektomi numune aksiller kuyruk lenf nodu), aynı boyutta (0.5 cm 3 cm 3 1.0) fena halde pozitif ilişkili lenf nodu örneği temin ve primer tümörün ilaç yanıtı ile karşılaştırırsanız. Primer tümör numunesinde gibi,% 1 antibiyotik (penisilin ve streptomisin) içeren yaklaşık 5 mi minimum temel ortam (MEM) içeren bir 15 ml'lik steril bir konik santrifüj tüpüne lenf düğümü örnek yerleştirin.
    7. Eğer örneğin, cerrahi örnek sağlar (örneğin, mastektomi numune), (primer tümörden uzak) çıkarmak, normal doku örneği (büyüklüğü,yaklaşık 5 ml transferi amaçlıdır% 1 antibiyotik içeren minimum temel ortam (MEM) içeren 15 ml steril konik santrifüj tüpü normal yoğun lifli / meme parankim) ve yer. Laboratuar tesislerine transferi takiben, bir de kriyotüpe, 'ek' donma ve mağaza 'normal' örneği aktarmak -80 ° C derin dondurucuda gelecekteki moleküler analizler için.
    8. Islak buz üzerinde tüm örneklerini yerleştirin ve hemen ex vivo taze doku kesit için laboratuvar uzaya taşıyacak. BÖLÜM Normal numune yapmak değil, gelecekteki moleküler analizler için ° C derin dondurucuda bir -80 saklayın. Gelecekteki moleküler analizler için -80 ° C derin dondurucuda kriyotüpe, 'ek' donma ve mağaza için bir primer tümörün bölümünü ve ilişkili metastaz aktarın.
  2. Klinik çalışmalarda doku İhale (örneğin, opsiyonel iğne biyopsisi (CNB))
    NOT: Biz hastaların tümör dokuları eldeTedavinin başlamasından önce erişilebilir bir tümör metastaz CNB geçmesi onların rıza klinik protokolleri üzerine alındı. CNBs, bugüne kadar meme, marjinal zon lenfoma, mantle hücreli lenfoma, metastatik paragangliomalardır, serviks (skuamöz hücreli) ve yumurtalık kanserleri olan hastalarda yapılmıştır.
    1. Girişimsel Radyoloji veya ilgili bölümünden klinik personeli içeren steril konik santrifüj tüpü tedavi öncesi iğne biyopsisi yapmak ve bir 15 ml numune yerleştirin sahip yaklaşık 5 ml% 1 antibiyotik (penisilin ve streptomisin) içeren minimum temel ortam (MEM).
    2. Islak buz üzerinde biyopsi örneği yerleştirin ve hemen ex vivo taze doku kesit için laboratuvar uzaya taşıyacak.

Kesit ve Vibratome Ayarları için Malzemelerinin 2. Hazırlık

  1. Kesit için Malzemelerinin Hazırlanması
    1. Aga 4 g eklenerek,% 4 agaroz solüsyonu yapmakPBS, 100 ml yükseldi. Otoklav (devir ayarı: sıvı, 121 ° C, 30 dak, inç kare başına £ 15), ilk kullanımdan önce çözelti. Daha sonraki kullanımlar için, agaroz oda sıcaklığında katılaşması dikkatli her kullanımdan önce (30 saniye aralıklarla için yüksek ısı) sıvılaştırılması ve uygun bir şekilde ~ 25 ° C (yani, sıcak bir dokunma) soğumaya bir mikrodalga içinde% 4 agaroz yerleştirin.
    2. Kalıcı olmayan bir doku gömme ortamı olarak% 4 agaroz kullanın. % 4 agaroz yeterli miktarda soğutulur ve steril bir forseps gömme kalıp doku örneğin yerleştirilmesi ve% 4 agaroz akma, sıvı halde hala demektir.
    3. Gömme kalıp kesme yüzeyi doğrudan duvara yakın bir doku örneği (~ 2 mm mesafe), fakat yerleştirin. % 4 agaroz, hızlı katılaşmaya başlar, bu nedenle hızlı ve uygun şekilde doku örneği yer alacak. Kesitlere ayırma esnasında çözelti içinde tutmak için bir 55 ° C su banyosu içinde,% 4 agaroz tutun.
    4. Bölümü analiz için 24 plaka için, 1 ml o eklemekHer bir oyuğa f tüm ortam (örneğin, MEM +% 10 cenin sığır serumu +% 1 antibiyotik). Kesit alma süresi boyunca, oda sıcaklığında (-25 ° C) 'de 24-yuvalı plaka tutun.
  2. Ayarlar Vibratome hazırlanması
    1. Titreşimli mikrotomu kullanılarak, 10 bıçak örneği yaklaşır hızını [10 (2,5 mm / sn) 0 (0.00 mm / sn)] ve bıçak [0 (0 Hz) frekansını ayarlamak (100 Hz) ]. Doku (örneğin yoğunluk / sertlik) bir kıvama göre ayarları yapın.
    2. Invaziv duktal karsinom, primer meme tümörü için, sırasıyla 6 ve 3, hız ve frekansa ayarlar. Az yoğun / firma tümör dokusu için hızını azaltmak ve buna göre sıklığını arttırırlar.
    3. (- 999 mikron 1) enstrüman sınırları içinde kesit kalınlığı ayarlayın. Bu analizler için, 200mm'lik bir kesit kalınlığı ayarlayın.
    4. Örnek disk tha sıvı daha ince bir yapışkan tabaka kullanılarak Agaroz yerleştirilen örneği montet ıslak buz kaplı olan medya bir rezervuar batırıldıktan.

3. Doku Kesit, Tedavi ve Analizleri

  1. Hemen tam ortam 1 ml ile bir çok-çukurlu bir tabla içindeki steri forseps ve yer kullanarak kesit üzerine hassas dilimlenmiş bölümleri çıkarın. Yeterli bölümleri tepki ve bağlaşık analizler için yakalandığı zaman, standart doku kültür koşulları altında ayarlanmış bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde tedaviye yanıt için çok çukurlu plaka yerleştirilir.
  2. Kültürlü eserler karşı doza bağlı bir cevap teyit etmek için bir çaba muamele edilmiş bölümleri bağlayıcının birden fazla kontrol bölümleri al. (- 4 sa ~ 2) 18 de soğuk iskemi zaman zararlı etkilerin içinde, - (40 dk ~ 30) doku hızla kesit gerçekleştirin. Sadece 1 saat alışma dönemi aşağıdaki bölümlerden tedavisini yapın.
  3. 1 saat alışma süresinden sonra, doz (terapötik ilgili artan ekleyin;
  4. Tedaviyi takip ederek, RT O'da% 10 tamponlu formalin ve sırayı içeren bir tüpe doku bölüm yerleştirerek, steril koşullar ve formalin ile düzeltme altında bölümleri çıkarmak / N veya% 4 paraformaldehid içeren bir tüpe (bir şişesinden,% 16 paraformaldehit seyreltik 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir nihai konsantrasyonu% 4) ve bir yer için PBS ile yıkanmıştır.
    1. Daha büyük doku bölümleri saptamak (örneğin,., ~ 6 mm x 4 mm),% 10 tamponlu formalin O 200 mikron kalınlığında / oda sıcaklığında K. Daha küçük bölümleri Fix (örneğin,., 1 mm x 1 mm), oda sıcaklığında 2 saat süresince% 4 paraformaldehit içinde 200 mikron kalınlığındadır.
      NOT: fiksatif f hacmi verimli penetrasyon içinixative doku hacmi 20x olmalıdır. Verilen bu doğru tespiti kullanımı tüm doku boyutları için fiksatif 1 ml güvencesi için son derece küçük doku boyutları (örneğin, 6 mm 3 doku = 6 ul hacmi), bu protokol sonuçları.
    2. Tespitin ardından doku örnekleri Patoloji Bölümü personeli tarafından gömülü parafine var. Tahsil slaytlar üzerine parafin bloklar örnek Bölüm hematoksilen ve eozin lekeli ve değerlendirilir immunohistokimyasal (örneğin, apoptoz) olmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma için, ex vivo olarak teknik, bir ısı şoku proteini 90 inhibitörleri (Hsp90i) terapötik hassaslık / duyarlılık bir bağıntılı analizinde kullanıldı. Bu Hsp90i, meme kanseri primer tümörün, bir ER + invaziv duktal karsinom (IDC) ve ilişkili lenf nodu metastazı klinik öncesi değerlendirmede tedaviye yanıt ex vivo olarak analiz edildi   (Şekil 1). Birden fazla 200 um seri bölümleri Hsp90i bölgesinin sadece araç ve artan dozlarda (0.25, 0.50, 1.0 ve 2.5 uM) ile muamele edildi. Şekil 1 'deki veriler, formalinle sabitlenmiş 48 saatlik bir periyot sonrasında, parafine gömülü (FFPE) ve hematoksilin ve eozin (H & E) ile lekelenmiş bölümler temsil eder. Nükleer morfolojik değişikliklerin görüldüğü gibi, 2.5 uM işlenmiş doku kesiti apoptozun% 40 endüksiyon ile sonuçlanmıştır ise tedavi edilen kontrol bölümü (yalnızca araç) uygun bir IDC yuvalar gösterir (yani, çekirdekler piknotik / APOPtotic enkaz) (Şekil 1A). Apoptosis, ayrıca, terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL) analizi ile primer tümör teyit edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). IC50 ilacın konsantrasyonuna karşı yüzde apoptozu grafik kullanıcısı tarafından müdahale verilerinden hesaplanmaktadır. Önemli bir şekilde, şaperon, Hsp90, normal ve kanser hücrelerinin 10 her iki kritik sinyal yollarının protein stabilizasyonu ve homeostazında önemli bir rol oynar. Kanser HSP90 hedef yeteneği habis hücrelerin ağır Özellikle metastatik ilerlemesi sırasında karşılaşılan daralan ortamlarda vurguladı durumlarını aşmak için bir çaba, Hsp90'a bir ebeveyni fonksiyonuna bağlı olduğu bulgusuna dayanmaktadır. Esas olarak, kanser hücreleri 'onkojenik' Hsp90 11 bir hedeflenebilir seçici havuz Hsp90 ile sonuçlanan fonksiyonu üzerine son derece bağımlı hale gelir. Insert olarak, Şekil 1A, ilişkili asinüs ve kanal ile komşu selim lopçuk değişmeden i kalırn ise 2.5 uM Hsp90i-muamele bölümü. Bildiğimiz kadarıyla, bu Hsp90 kanser-özgüllük görsel primer tümörleri ve ilişkili metastaz Hsp90i tepki değerlendirmesinde yakalanan ilk kez. Lenf düğümü metastazı primer tümörün çevresindeki iyi huylu göğüs parenkimada IDC (Şekil 1A) hem de damarların bitişik huylu lobüller görüldüğü ve ilgili değiştirilmemiş huylu / normal hücrelerin Bu bulgu, (veriler gösterilmemiştir) birçok farklı değinmeyecek edilmiştir tümör türleri (örneğin, meme, mide ve lenfoma metastaz).

Bu primer tümörün eşlik eden lenf nodu metastazı sadece gevşek ilişkili olduğu IDC yuvalarının (Şekil 1B) tam bir tepki gösterdi. TÜNEL (Şekil 1C) ile teyit edildiği gibi sıkı Küresel şekiller, bununla birlikte, canlı kaldı oluşan IDC yuvaları. Ortaya bağışıklık fluorışıması yoluyla uygulanabilir IDC sferoitlerin ilave analizihücre-hücre yapışma molekülü, E-kaderin, bir sürekli ya da yeniden ekspresyonu (Şekil 1C). Bu bulgu ile tutarlı kalıcı, aşırı ifadesi oldukça malign, ölümcül inflamatuar meme kanseri 12, 13 yansıtıldığı gibi metastatik potansiyel ya da metastatik verimliliğine katkıda E-kaderin. Ilginç olsa da, bu bulgu bu yazının kapsamı dışındadır. Bununla birlikte, bu lenf nodu (LN) IDC sferoidler 2 haftalık bir süre boyunca kültür içinde muhafaza edildiğinin farkedilmesi de önemlidir ve bu nedenle klinik öncesi bir ilaç gelişimi hem de hassasiyeti / direnç üzerinde çalışmak üzere ex vivo olarak tekniği kullanılarak gücü itimat verir.

Ex vivo tekniği de tümörlerde 16,17 hedef inhibisyonu kanıt için iğne biyopsisi (CNBs) bir klinik çalışmada istihdam edilmiştir. Bir tedavi öncesi iğne biyopsisi (CNB) işlemi gerçekleştirilir (Şekil 2) sahip rıza hastalar. KarşılaştırılabilirPrimer tümörlerin klinik öncesi değerlendirilmesi için, ex-vivo teknik erişilebilir metastaz CNB duyarlılığı ya da yanıtı belirlemek için kullanılır. CNB birden çok 200 um seri bölümleri araç sadece ve sadece Hsp90i artan dozları (0.25, 0.50, 1.0 ve 2.5 uM) ile muamele edildi. Ex vivo değerlendirilmesinde kullanılan Hsp90i doz sayısı CNB boyutuna göre belirlenir. Bununla birlikte, her türlü çabayı yukarıda önerilen doz spektrumunu kullanmak için yapılır. Klinik öncesi eks vivo değerlendirme gibi, tepkisi, hasta yanıt olarak gerçek kıyasla sonra değerlendirilir edilebilir (yani, bağlaşık analiz Şekil 2) tedavi sonrası CNB farmakokinetik (PK) ile saptandığı haliyle, örneğin, sıvı kromatografisi ile ölçüldüğü haliyle ilaç tutma tandem kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) ile hasta, PET görüntülemesi (Şekil 2) 16,17 yanı sıra analiz eder. Şimdiye kadar, c, eks vivo tekniği kullanılarak yapılanlinical çalışma birden fazla tümör türleri (örneğin, meme, marjinal zon lenfoma, mantle hücreli lenfoma, metastatik paragangliyom, serviks ve over kanserleri) 16, ayrıca ex vivo tekniği uygulayarak 17. Bütün bağıntılı analizi bu tekniğin yararını örnekliyor üzerinde yapılmıştır Klinik ilaç geliştirme.

Şekil 1
Bir ER + meme kanseri Şekil 1. ex vivo tepki analizi. (; Ölçek çubuğu 100 mikron Hematoksilin ve lekeli eozin) (A, Sol panel) invaziv duktal karsinom (IDC) ettirebilen yuvalarını görüntüler. (Hematoksilin ve eozin lekeli; ölçek çubuğu 100 um), 2.5 uM Hsp90i ile muamele, (A, sağ panel) üzerine bir% 40 Apoptotik tepkimenin ~ indüksiyonu (oklar piknotik çekirdekler / apoptotik enkaz) vardır. Benign lobüller g> (A, insert) tedavi sonrasında değişmeden kalır (Hematoksilin ve lekeli eozin; ölçek çubuğu 200 mikron). (; Ölçek çubuğu 100 um hematoksilin ve eosin ile boyanmış), muamele edilmiş bölüm ise (B, sağ panel), metastatik IDC bir alanını gösteren bir lenf düğümü (LN), (B, sol panel) arasında kontrolsüz apoptosis küçük düzeyde bir görüntüler tam yanıt ile yuva (hematoksilen ve eosin ile boyanmış, ölçek çubuğu, saat yönünde 2 mm, 300 mikron, 200 mikron ve 200 mikron). Ancak, sıkı IDC sferoidler; TÜNEL analizi ile gösterildiği gibi, aynı bölümünden (sferoidler Sp) (Cı-sol panel) eşlik eden bir (ölçek çubuğu 200 um) (Cı-sağ panel) ile üzerinde bulunan canlı kalan, eğer varsa, çok az apoptosisi göstermektedir E-kaderin (büyütme 100X) arasında -Anlatım.> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2
Şekil bir klinik çalışmada ex vivo tekniğin uygulanması 2. şematik. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etkili tedavi stratejileri geliştirmek için çalışırken Kanser biyologlar önemli zorluklarla karşı karşıya. Kurulan kanseri hücre çizgileri üzerindeki geliştirme ilaçlar in vivo test doğru yanıt olarak ve PDX modellerinde in vivo deneyler, emek yoğun ve çok pahalıdır yansıtmıyor olabilir. Yukarıda verilen, primer hastanın ex vivo tekniklerin uygulanması 15 hemen kurulmuş olan kanser hücre çizgileri ve hasta türetilmiş ksenograftları (PDX) moleküler analizi yanında konumlandırılmış, 14, tümörleri.

Bu kağıt tekniği sadakatle yanıtı üzerine (IC50) bildirir ki, yeni bir yüksekliğe, hedef dışı etkiler ex vivo tekniğin uygulama alır ve direnç ve geri besleme mekanizmalarının moleküler analiz sağlar. Cevabı verileri tümör moleküler profili tümör mol vs (yani protein tümör biyomarkerlerin ifadesi, mutasyonlar) bağıntılı çalışma (yanıt korelasyon zamanecular profili) hasta sonuçlarını geliştirmek için bir çaba, belirli bir ilaca yanıt olasılığı daha yüksektir hastaları seçmek için kullanılabilir. En önemlisi, klinik ilaç geliştirme (yani., Isteğe bağlı biyopsiler) içinde, tedavi öncesi CNB ex vivo tepkisi hasta yanıt korelasyon (ve valide) olabilir (yani, tedavi sonrası CNB) ve ilaç tutma (farmakokinetik (PK) değerlendirme) 16,17. (; Hsp70 indüksiyon yani PD) ve dozaj ve 16,17 zamanlama üzerinde bilgilendirmek için bu klinik çalışmada ex vivo tekniğinin kullanımı, tümör yanıtı yanı sıra onayla hedef özgüllüğünü belirlemek başardı.

Ex vivo tekniği en katı tümör tipleri için uygun olduğu gibi, kan yoluyla bulaşan kanser metastazı (örneğin, lenfoma lenf nodu metastazı) küçük zorluklar, bazı tümör türleri için protokol hafif ayarlamaları ile. Örneğin, pankreas tümörleri, yüksek s eğilimindedirdüşük kanser hücresi sunumunu bölümleri ile sonuçlanabilir tümör hücresi oranı ile troma. Tümörü hücresi bakımından zengin bölgelerin temini bütün olarak analiz yapılamaz. Bu nedenle, bir tümör numunesine birden fazla daha küçük küp alanı (4 / agaroz gömme kalıp) gömülü ve bir tümör hücre açısından zengin bir eks vivo bölümünün olasılığını yükselten, aynı anda kesitli olabilir, bu olası eksiklik üstesinden gelmek için.

Bizim verilerimiz güçlü klinik öncesi ilaç geliştirme (Şekil 1) ex vivo tekniğin kullanımını destekleyecek. Yanıt (IC50) ile birlikte, bölümler etkisi ilaca maruz kalma salgılanan faktörler (örneğin, sitokinler, eksozomlar), direnç ve geribildirim mekanizmaları ve önemlisi üzerindeki alternatif canlılığı deneyleri, metabolitler, birleştirici tedavi stratejileri için analiz edilebilir çoğaltmak, off-hedef üzerinde bilgi etkiler (yani, normal ve iyi huylu hücreleri). Bir ikinci Hsp90i Bu özel çalışmada, hedef speözgüllüğünü ve 'hedef dışı etkiler "teşhis anahtarı sadece malign transformasyon 10 üzerine kanser hücrelerinde bulunan' onkojenik Hsp90'a 'ayırt edici bir havuz olduğunu önermesine dayanır. Bu, bir ex vivo Hsp90i ile muamele edilmiş bölümün huylu lobüller değişmeden kalan sonuçlar bölümünde (insert, Şekil 1A) sunulmuştur. In situ (DCIS) ilişkili duktal karsinom (veriler gösterilmemiştir) değişmeden kalırken Şekil 1 yansıyan aynı primer tümörün başka bir bölümünde bulunan eşit önemi, Of, 10 mcM (terapötik ilgisiz doz) tedavi bölüm IDC yuvalarının tam tepki gösterdi . Bu araştırma doğrultusunda Gelecekteki araştırmalar bu yazının kapsamı dışındadır. Ancak, bu bulgu onkojenik göre 'malign transformasyon' veya IDC örneklerinde ilişkili DCIS'lı hastalığın ilerlemesi, devlet üzerine bilgilendirirHsp90 işleyen ve ilaç geliştirme ex vivo tekniği kullanarak destekler yarar chaperoning.

Ex vivo tekniğin ek bir uygulama tümör ksenogreft modellerinde ön yeterlik analizinde kullanımı (yani., Ex vivo PDX kesit) ilaç geliştirme farmakokinetik / farmakodinamik (FK / FD) dahil gerçekleştirilmesi öncesinde, maliyetli veri belirlemektir in vivo çalışmalar - sağlayan bir daha bilgili, maliyet-etkin vivo ilaç etkinlik çalışmasında.

Önemli adımlar ve ex vivo tekniğinin potansiyel sınırlayıcı faktörler tedarik ve kesit vardır. Tümör örneğinin Alımı (yani., Primer tümör / metastaz) canlılığının en yüksek derecesi ile tümörün bir alanı tanımlayan yakın ilgi ile süratle yapılmalıdır. Büyük tümörler fena halde görünmeyen nekrotik merkezi alanlara sahip olma eğilimindedir. Bu nedenle, tedarik doku from en dış kenar uygulanabilir bir örnek alınmasıdır olasılığını artırır. , Kesit arzu edilen kalınlıkta dilimler hassas toplama ile ilgili olarak (örneğin,., 200 um) büyük ölçüde (nedeniyle, son derece küçük bir boyuta CNBs hariç) tümör yoğunluk / sertliği etkilenir. Örneğin, invaziv duktal karsinom, genellikle invaziv lobüler karsinom aksine çok yoğundur. Yoğun tümör dokusu uygun direnç sağlar - daimi gömme medya yokluğunda - bıçak, az yoğun tümör dokusu yok oysa. Daha az yoğun bir tümör doku tiplerinin örnekleri arasında, invaziv lobüler karsinom, müsinöz karsinom ve mide tümör tipleri ile sınırlı değildir. Bu potansiyel sınırlamayı aşmak için, sorun çözme, uygun bıçak hız ve frekans ile gereklidir. Tutarlı hassas dilimlenmiş kesit kalınlığı, kesit süreci boyunca, ilaç yanıt doğru değerlendirilmesi için önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica VT1000s Leica 14047235613
UltraPure agarose Invitrogen 16500500 Prepare 4% and 6% before use
Injector blade Ted Pella 121-4
MEM with Penicillin  + Streptomycin Media Core Facilities (MSKCC) The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center 
Scalpel no. 10 Thermo Scientific 31-200-32
Disposable forceps Cole-Parmer 84011182
Embedding mold Electron Microscopy Science 70181
FBS (heat inactivated) Gemini 100106
24 well plates Corning 3524
Formalin (10%) Sigma Diagnostics SDHT501128 
16% Formaldehyde solution Thermo Scientific 28908
Embedding microsettes Simport M503-2
Ethanol (70%) Fisher Scientific A405P-4
Waterbath Fisher Scientific 15-462-2SQ
Microwave General Electric ModelJES2051DNBB
Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) Sigma-Aldrich E1505-5G
10 mm dishes BD Falcon 353003
15 ml tubes BD Falcon 352096

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abercrombie, M., Ambrose, E. J. Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture. Experimental Cell Research. 15, (58), 332-345 (1958).
  2. Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat. New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).
  3. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  4. Dean, J. L., et al. Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors. Cell Cycle. 11, (14), 2756-2761 (2012).
  5. Bray, K., et al. Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer. Molecular Cancer Research. 7, (9), 1487-1496 (2009).
  6. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19, (11), 1423-1437 (2013).
  7. Nakasone, E. S., et al. Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance. Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).
  8. Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia. PNAS. 111, (8), 3092-3097 (2014).
  9. Vidal, S. J., et al. Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples. J. Vis. Exp. (85), e51332 (2014).
  10. Wanping, X., Neckers, L. Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).
  11. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90. Nature Chemical Biology. 7, (11), 818-826 (1038).
  12. Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer. American Journal of Pathology. 161, (2), 619-628 (2002).
  13. Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism. Oncotarget. 4, (3), 446-462 (2013).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. PNAS. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).
  16. Jhaveri, K., et al. Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions. Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).
  17. Gerecitano, J. F., et al. Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71. Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).
  18. Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma. Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).More

Corben, A. D., Uddin, M. M., Crawford, B., Farooq, M., Modi, S., Gerecitano, J., Chiosis, G., Alpaugh, M. L. Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics. J. Vis. Exp. (92), e52157, doi:10.3791/52157 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter