Abstract
תאי גזע אנושי pluripotent מושרה (hiPSCs) יכולים להיות שנוצרו עם מתודולוגיות תכנות מחדש מבוסס lentiviral. עם זאת, עקבות של גנים שעלולים להיות סרטניים שנותרו באזורים משועתקים של הגנום, להגביל את הפוטנציאל שלהם לשימוש ביישומים טיפוליים אדם 1. בנוסף, אנטיגנים שאינם בני אדם נגזרים מתכנות מחדש של תאי גזע או הבידול לנגזרים רלוונטיים טיפולי מונעים hiPSCs אלה מלשמש בהקשר קליני בבני אדם 2. בסרטון הזה, אנו מציגים הליך לתכנות מחדש וניתוח hiPSCs ללא גורם ללא transgenes אקסוגני. hiPSCs אלה לאחר מכן ניתן לנתח מומי ביטוי גנים באינטרון הספציפי המכיל את lentivirus. ניתוח זה יכול להיעשות באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז רגישה כמותית (PCR), שבו יש יתרון על פני טכניקות רגישות פחות השתמש בעבר כדי לזהות הבדלי 3 ביטוי גנים. המרה מלאה לתרגול בכיתה קלינית טוב ייצור תנאים (GMP), מאפשר רלוונטי קלינית בבני אדם. הפרוטוקול שלנו מציע כי קריטריונים בטוחים נמל נוכחי ירחיבו וכוללים נגזרים מבוססי hiPSC ללא גורם מאופיינים ליישומים לטיפוליים אנושיים הנובע hiPSCs כיתה GMP, שאמורה לחסל את כל סיכון חיסוני בשל אנטיגנים שאינם בני אדם שסופקה על-מתודולוגיה אחרת. פרוטוקול זה הוא רחב החלים על תאי lentiviral לתכנות מחדש של כל סוג ומספק שיטה לשחזור להמרת תאים לתכנות מחדש לתנאי כיתה GMP.
Protocol
הערה: שיטה זו שימשה במחקר דיווח נוראים et al 10..
1. תכנות מחדש אדם הבוגר Dermal Fibroblasts עם STEMCCA
- fibroblasts עורי מבוגר הפשרה אנושי (HUFs), מעבר 4 או פחות, באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, נזהר שלא להטביע את חלקו העליון של הבקבוקון עם מים.
- מניחים את תערובת 1 מ"ל של fibroblasts אדם לתוך בקבוקון חרוטי 15 מ"ל ומניח לאט 4 מיליליטר של תקשורת HUF סטנדרטית, טרום חיממה עד 37 ° C, בצורה טיפה חכמה, כדי לדלל את sulfoxide דימתיל (DMSO) ו מחדש להשעות תאים.
- צנטריפוגה הבקבוקון ב XG 200 במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant מחדש להשעות תאים בנפח מספק של תקשורת ליצור השעיה של 100,000 תאים / מיליליטר ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל ולאחת מצלחת שש היטב, מצופה מראש למשך 20 דקות עם ג'לטין 0.2%.
הערה: אחות עם מספר שווה של תאים בכל שורה ומצב טוב צריכה להיות נזרעה for ספירת התאים / ריבוי של זיהום חישוב (משרד הפנים). - רוק בצד הצלחת לצד וקדימה ואחורה כדי לפזר באופן שווה את התאים. דגירה לילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
- ביום של התמרה, להשיג ספירת תאים (שניות) מהאחות היטב כ 24 שעות (ים) לאחר ציפוי HUF ראשוני.
- להפשיר 2 x 10 8 TU, או תרכיז שווה ערך, lentiviral (STEMCCA) ולדלל עד 1 x 10 8 TU / ml בתקשורת HUF.
- Transduce תאים ביחס 10-משרד הפנים בתקשורת HUF השלים עם סוכן transfection 8 מיקרוגרם / מיליליטר. מערבבים בארות transduced באופן שווה ודגירת לילה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
- כ 24 שעות לאחר התמרה lentiviral, לעבור תקשורת HUF לתאי גזע pluripotent אדם בינוני סטנדרטי (PSC).
- בימים 2 עד 6, לשנות תקשורת יומיומית עם מדיום PSC אנושי.
- ביום 6, צלחת שתי צלחות 10 סנטימטרים מצופים ג'לטין 0.2% מ1.5 x 1.75 10 6 MEFs שנלקח מעכברי CF1 בתקשורת HUF 12.
- ביום 7, נזהרת שלא צנטריפוגות יותר מ -100 XG, טריפסין טמפרטורת חדר שימוש כדי להרים את יום 7 fibroblasts תכנות מחדש מהיטב אחד של הצלחת והמעבר שש היטב ביחס 01:16, על ידי ציפוי את כל התאים באופן שווה בין שתי 10 צלחות סנטימטר, עם תקשורת טרי אנושית PSC, שהיו מצופים עם MEFs היום קודם לכן. להפיץ אגרגטים תא בתנועה ספירלית בכיוון השעון ומקום ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 humidified חממת הלילה.
- כ -48 שעות לאחר זריעת התאים לתכנות מחדש על MEFs ובכל יום לאחר מכן, לשנות את תקשורת PSC אדם בילתה עם תקשורת טרי.
- לאחר 3 עד 4 שבועות, לבחור מושבות בודדות עם ESC הטיפוסי כמו מורפולוגיה עם מחט 21-מד וsubclone החוצה אל צלחת 24 גם על ידי הצבת כ 8 עד 10 יצירות בודדות של מושבות ספציפיות לתוך בארות בודדות ב0.2% ג'לטין מצופה צלחת 24 גם פרה-סידed עם MEFs שנלקח מעכברי CF1 במדיום PSC אנושי.
הערה: לאחר הרחבת מושבות הרימו, המושבות צריכה להיות מאופיינות כpluripotent על ידי היווצרות embryoid גוף וניתוח ביטוי של סמני pluripotency ברמת החלבון.
2. וקטור אינטגרציה ניתוח אתר וSTEMCCA כריתה
- לנתח את אתר האינטגרציה STEMCCA על ידי ההגברה ליניארית שאינה מגבילה PCR כמתואר 10.
- לאחר מנסה לאמוד על מנת להבטיח אינטגרציה אחד לאזור רצוי של הגנום, STEMCCA בלו על ידי aspirating את מדיום ESC האנושי הישן. ואז, לשלב 45 μl של וירוס Adeno-Cre-PuroR המרוכז עם 8 מיקרוגרם / סוכן transfection מיליליטר ב 3 מיליליטר של תקשורת PSC סטנדרטית למשך 24 שעות.
- לאחר תקופת הדגירה 24 שעות, לשאוב את supernatant ויראלי המעורב ולשטוף את התאים פעמיים עם תקשורת PSC אנושית. הנח תקשורת PSC אנושית טרי יחד עם 2 מיקרוגרם / מיליליטר puromycin לתקופה של 5 ימים, לשנות את השנינות היומית התקשורתתקשורת h טרי ואנטיביוטיקה.
- לאחר 5 ימים, subclone נותר מושבות עם מחט 21-מד על בארות מצופים ג'לטין 0.2%, בצלחת 12 גם מראש מצופה עם MEFs נגזר מCF1mice ולהרחיב כפי שפורט לעיל.
הערה: לאחר הרחבה מספיק כדי להשיג המניה קפוא, נדרשת המרה לתנאי מזין ללא. מצפה לפחות 95% מות מושבה תאי גזע כמו רוב התאים לא transduced בהצלחה וייכנעו לאנטיביוטיקה בהשוואה לתקופה של 5 ימים של דגירה. למרות Adeno-Cre-PuroR משלב ביעילות% .001-1 לכרומוזומים מארח של תאים נגועים, reexposing מדגם של מושבות ללא גורם לpuromycin כדי להבטיח 100% מוות של תאים יאשרו אינטגרציה, לא התרחשה 13. - להפשיר בקבוקון אחד של מטריצת קרום במרתף מראש aliquoted על קרח, על פני תקופה של כ -2 שעות (המלצות יצרן) עד המטריצה היא נוזל ולדלל את ריכוז סופי של 1:30 בתקשורת בסיסית קרה. Coבמספר רצוי של בארות בצלחת שש היטב עם 1 מיליליטר לכל טוב. בואו לשבת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
- צלב-צוהר (באמצעות מחט 18-מד, או "טיפ" זכוכית או פלסטיק) לפחות 20 עד 30 מושבות וממצופות בעבר עם MEFs. להיות זהיר כדי להפחית MEF מרומם ולהעביר מצלחת.
- צור מכשיר הקווקווים באמצעות מספר הגישות שונות, מהחימום המסובך יותר, מושך, וגימור של זכוכית פיפטה פסטר על להבה פתוחה, לשימוש הפשוט של קצה פיפטה פלסטיק סטרילי או, כמו במקרה שלנו, 21- ו / או 18-מד מחטים.
- לשאוב את המטריצה מהבאר לאחר הדגירה המצופה.
- הסר פיסות המושבות על ידי גירוד עדין מהצלחת הישנה עם pipettor 200-μl ומניח בזהירות לתוך 3 מיליליטר של תקשורת המשולבת הטרי 1 בצלחת מצופה המטריצה. דגירה הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% 2 חממה humidified CO. תקשורת שינוי 48 שעות לאחר passaging.
- לחלץ הדנ"א הגנומי מhiPSCs המרה-נכרת פוסט והמזין ללא, בלמעלה מ -80% confluency, באמצעות ערכות חילוץ DNA המסחרי.
- ניתוח לכריתה נכונה עם פריימרים ספציפיים לאינטגרציות אקסוגני של lentivirus STEMCCA: gDNA-hendo-MycS-קדימה, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-הפוך, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ". מחדש פריימרים lyophilized עם מים כיתה-PCR לפתרון מניות של 10 מיקרומטר.
- הפעל PCR עם פרוטוקול חמשת השלבים הבאים: denaturation הראשוני ב 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות; 35 מחזורים של כל אחד מאלה: denaturation על 98 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, חישול פריימר על 62 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, וסיומת על 72 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות; אחרי ארכה אחת מחזור אחרון ב 72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- הפוך ג'ל agarose 3% על ידי שקילה מתוך 1.5 גרם של agarose והצבתו לתוך 50 מיליליטר 1x חיץ טריס-אצטט-EDTA. מיקרוגל עד agarose הוא נמס והמקום בכתם ג'ל DNA בעמ 'דילול רופר, לערבב, ולוותר על נפח ראוי לקלטת ג'ל לבסס עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- עומס 12 μl של מוצר ה- PCR מעורבב עם 3 μl של צבע טעינה לג'ל agarose 3%. הפעל את ג'ל למשך 30 דקות ב 80 V.
- דמיין עם אור אולטרה סגול על היעדריו של להקה המציין כריתה נכונה.
3. Quantitation של הבדלי ביטוי גנים על ידי שימוש בכמותי PCR מהקדם וhiPSCs נכרת-ההודעה
- לחלץ RNA הכולל מhiPSCs המרה-נכרת פוסט והמזין ללא באמצעות ערכות חילוץ RNA מסחריות.
- הפוך-לתמלל עד 1 מיקרוגרם של RNA הכולל באמצעות ערכות מסחריות בהתאם להוראות היצרן. השתמש מעוגן-אוליגו (DT) 18 ופריימרים hexamer אקראיים.
הערה: ודא שפרוטוקול PCR מותאם לתעתיקי גנים של יותר מ או פחות מ -4 קילו. פריימרים ספציפיים יצטרכו להתבצע על i לפי גן STEMCCA המשולב במקורn כדי. - מחדש את פריימר lyophilized עם מים כיתה-PCR לפתרון מניות 20 מיקרומטר.
- השתמש 5 ng של מדגם לכל 20 μl של תגובה שמורכבת מבדיקת UPL 10 מיקרומטר, 2x LightCycler 480 בדיקות הורים, ו -20 מיקרומטר קדימה לאחור פריימרים.
4. המרה לתנאי כיתה GMP
- ביום הראשון של מעבר hiPSCs-נכרת ההודעה על תנאים בכיתה GMP, לעשות תערובת של תקשורת בהיקף של PSC האנושי בשילוב 1 (1 תקשורת משולבת) וכיתה קלינית בפועל ייצור טוב (GMP) תקשורת תואמת תקשורת תקשורת (בשילוב 2 ) בשעה 80:20 יחס.
- לשאוב את התקשורת המשולבת הישנה 1 ומקום 3 מיליליטר של התקשורת המשולבת החדשה 1 ו- 2, מחומם מראש, ביחס 80:20. שינוי בתקשורת כל יום במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
- ביום 4, להפיק את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 50:50. לשאוב את המדיום וreplac הישניםדואר עם תקשורת חימם מראש, עם התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 50:50. שינוי בתקשורת במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
- ביום 7, להפיק את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ביחס 20:80. לשאוב את המדיום הישן ולהחליף עם תקשורת מחוממת מראש, עם התקשורת המשולבת 1 ו -2 ביחס 20:80. שינוי בתקשורת במשך 3 ימים עם היחס הספציפי הזה. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
- ביום 10, להפוך את התקשורת בשילוב 1 ו -2 ב0: יחס 100. לשאוב את המדיום הישן ולהחליף עם תקשורת חימם מראש, עם התקשורת בשילוב 1 ו -2 ב0: יחס 100. שינוי בתקשורת בכל יום ביחס הספציפי הזה. תאים נמצאים כעת בללא מדיה קסנו מוגדרת לחלוטין. תאי מקום בחזרה ל37 ° C, חממה 5% CO 2.
הערה: במהלך תהליך גיור כל זה, יש צורך בpassaging השגרתי עם מחט 18-מד לשמור גודל מושבה ראוי וצפיפות. תכנית על passaging תאים כל 4 עד 5 ימים על בסיס גודל מושבה, confluency, ובידול. - אחד מעיל גם בצלחת שש היטב עם מצע ללא קסנו מוגדר כמומלץ על ידי היצרן.
- מעבר מכאני ומחוברות גם, שכבר הוסבו לחופשי קסנו-תנאי תקשורת, מצלחת שש היטב עם מחט 18-מד. חשוב לציין, למקם את המדיה חדשה (מדיה משולבת 2) בתאים עם מעכבי ROCK 1x עבור שעה 1, לפני passaging מראש מצב התקשורת.
- לשאוב את פתרון המצע הסינתטי מהצלחת החדשה כי התאים מועברים ל. הסר את כל המדיה המכילה את גושי תאי גזע מהצלחת הישנה ולהעביר לצלחת חדשה.
- תאי מקום בחזרה ל-37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 2 ימים עם הפרעה פיזית מינימאלית (באופן אידיאלי צלחות, פעם אחת בתוך חממה, לא נגעו ישירות בכל דרך) כדי לאפשר מרבי של קובץ מצורף.
הערה: תאים ידרשו שינויים בתקשורת מדי יום. passagin המתמשךg כל 4 ימים יהיו חשובים. באמצעות מחט 21-מד, מעבר רק חלקים ממושבות עם מורפולוגיה אופטימלית כמו ESC (יחס nucleocytoplasmic גבוה). פעולה זו תבטיח את הבחירה למושבות hiPSC ראויות שתגדלנה היטב וסופו של דבר להניב מושבות הומוגנית. זמן הכולל לגזירה של ESC כמו מושבות הוא בין 15-20 ימים לאחר שינוי התקשורת המשולב הראשוני. - להקפיא את hiPSCs-נכרת לאחר כיתה GMP על ידי הפתח-צלב הראשון כל המושבות באמצעות מחט 18-מד. הרם את כל החתיכות באמצעות pipettor μl 200 ולהעביר את כל התקשורת המכילה את התאים לבקבוקון חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בעוד התאים צנטריפוגה, להפוך את תקשורת הקפאה מורכבת מכמויות שווה של תקשורת המשולבת הקרה 2 והקפאה בינונית עם ריכוז DMSO סופי של 7.5%.
- לאחר תאי pelleted, לשאוב את המדיום ישן וירידה מבחינת מחדש להשעות את גלולה עם תקשורת ההקפאה. מייד transfer לבקבוקוני הקפאה ולהכניס למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
5. hiPSCs נכרת-ההודעה אפיון כיתה GMP
- כדי להבטיח ביטוי הולם של סמני pluripotency לאחר המרה, להשתמש QPCR לכמת ביטוי של סמני pluripotency מפתח (Sox2, Oct4, וNANOG) על ידי שימוש בצבעי היסוד המפורט בטבלה 1 עם אותם השלבים כאמור בשלב 3. מתודולוגיות QPCR המעקב אותם צעדים כפי שמופיע בשלב 3.
- שימוש cytometry זרימה לזהות את החומצה שאינה בני האדם sialic Neu5Gc (חומצת -glycolylneuraminic N) בהתאם לתנאים סטנדרטיים המופיעים בערכה, כפי שפורסם בעבר 10.
- לשטוף בעדינות את צלחות תרבית תאים עם תאים באמצעות מלוח 1x פוספט שנאגרו (PBS).
- לנתק את המושבות באמצעות מגיב ניתוק 1x במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- במהלך זמן הדגירה של 5 דק 'של שלב 5.4, להכין את פתרון החסימה (הניתן בערכה) על ידי ביצוע 0.5% חסימת הסוכן בPBS קר כקרח.
- תווית הסט של צינורות לניתוח cytometry הזרימה הבא: בלא הכתם; 4 '6-Diamidino-2-phenylindole DAPI, (DAPI); שליטת נוגדן 1: 200; נוגדן ראשוני 1: 200; נוגדנים משני 1: 200 החמור נגד העוף IgG (H + L); MEFs מדגם; תאים-נכרת לאחר מדגם על מטריצה; ו- נכרתה הודעה לדוגמא תאים על מצע סינטטי.
- בעדינות לעקור אגרגטים תא מצעד 5.4 על ידי הוספת 2 מיליליטר של חסימת תכני פתרון ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 80 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- שוטף את התאים פעמיים עם פתרון חסימה ו צנטריפוגות כאמור בשלב 5.7.
- בעדינות מחדש להשעות כ 1 x 10 6 תאים בחסימת פתרון עם מקביל דילול הנפח של כל נוגדן 100 μl. דגירה עם הנדנדה עדינה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- חזור על שטיפות שלוש פעמים כמו בשלב 5.8.
- להשעות מחדש את התא גלולה ב400 μl של diluent לBuffer (מערכה) עם 1: 100 של DAPI לצינורות 2, 6, 7, ו -8 כפי שמופיע מתחת לשלב 5.6.
- תאי מתח דרך מסננת 40 מיקרומטר ולהפעיל באמצעות cytometer זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מציגים פרוטוקול להפקת hiPSCs ללא גורם כיתה קלינית על ידי שימוש בגישת תכנות מחדש מבוססת lentiviral STEMCCA. איור 1 א מציג תמונה מייצגת של שלושה קווים שונים hiPSC-נכרת מראש, לאחר תכנות מחדש עם גישת STEMCCA על שכבת MEFs. היתרון העיקרי של גישת תכנות מחדש STEMCCA טמון בהצלחת תכנות מחדש העקבית מושגת על ידי מדענים רבים, בקבוצות מחקר שונות ובמקומות. איור 1 מציג את הג'ל שעתוק-PCR ההפוך פוסט-כריתה, מראה subclone אחד מסוים (2.3) שהוא חופשי לחלוטין מlentivirus STEMCCA, כפי שמעיד על חוסר להקת amplicon הספציפי לרצף מסוים אנדוגני לSTEMCCA. איור 2 א מציג את hiPSCs-מומר מראש על קסנו מכיל מטריצה וhiPSCs כיתה GMP פוסט-נכרת ללא קסנו על מטריצה סינתטית . לכמת את הגורמים הקשורים pluripotency סטנדרטיים (SOX2, Oct4, וNANOG) באמצעות QPCR מתואר באיור 2 ב. hiPSCs Pre-המומר ו- יומר הודעה לתנאי כיתה GMP נבדק באמצעות זרימת cytometry לחומצת sialic חומצת N-glycolylneuraminic, מעידה על אנטיגנים שאינם בני אדם, כפי שמוצג באיור 2 ג.
איור 1: תאי גזע אנושיים pluripotent מושרה קווי נציג קלטת תאי גזע pluripotent אנושי (hSTEMCCA) -derived (hiPSC). (א) כל שלושה הקווים נגזרים נותחו עם טכנולוגית nrLAM-PCR ורק קו C8 מוצג נמצא כי שילוב אחד לגן PRPF39. רק הקו הזה, בשל שילוב STEMCCA אינטרוניים הבטוח, נבחר לעבור בחירת Adeno-Cre-PuroR לכריתת תיווך Cre. (B) Adeno-Cre בתיווך כריתת STEMCCA מחוץ לקו C8. Primers נגד רצפי נוקליאוטידים ייחודיים שנמצאו בSTEMCCA--Myc-s אנדו ו- WPRE- מצא כי רק subclone אחד (2.3 פוסט-נכרת iPSCs) היו נכרת וללא גורמי שעתוק מהונדסים מprovirus המשולב כראוי. ברים = 100 מיקרומטר. נתון זה שונה מיראת et al. 10.
איור 2: המרת hiPSCs למצבים קליניים GMP הכיתה ללא קסנו ואפיון המכיל קסנו. קו hiPSC נציג שהומר מ( מטריצת כיתה מחקר) המכיל קסנו () לקסנו-חופשי (מצע סינטטי) תנאי נוהג הקיים טוב ייצור (GMP) תנאים. תגובת כמותי פולימראז שרשרת לassay לpluripotency הנכון (B) ביטוי גנים הקשורים לאחר המרה לתנאי GMP כיתה. (ג) בadditיון לבדיקות עקרות סטנדרטי כדי להבטיח תאימות GMP, בדיקות assay מבוססות cytometry זרימה לאנטיגן שאינו בני האדם, חומצת -glycolylneuraminic N, משמשת כדי להראות שhiPSCs-יומר הודעה לחסל את כל זיהוי חומצת sialic (1% עם פוסט תאים נכרת על מטריצה לעומת 0% בתאים-נכרת הודעה על מצע סינטטי). עכבר fibroblasts העוברי וקו hiPSC נגזר בתנאי GMP שימשו כביקורת חיובית ושלילית, בהתאמה, בניסוי זה. ברים = 100 מיקרומטר. hESC, תאי גזע עוברי אנושיים; PESS, פוסט-נכרת מצע סינטטי; PEM, מטריצה-נכרת פוסט. נתון זה שונה מיראת et al. 10.
| שם גן | קדימה פריימר 5'-3 " | הפוך פריימר 5'-3 " | # Probe |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
טבלה 1: Primers המשמש לניתוח PCR כמותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים שיטה של הפקת hiPSCs ללא גורם והופך אותם מבחינה קלינית רלוונטי על ידי המרת תאים אלה לתנאי כיתה GMP להתמיינות תאים במורד הזרם בתרופות אנושיות בעתיד. למרות שפרוטוקול זה הוא החלים רחב למגוון של סוגי תאים, בחרנו לתכנת מחדש fibroblasts עורי האנושי, בשל הקלות של חילוץ מהמטופל ותחולתם לתרופות אנושיות מותאמות אישית. ברגע שמגבלות תקנה ככל בידול מלא לנגזרי תא רלוונטיים מבחינה קלינית הוא 14 מודאגים, ההמרה הוצגה לתנאי כיתה GMP תהיה עוד יותר רלוונטית למגוון של סוגי תאים שונים.
בחלקו הראשון של מחקר זה כרוך תכנות מחדש fibroblasts אדם עם lentivirus STEMCCA. טכניקה זו נבחרה במידה רבה בשל שחזור שלה, יעילות גבוהה יחסית תכנות מחדש (0.02%), ויכולת החזקה כדי לתכנת מחדש על פני גברסוגי תאים שונים y 10. טכניקה זו עדיפה על מתודולוגיות תכנות מחדש אחרות כגון וירוס סנדאי, פלסמידים episomal, ותכנות מחדש mRNA סינטטי מבוסס שסובלות מיעילות נמוכה ותכנות מחדש שחזור 10. למרות שיש מתאם בין וקטורים מבוססי HIV להשתלב בנקודות חמות פעילות הגן עלו 15, אין כל ערובה שהם ישתלבו בגן, הרבה פחות לאזור בטוח יותר של גן, אינטרון. כך המכשול הזה מייצג הגבלה בולטת לגישה זו. בנוסף, העדפת אתר שילוב הזה למקום בטוח יותר הגנומי פוחתת עם יותר אינטגרציות לאורך הגנום. לכן, זוהי החובה של אתר האינטגרציה provirus lentiviral הראוי ומספר האינטגרציה להיחקר כראוי על ידי טכניקות רגישות כגון טכנולוגית nrLAM-PCR. טכנולוגית nuclease אצבע אבץ ניצול תכנות מחדש בעתיד, Talen, או CRISPR גן / מבוסס Cas9 מיקוד (דרך homologouשל רקומבינציה) עלולה נוספת להדריך תחום זה ללוקוסים ספציפיים לתכנות מחדש 16.
ברגע שfibroblasts האנושי לתכנות מחדש כראוי ומושבות כבר נגזרו, עוד היבט קריטי של פרוטוקול זה הוא ביטוי Adeno-Cre-PuroR לבחירה של hiPSCs-נכרת פוסט. חשוב לשקול מחדש חושפים את המושבות לpuromycin אחרי כמה שבועות של תרבית תאים, כדי להבטיח שכל אדנווירוס כבר מדולל באמצעות שכפול תא ולא שילב באופן ספורדי לגנום. שילוב לא נכון לתוך הגנום של אדנווירוס ייצג דאגה בטיחות רפויה סלולריים מותאמים אישית.
המרה לתנאי כיתה GMP היא צעד חשוב בהחדרת יישום קליני לhiPSCs ללא גורם אלה. חשוב לשנות רק תנאים אחד בכל פעם בעת המרת תאים אלה מעל לללא תנאי קסנו; להתחיל על ידי המרת התאים לתוך xeno-תקשורת חופשית דרך המתודולוגיה ההמרה האיטית. HiPSCs לא יכול לסבול שינוי תקשורת ושינוי מצע באותו הזמן. ברגע שהתאים passaging באופן קבוע עם מורפולוגיה נורמלית בתנאי מדיה החדשים, להתחיל את המעבר על המצע ללא קסנו. אם סוגי תאים מסוימים מתקשים להעביר על גבי המצע המומלץ, זה אפשרי לשקול מנסה מצעים נטולי קסנו אחרים בשוק.
לסיכום, את התחולה החזקה ורחבה של טכניקת תכנות מחדש זה יחד עם המרת כיתה GMP צריכה לאפשר שחזור קל ומשמשת כבסיס לתרבות תא נגזר המבוססת על hiPSC עתיד לטיפולים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
