Abstract
Anthropiques cellules souches pluripotentes (de hiPSCs) peuvent être générés avec des méthodologies de reprogrammation base lentivirus. Toutefois, des traces de gènes potentiellement oncogènes restants dans les régions activement transcrits du génome, limitent leur potentiel pour une utilisation dans des applications thérapeutiques humaines 1. En outre, les antigènes non-humains issus de la reprogrammation de cellules souches ou la différenciation en dérivés thérapeutiques pertinentes empêchent ces hiPSCs d'être utilisé dans un contexte clinique humain 2. Dans cette vidéo, nous vous présentons une procédure pour reprogrammer et analyser hiPSCs gratuitement facteur-libres de transgènes exogènes. Ces hiPSCs peuvent ensuite être analysés pour des anomalies d'expression génique spécifique dans l'intron contenant le lentivirus. Cette analyse peut être effectuée en utilisant sensible réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR), qui a un avantage sur les techniques moins sensibles précédemment utilisé pour détecter l'expression du gène 3 différences. La conversion totale ende qualité clinique bonnes pratiques de fabrication (BPF) des conditions, permet pertinence clinique humaine. Notre protocole offre une autre méthode-à condition que les critères actuels exemptées seront étendre et inclure caractérisés dérivés de libre-facteur-base-hiPSC pour des applications à des fins thérapeutiques humains découlant hiPSCs de qualité GMP, ce qui devrait éliminer tout risque d'immunogénicité due à des antigènes non-humains. Ce protocole est largement applicable aux cellules reprogrammées lentiviraux de tout type et fournit une méthode reproductible pour convertir cellules reprogrammées dans des conditions de qualité GMP.
Protocol
NOTE: Cette méthode a été utilisée dans la recherche présentée dans la crainte et al 10..
1. Reprogrammation adulte humain fibroblastes dermiques avec STEMCCA
- Fibroblastes dermiques adulte Thaw humaines (HUF), passage 4 ou inférieures, dans un bain d'eau à 37 ° pendant 2 min, en prenant soin de ne pas submerger le haut du flacon avec de l'eau.
- Placez la pâte de 1 ml de fibroblastes humains dans une fiole conique de 15 ml et placer lentement 4 ml de milieu HUF standard, pré-chauffé à 37 ° C, dans un mode goutte à goutte, pour diluer sur le diméthylsulfoxyde (DMSO) et remettre en suspension les cellules.
- Centrifuger le flacon à 200 xg pendant 10 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un volume adéquat de médias pour créer une suspension de 100 000 cellules / ml, puis ajouter 2 ml dans un puits d'une plaque à six puits, pré-revêtu pendant 20 minutes avec 0,2% de gélatine.
REMARQUE: Une sœur bien avec un nombre égal de cellules par ligne et l'état doit être ensemencée for le comptage / de multiplicité d'infection (MOI) de calcul cellule. - Rock the côté de la plaque à l'autre et d'avant en arrière pour répartir les cellules. Incuber pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
- Le jour de transduction, d'obtenir le nombre de cellules (s) de la sœur bien (s) environ 24 heures après l'étalement de HUF initiale.
- Dégeler 2 x 10 8 TU, ou équivalent, concentré lentiviral (STEMCCA) et diluer à 1 x 10 8 TU / ml en HUF médias.
- Transduction de cellules à un rapport 10-MOI en HUF médias supplémenté avec 8 pg / ml agent de transfection. Mélanger uniformément transduites puits et incuber pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO2 dans un incubateur humidifié.
- Environ 24 heures après transduction lentivirale, basculer les médias HUF de cellules souches pluripotentes humaines (CFP) milieu standard.
- Le jour 2 à 6, changer de support quotidienne avec le milieu CFP humaine.
- Au jour 6, plaque deux 0,2% revêtues de gélatine plaques de 10 cm de1,5 à 1,75 x 10 6 MEF provenant de souris CF1 en HUF médias 12.
- Au jour 7, en faisant attention de ne pas centrifuger plus de 100 XG, l'utilisation la température ambiante de la trypsine pour décoller les jours 7 fibroblastes reprogrammés d'un puits de la plaque à six puits et le passage à un rapport 01:16, en étalant toutes les cellules de façon égale entre deux plaques de 10 cm, avec les médias CFP humain frais, qui ont été plaqué avec MEF la veille. Distribuer des agrégats de cellules dans un mouvement en spirale dans le sens horaire et le lieu dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur humidifié nuit.
- Environ 48 heures après l'ensemencement des cellules reprogrammées sur MEF et tous les jours par la suite, changer les médias CFP humains passés avec des milieux frais.
- Après 3 à 4 semaines, prélever des colonies individuelles avec typique ESC comme la morphologie avec une aiguille de calibre 21 et de sous-cloner les dans une plaque de 24 puits en plaçant environ 8 à 10 morceaux individuels de colonies spécifiques dans des puits individuels dans un 0,2% de gélatine-couché plaque de 24 puits de pré-amorçageed avec FAE provenant de souris CF1 en milieu CFP humaine.
NOTE: Après l'expansion des colonies cueillies, les colonies doivent être caractérisée comme pluripotentes par la formation de corps embryoïdes et l'analyse de l'expression des marqueurs de pluripotence au niveau de la protéine.
2. vecteur d'intégration Analyse du site et STEMCCA Excision
- Analyser le site d'intégration STEMCCA par linéaire non restrictive amplification par PCR comme décrit 10.
- Après dosage pour assurer une intégration dans une zone souhaitée du génome, accise STEMCCA par aspiration hors l'ancien milieu ESC humaine. Ensuite, mélanger 45 pi de virus concentré adéno-Cre-PuroR avec 8 pg / ml agent de transfection dans 3 ml de médias CFP standards pendant 24 heures.
- Après la période d'incubation de 24 h, aspirer le surnageant virale mixte et laver les cellules deux fois avec les médias de la CFP humaines. Placez médias CFP humains frais le long avec 2 ug / ml de puromycine pour une période de cinq jours, en changeant les médias esprit quotidienneh médias et antibiotiques frais.
- Après 5 jours, les colonies restantes sous-clone avec une aiguille de calibre 21 sur 0,2% puits revêtues de gélatine, dans une plaque à 12 puits pré-enduits avec MEF dérivés de CF1mice et étendre comme indiqué ci-dessus.
NOTE: Après une dilatation suffisante pour obtenir un stock congelé, conversion en conditions libre-alimentation est nécessaire. Attendez au moins 95% des colonies de cellules souches mort comme la plupart des cellules ne seront pas transduites avec succès et succomberont à l'antibiotique au cours de la période de 5 jours d'incubation. Bien adéno-Cre-PuroR intègre à un rendement de 0,001 à 1% dans les chromosomes de l'hôte de cellules infectées, reexposing un échantillon de colonies facteur libre à la puromycine pour assurer 100% de mort cellulaire confirmera pas d'intégration se est produite 13. - Dégeler une fiole de pré-aliquoté matrice de membrane basale sur de la glace, sur une période d'environ 2 heures (les recommandations du fabricant) jusqu'à ce que la matrice est un liquide et diluer jusqu'à une concentration finale de 1:30 dans un milieu basal froid. Coau nombre désiré de puits dans une plaque à six puits avec 1 ml par puits. Laisser reposer à la température ambiante pendant 1 heure.
- Croix-Hatch (en utilisant une aiguille de calibre 18, ou un verre ou en plastique "pointe") au moins 20 à 30 colonies d'un puits préalablement revêtu d'MEF. Soyez prudent de réduire MEF édifiante et transférer de la plaque.
- Générer le dispositif hachures par un certain nombre d'approches différentes, provenant du chauffage plus compliqué, tirant, et la finition d'une pipette Pasteur en verre sur une flamme nue, à la simple utilisation d'une pointe de pipette en plastique stérile ou, comme dans notre cas, 21- et / ou de calibre 18 aiguilles.
- Aspirer la matrice de l'enduit bien après incubation.
- Retirer les morceaux de colonies par grattant délicatement la vieille plaque avec une pipette de 200 pi et placer soigneusement dans 3 ml de médias combinés frais 1 dans la plaque de matrice revêtu. Incuber pendant une nuit dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur humidifié. Changer les médias 48 heures après repiquage.
- Extraire l'ADN génomique de hiPSCs soumettre excisées et sans alimentation converties, à plus de 80% de confluence, en utilisant des kits d'extraction d'ADN commercial.
- Analyser pour l'excision correcte avec des amorces spécifiques pour les intégrations exogènes du lentivirus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-avant, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-inverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Reconstituer amorces lyophilisées avec de l'eau de qualité PCR à une solution stock de 10 uM.
- Exécuter une PCR avec le protocole en cinq étapes suivantes: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 min; 35 cycles de chacun de ce qui suit: dénaturation à 98 ° C pendant 20 s, annelage d'amorce à 62 ° C pendant 15 secondes, et extension à 72 ° C pendant 15 s; suivie d'une extension finale unique de cycle à 72 ° C pendant 3 min.
- Ajouter un gel d'agarose à 3% en pesant 1,5 g d'agarose et en le plaçant dans 50 ml de tampon 1 x Tris-acétate-EDTA. Micro-ondes jusqu'à agarose est dissoute et le lieu dans un gel d'ADN tache à la pRoper dilution, mélanger et distribuer volume correct dans la cassette de gel se solidifier pendant 1 heure à température ambiante.
- Charge 12 pi de produit de PCR a mélangé avec 3 ul de colorant de charge en un gel d'agarose à 3%. Exécutez le gel pendant 30 min à 80 V.
- Visualisez de la lumière ultraviolette pour l'absence d'une bande indiquant excision correcte.
3. La quantification des différences d'expression génétique à l'aide de PCR quantitative de pré et post-hiPSCs excisées
- Extraire l'ARN total de hiPSCs soumettre excisées et sans alimentation converties en utilisant les kits d'extraction d'ARN commerciales.
- Reverse-transcrire jusqu'à 1 ug d'ARN total en utilisant des kits commerciaux en conformité avec les instructions du fabricant. Utilisez-oligo ancrée (dT) 18 et amorces hexamères aléatoires.
REMARQUE: Assurez-vous que le protocole PCR est adapté pour les transcriptions de gènes de plus de ou moins de 4 ko. Amorces spécifiques devront être prises pour i selon gène STEMCCA origine intégrénto. - Reconstituer l'amorce lyophilisée avec de l'eau de qualité PCR à une solution stock de 20 uM.
- Utilisation de 5 ng par échantillon 20 ul de la réaction qui se compose de sonde UPL 10 uM, 2x LightCycler 480 Probes Master, et 20 uM des amorces directe et inverse.
4. La conversion en conditions de qualité GMP
- Le premier jour de la transition les hiPSCs soumettre excisées plus aux conditions de qualité GMP, faire un mélange des médias composé de CFP humaine combinée médias 1 (médias combinée 1) et grade clinique bonnes pratiques de fabrication (BPF) médias conforme (médias combinés 2 ) dans un rapport 80:20.
- Aspirer les anciens médias combinés 1 et 3 ml placer des nouveaux médias combinés 1 et 2, préchauffé, le ratio 80:20. Changer de support jour pendant 3 jours avec ce rapport spécifique. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Le jour 4, assurez les médias combinée 1 et 2 à un ratio 50:50. Aspirer l'ancien milieu et REPLACe avec les médias préchauffé, combinés avec les médias 1 et 2 à la proportion 50:50. Changer de support pour 3 jours avec ce rapport spécifique. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Au jour 7, faire les médias combinée 1 et 2 à un ratio 20:80. Aspirer l'ancien milieu et remplacer avec les médias préchauffées, combinés avec les médias 1 et 2 au rapport 20:80. Changer de support pour 3 jours avec ce rapport spécifique. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Au jour 10, rendre les médias combinés 1 et 2 à un 0: rapport 100. Aspirer l'ancien milieu et remplacer avec les médias pré-chauffé, avec les médias combinés 1 et 2 au 0: rapport 100. Changer les médias tous les jours à ce rapport spécifique. Les cellules sont maintenant dans un milieu exempt de xéno-complètement défini. La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
REMARQUE: Pendant ce processus de conversion, des passages de routine avec une aiguille de calibre 18 est nécessaire pour maintenir la taille des colonies et la densité correcte. Plan sur la passaging cellules toutes les 4 à 5 jours, sur la base de la taille des colonies, la confluence, et la différenciation. - Revêtez un puits dans une plaque à six puits avec un substrat sans xéno-défini comme recommandé par le fabricant.
- Passage mécaniquement une confluence ainsi, déjà converti aux conditions de médias Xeno-libre, d'une plaque à six puits avec une aiguille de calibre 18. Surtout, placer les nouveaux médias (médias combinés 2) sur les cellules avec un inhibiteur de ROCK 1x pendant 1 heure, avant repiquage d'effectuer une pré-état les médias.
- Aspirer la solution de substrat synthétique au large de la nouvelle plaque que les cellules sont transférés. Retirez tous les médias contenant les amas de cellules souches de la vieille plaque et transférer à la nouvelle plaque.
- La place des cellules de nouveau dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pour deux jours avec un minimum de perturbation physique (idéalement plaques, une fois dans l'incubateur, ne sont pas directement touchés en aucune façon) pour permettre la fixation maximale.
Note: Les cellules nécessiteront des changements quotidiens des médias. Passagin continueg tous les 4 jours seront importants. En utilisant une aiguille de calibre 21, passage que les parties de colonies avec la morphologie optimale ESC-like (rapport nucléocytoplasmique élevé). Cela permettra d'assurer la sélection pour les colonies de hiPSC appropriées qui poussent bien et finalement donneront colonies homogènes. Temps global à la dérivation de l'ESC comme colonies se situe entre 15 à 20 jours après le changement initial combiné de médias. - Geler les bas hiPSCs post-excisé de qualité GMP d'abord quadrillé toutes les colonies en utilisant une aiguille de calibre 18. Lever toutes les pièces en utilisant un large ul pipette 200 et transférer tous les médias contenant les cellules à un 15 ml flacon et centrifuger conique à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Bien que les cellules sont centrifugation, faire un support de gel consistant en des volumes égaux de deux supports combinés à froid et un milieu de congélation avec une concentration finale en DMSO de 7,5%.
- Après que les cellules sont culottées, Aspirer ancien milieu et goutte à goutte re-suspendre le culot avec les médias de congélation. Immédiatement transfert dans des flacons de gel et mis dans un congélateur à -80 ° C.
5. hiPSCs Caractérisation GMP grade post-excisées
- Pour assurer une bonne expression de marqueurs de pluripotence post-conversion, utilisez QPCR de quantifier l'expression des marqueurs de pluripotence clés (SOX2, OCT4 et NANOG) en utilisant les amorces énumérées dans le tableau 1 avec les mêmes étapes que mentionné dans l'étape 3. méthodologies de QPCR suivre la mêmes étapes énumérées à l'étape 3.
- Utilisation cytométrie en flux pour détecter l'acide sialique non humain Neu5Gc (l'acide -glycolylneuraminic N) conformément aux conditions standards listés dans la trousse comme précédemment publiée 10.
- Lavez délicatement les plaques de culture cellulaire avec des cellules en utilisant 1x phosphate salin (PBS).
- Dissocier colonies en utilisant 1x réactif de dissociation pendant 5 min à température ambiante.
- Pendant le temps d'incubation de 5 minutes de l'étape 5.4, de préparer la solution de blocage (fourni danskit) en faisant un 0,5% d'agent de blocage dans du PBS glacé.
- Étiqueter l'ensemble des tubes pour cytométrie en flux analyse suivante: Unstained; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) DAPI; anticorps de contrôle 1: 200; L'anticorps primaire 1: 200; Anticorps secondaire 1: 200 d'âne anti-Poulet IgG (H + L); MEF échantillon; Cellules post-excisée échantillon sur la matrice; et les cellules sur substrat synthétique échantillon post-excisée.
- Secouant doucement agrégats de cellules de l'étape 5.4 en ajoutant 2 ml de solution de blocage et transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger à 80 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Laver les cellules deux fois avec une solution de blocage et centrifuger comme indiqué dans l'étape 5.7.
- Remettre en suspension doucement environ 1 x 10 6 cellules dans 100 ul de solution de blocage avec le volume de dilution correspondant de chaque anticorps. Incuber avec doux balancement à 4 ° C pendant 1 heure.
- Répétez lavages trois fois à l'étape 5.8.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 400 pi de diluant Buffer (dans le kit) avec 1: 100 de DAPI pour les tubes 2, 6, 7, et 8 comme indiqué dans l'étape 5.6.
- cellules souches à travers une passoire 40 uM et traversent cytomètre de flux.
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Representative Results
Nous présentons un protocole pour dériver hiPSCs gratuitement facteur-qualité clinique en utilisant l'approche de reprogrammation base-lentiviral STEMCCA. Figure 1A montre une image représentative de trois lignes hiPSC pré-excisée différents, après la reprogrammation à l'approche STEMCCA sur une couche de MEF. Le principal avantage de l'approche de reprogrammation STEMCCA réside dans le succès de reprogrammation cohérente atteint par plusieurs scientifiques, dans les différents groupes de recherche et les emplacements. Figure 1B présente le gel transcription PCR post-excision inverse, montrant une sous-clone particulier (2.3) qui est entièrement gratuit du lentivirus STEMCCA, comme en témoigne l'absence d'une bande d'amplicon spécifique pour endogène à STEMCCA. Figure 2A une séquence particulière montre les hiPSCs pré-converti sur un xéno contenant matrice et hiPSCs de qualité GMP gratuitement xéno-excisées post sur matrice synthétique . La quantification des facteurs de pluripotence associée standards (SOX2, OCT4, et NANOG) en utilisant QPCR est illustré sur la figure 2B. HiPSCs pré-convertis et post-converti à des conditions de qualité GMP ont été testés par cytométrie en flux pour l'acide sialique de l'acide N-glycolylneuraminique, indicative d'antigènes non humains, comme le montre la figure 2C.
Figure 1: cassette de cellules souches pluripotentes humaines (hSTEMCCA) cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSC) lignes -derived représentatifs. (A) Les trois lignées dérivées ont été analysés avec la technologie nrLAM-PCR et seule la ligne C8 présenté se est révélé avoir une intégration dans le gène PRPF39. Seule cette ligne, en raison de l'intégration de coffre-fort intronique STEMCCA, a été sélectionné pour subir sélection adéno-Cre-PuroR pour l'excision à médiation par Cre. (B) adéno-Cre STEMCCA excision médiée par la ligne C8. Primers contre des séquences de nucleotides uniques trouvés dans STEMCCA-endo-Myc-l et A-WPRE- constaté que seulement une sous-clone (2,3 post-excisé iPSCs) ont été correctement excisée et dépourvu de facteurs de transcription de la transgéniques provirus intégré. Bars = 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis Awe et al. 10.
Figure 2: Conversion de hiPSCs de conditions de libre xéno-GMP de qualité clinique et la caractérisation contenant xéno-. (A) de la ligne de hiPSC Représentant qui a été converti à partir (matrice de qualité recherche) contenant de xéno-Xeno-libre (substrat synthétique) conditions selon les bonnes pratiques de fabrication actuelles (BPF) conditions. (B) quantitative polymerase chain reaction pour doser la pluripotence bon l'expression du gène associé post-conversion dans des conditions de qualité BPF. (C) Dans suppions pour les tests de stérilité standard pour assurer la compatibilité de GMP, un test de dosage à base de cytométrie de flux pour l'antigène non-humaine, l'acide -glycolylneuraminic N, est utilisé pour montrer que hiPSCs soumettre converti éliminer toute détection de l'acide sialique (1% avec post- cellules excisés sur matrice par rapport à 0% de cellules post-excisé sur un substrat synthétique). Souris fibroblastes embryonnaires et une ligne de hiPSC dérivée dans des conditions BPF servi comme contrôles positifs et négatifs, respectivement, dans cette expérience. Bars = 100 um. CSEh, les cellules souches embryonnaires humaines; PESS, post-excisé substrat synthétique; PEM, matrice post-excisée. Ce chiffre a été modifié depuis Awe et al. 10.
| Nom du gène | Forward Primer 5'-3 ' | Amorce antisens 5'-3 ' | Sonde # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tableau 1: Amorces utilisées pour l'analyse PCR quantitative.
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Discussion
Nous décrivons une méthode consistant à dériver hiPSCs libre-facteur et de les rendre cliniquement significative par la conversion de ces cellules dans des conditions de qualité GMP de différenciation cellulaire en aval dans les futurs thérapeutique humaine. Bien que ce protocole est largement applicable à une variété de types de cellules, nous avons choisi de reprogrammer les fibroblastes dermiques humains, en raison de la facilité d'extraction du patient et de leur applicabilité à la thérapeutique humaine personnalisés. Une fois les limites sont corrigées dans la mesure du plein différenciation en dérivés de cellules cliniquement pertinentes est concerné 14, la conversion présenté dans des conditions de qualité GMP deviendra encore plus pertinente à une variété de différents types de cellules.
La première partie de cette étude consiste à reprogrammer des fibroblastes humains avec le lentivirus STEMCCA. Cette technique a été choisi en grande partie en raison de sa reproductibilité, l'efficacité relativement élevé de reprogrammation (0,02%), et la capacité robuste pour reprogrammer travers l'hommedifférents types de cellules y 10. Cette technique est supérieure aux autres méthodes de reprogrammation tels que le virus Sendai, des plasmides épisomiques, et la reprogrammation synthétique à base d'ARNm qui souffrent de faibles efficacités de reprogrammation et 10 reproductibilité. Bien qu'il existe une corrélation entre vecteurs à base de VIH se intégrer dans l'augmentation des points chauds de l'activité des gènes 15, il n'y a aucune garantie qu'ils intègrent dans un gène, et encore moins dans une zone plus sûre d'un gène, l'intron. Ainsi cet obstacle représente une limitation notable à cette approche. En outre, ce site l'intégration préférence dans un endroit plus sûr génomique diminue avec plusieurs intégrations à travers le génome. Par conséquent, il est impératif que site d'intégration lentiviral bon de provirus et le numéro de l'intégration être correctement interrogés par des techniques sensibles tels que la technologie nrLAM-PCR. Reprogrammation avenir zinc utilisant la technologie doigt de nucléase, TALEN ou CRISPR / gène base-Cas9 ciblage (via homologous recombinaison) peut aussi guider dans ce domaine loci spécifiques pour reprogrammer 16.
Une fois les fibroblastes humains sont correctement reprogrammées et les colonies ont été établies, un autre aspect essentiel de ce protocole est l'expression adéno-Cre-PuroR pour la sélection des hiPSCs soumettre excisées. Il est important de tenir compte re-exposer les colonies à la puromycine après quelques semaines de culture de cellules, afin d'assurer que tout l'adénovirus a été dilué à travers la réplication cellulaire et sporadique n'a pas intégré dans le génome. Mauvaise intégration dans le génome de l'adénovirus représenterait un problème de sécurité pour les thérapies cellulaires personnalisées.
Conversion en conditions de qualité GMP est une étape importante dans l'introduction de l'applicabilité clinique à ces hiPSCs gratuitement facteur. Il est important de changer une seule condition à un moment où la conversion de ces cellules sur des conditions gratuitement xéno; commencer par convertir les cellules dans xéno-des médias libres à travers la méthode de conversion lente. Les hiPSCs ne peuvent pas tolérer un changement de support et un changement de substrat en même temps. Une fois que les cellules sont des passages régulièrement avec une morphologie normale dans les conditions nouvelles des médias, amorcer la transition sur le substrat sans xéno-. Si des types cellulaires spécifiques ont du mal à transférer plus sur le substrat recommandé, il est possible d'envisager d'essayer d'autres substrats gratuitement xéno-sur le marché.
En conclusion, l'applicabilité robuste et large de cette technique de reprogrammation avec la conversion de qualité GMP devrait permettre la reproductibilité facile et sert de fondation pour la culture cellulaire dérivée basée-hiPSC avenir pour la thérapeutique humaine.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
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