Abstract
Mit lentiviralen basierte Umprogrammierung Methoden kann Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) erzeugt werden. Jedoch Spuren von potenziell onkogenen Gene in aktiv transkribierten Regionen des Genoms übrigen, die ihr Potenzial für den Einsatz in menschlichen therapeutischen Anwendungen ein. Darüber hinaus nicht-menschlichen Antigene aus Stammzellen Neuprogrammierung oder Differenzierung in therapeutisch relevanten Derivate abgeleitet ausschließen diese hiPSCs können, in den menschlichen klinischen Kontext 2 verwendet. In diesem Video stellen wir ein Verfahren zur Umprogrammierung und Analyse von Faktor freie hiPSCs frei von exogenen Transgenen. Diese hiPSCs kann dann für die Genexpression Abnormalitäten im spezifischen Introns enthaltend das Lentivirus analysiert werden. Diese Analyse kann mit empfindlichen quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die einen Vorteil gegenüber weniger empfindlich Techniken bisher verwendet, um die Genexpression Differenzen 3 zu erkennen ist durchgeführt werden. Vollständige Umwandlung inklinischem guten Herstellungspraxis (GMP) Bedingungen, können die menschliche klinische Relevanz. Unser Protokoll bietet eine weitere Methode, sofern die aktuellen Safe-Harbour-Kriterien zu erweitern und umfassen Faktor freie dadurch gekennzeichnet hiPSC basierten Derivaten für den menschlichen therapeutischen Anwendungen zur Ableitung-GMP-grade hiPSCs, die keine Immunogenität Risiko durch nicht-menschlichen Antigene zu eliminieren sollte. Dieses Protokoll ist breit anwendbar auf lentiviralen umgewandelten Zellen jeglicher Art und stellt eine reproduzierbare Methode zur Umwandlung umgewandelten Zellen in GMP-grade Bedingungen.
Protocol
. HINWEIS: Diese Methode wurde in der Forschung im Awe et al berichteten 10 verwendet.
1. Reprogrammierung Erwachsene menschliche Fibroblasten der Haut mit STEMCCA
- Thaw Erwachsenen dermalen Fibroblasten (HUFS), Durchgang 4 oder niedriger, in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten, dabei nicht an die Spitze der Ampulle mit Wasser tauchen.
- Legen Sie die 1-ml Aufschlämmung von menschlichen Fibroblasten in einen 15-ml-Erlen Fläschchen und langsam setzen 4 ml Standard HUF Medien, auf 37 ° C vorgewärmt, in einem tropfenweise Mode, zu verdünnen aus Dimethylsulfoxid (DMSO) und resuspendieren Zellen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Saugt den Überstand und resuspendiere Zellen in einem ausreichenden Volumen an Medium, um eine Suspension von 100.000 Zellen / ml zu erstellen und dann 2 ml in ein Well einer Sechs-Well-Platte für 20 Minuten mit 0,2% Gelatine vorbeschichtet.
HINWEIS: Eine Schwester auch mit einer gleichen Anzahl von Zellen pro Zeile und Zustand muss fo ausgesät werdenr die Zellzählung / Multiplizität der Infektion (MOI) Berechnung. - Rock the Platte hin und her und hin und her, um gleichmäßige Verteilung der Zellen. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator.
- Am Tag der Weiterleitung erhalten Zellzahl (n) von der Schwester gut (e) etwa 24 Stunden nach der ersten HUF Beschichtung.
- Auftauen 2 x 10 8 TU, oder gleichwertig, lentiviralen Konzentrat (STEMCCA) und mit Wasser auf 1 x 10 8 TU / ml in HUF Medien.
- Transduzieren Zellen bei einer 10-MOI-Verhältnis in HUF Medien mit 8 ug / ml Transfektionsagens ergänzt. Mischungs transduziert Vertiefungen gleichmäßig beimpft und über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator.
- Etwa 24 Stunden nach lentivirale Transduktion, schalten Sie das HUF Medien Standard humanen pluripotenten Stammzellen (PSC) Medium.
- An den Tagen 2 bis 6, ändern Medien täglich mit menschlichen PSC Medium.
- An Tag 6 der Platte zwei 0,2% Gelatine beschichteten 10-cm-Platten von1,5 bis 1,75 x 10 6 MEFs ab CF1-Mäuse in HUF Medien 12 abgeleitet.
- Am Tag 7, darauf achtend, nicht mehr als 100 × g, Gebrauch Raumtemperatur Trypsin zentrifugieren, um von einem Brunnen der sechs-Well-Platte und Durchgang heben Sie den Tag ab 7 umprogrammiert Fibroblasten in einer 1.16-Verhältnis, durch Plattierung alle Zellen gleichmäßig auf zwei 10-cm-Platten, die mit frischen menschlichen PSC Medien, die am Vortag mit MEFs vergoldet wurden. Verteilen Zellaggregate im Uhrzeigersinn Spiralbewegung und in eine 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator über Nacht.
- Etwa 48 Stunden nach dem Aussäen der Zellen auf neu programmiert MEFs und jeden Tag danach, ändern Sie verbrachte menschlichen PSC Medien durch frische Medien.
- Nach 3 bis 4 Wochen, nehmen einzelne Kolonien mit typischer ESC artige Morphologie mit einer 21-Gauge-Nadel und Subklonierung in eine 24-Well-Platte durch Einbringen von etwa 8 bis 10 Einzelteile der spezifischen Kolonien in einzelne Vertiefungen in einer 0,2% Gelatine beschichtete 24-Well-Platte Vorimpfteilchened mit MEFs ab CF1-Mäuse in der menschlichen PSC Medium abgeleitet.
HINWEIS: Nach dem Ausbau des gepickten Kolonien haben die Kolonien als pluripotent von Embryoidkörperbildung und Expressionsanalyse von Pluripotenzmarker auf Proteinebene charakterisiert werden.
2. Vektor-Integration Standortanalyse und STEMCCA Excision
- Analysieren Sie den STEMCCA Integrationsstelle von nicht einschränkenden lineare Verstärkung PCR wie beschrieben 10.
- Nach Untersuchung auf eine Integration in einen gewünschten Bereich des Genoms, Verbrauch STEMCCA durch Absaugen von der alten menschlichen ESC Medium zu gewährleisten. Dann kombinieren 45 ul konzentrierter Adeno-Cre-PuroR Virus mit 8 ug / ml Transfektionsmittel in 3 ml Standard PSC Medien für 24 Stunden.
- Nach der 24-stündigen Inkubationszeit, absaugen des gemischten Virusüberstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit menschlichen PSC Medien. Platzieren frischen menschlichen PSC Medien zusammen mit 2 & mgr; g / ml Puromycin für einen Zeitraum von 5 Tagen, wenn der Medien täglichen with frisches Medium und Antibiotikum.
- Nach 5 Tagen Subklon verbleibenden Kolonien mit einem 21-Gauge-Nadel auf 0,2% Gelatine beschichtete Vertiefungen in einer Platte mit 12 Vertiefungen mit MEFs aus CF1mice abgeleitet vorbeschichtet und erweitern, wie oben beschrieben.
HINWEIS: Nach ausreichender Expansion eine gefrorene Lager zu erhalten, wird die Umwandlung in Feeder-freien Bedingungen erforderlich. Erwarten mindestens 95% der Stammzellkolonie Tod, da die meisten Zellen nicht erfolgreich transduziert werden und wird Antibiotikum über den Zeitraum von 5 Tagen Inkubation erliegen. Obwohl Adeno-Cre-PuroR integriert an einer 0,001 bis 1% Wirkungsgrad in Wirtschromosomen von infizierten Zellen, reexposing eine Stichprobe von Faktor freie Kolonien Puromycin 100% Zelltod zu gewährleisten wird bestätigen, keine Integration hat 13 aufgetreten. - Auftauen eines Fläschchens vorge aliquotierten Basalmembranmatrix auf Eis über einen Zeitraum von ca. 2 h (Empfehlungen des Herstellers), bis die Matrix eine Flüssigkeit und verdünnt bis zu einer Endkonzentration von 1:30 in kaltem Basalmedium. Coauf gewünschte Anzahl von Vertiefungen in einer Sechs-Well-Platte mit 1 ml pro Vertiefung. Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
- Gitterschnitt (mit einer 18-Gauge-Nadel oder ein Glas oder Kunststoff "tip") mindestens 20 bis 30 Kolonien, die von einem gut vorher mit MEFs beschichtet. Achten Sie darauf, zu reduzieren MEF erhebend und übertragen von der Platte.
- Generieren Sie die Schraffur-Gerät durch eine Reihe verschiedener Ansätze, von der komplizierter Heizung, ziehen, und Veredelung von Glas Pasteurpipette in offene Flamme, die einfache Verwendung einer sterilen Kunststoffpipettenspitze oder, wie in unserem Fall, 21- und / oder 18-Gauge-Nadeln.
- Saugen Sie die Matrix aus dem beschichteten auch nach der Inkubation.
- Stücke der Kolonien zu entfernen durch vorsichtiges Abschaben von der alten Platte mit einem 200-ul-Pipette und vorsichtig in 3 ml frischem kombinierten Medien 1 in der Matrix beschichtete Platte zu platzieren. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator. Medienwechsel 48 h nach der Passage.
- Extrahieren genomischer DNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs, bei mehr als 80% Konfluenz, mit kommerziellen DNA-Extraktion-Kits.
- Analysieren Sie für die richtige Exzision mit für exogene Integrationen des STEMCCA Lentivirus Primer: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-Rückwärts, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Rekonstituieren Sie lyophilisierte Primer mit PCR-grade Wasser zu einer 10-uM Stammlösung.
- Führen Sie einen PCR mit den folgenden fünfstufigen Protokoll: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 3 min; 35 Zyklen von jeweils der folgenden: Denaturierung bei 98 ° C für 20 sec, Primer-Annealing bei 62 ° C für 15 sec, und Verlängerung bei 72 ° C für 15 sec; gefolgt von einem einzigen Zyklus abschließenden Extension bei 72 ° C für 3 min.
- Machen Sie eine 3% Agarosegel durch Auswiegen 1,5 Gramm Agarose und stellen Sie es in 50 ml 1x Tris-Acetat-EDTA-Puffer. Mikrowelle bis Agarose aufgelöst und in DNA-Gel-Färbung bei pRoper Verdünnung mischen und verzichten richtige Volumen in Gelkassette für 1 Stunde bei Raumtemperatur verfestigen.
- Last 12 ul PCR-Produkt mit 3 & mgr; l Ladepuffer gemischt und zu einer 3% igen Agarose-Gel. Führen Sie das Gel für 30 min bei 80 V.
- Visualisieren Sie mit UV-Licht für die Abwesenheit einer Bande, die richtige Entfernung.
3. Die Quantifizierung der Genexpression Unterschiede mithilfe von Quantitative PCR von Pre- und Post-geschnitten hiPSCs
- Auszug Gesamt-RNA aus postherausgeschnitten und Feeder-freien konvertierten hiPSCs mit Hilfe von kommerziellen RNA-Extraktion-Kits.
- Reverse Transkription und bis zu 1 ug Gesamt-RNA von mit kommerziellen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden verankerten Oligo (dT) 18 und Random Hexamer Primer.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die PCR-Protokoll ist für die Gen-Transkripte von mehr als oder weniger als 4 kb zugeschnitten. Spezifische Primer müssen jedoch für alle Gen STEMCCA ursprünglich integriert i gemacht werdennto. - Rekonstituieren Sie den lyophilisierten Primer PCR-grade Wasser zu einer 20 uM Stammlösung.
- Verwenden Sie 5 ng der Probe pro 20 ul Reaktion, die von 10 uM UPL Sonde besteht, 2x LightCycler® 480 Probes Meister, und 20 & mgr; M Vorwärts- und Rückwärtsprimer.
4. Umwandlung in GMP-grade Bedingungen
- Am ersten Tag der Umstellung der Post-geschnitten hiPSCs über den GMP-Grade-Bedingungen, machen eine Mischung aus Medien, die aus menschlichen PSC kombiniert Medien 1 (kombinierte Medien 1) und klinischer Qualität der guten Herstellungspraxis (GMP) kompatible Medien (kombinierte Medien 2 ) in einem Verhältnis von 80:20.
- Absaugen der alten kombinierten Medien ein und legen Sie 3 ml der neuen kombinierten Medien 1 und 2 vorgewärmten, im Verhältnis von 80:20. Medien ändern sich täglich für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
- Am Tag 4, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 50:50. Absaugen des alten Mediums und replace mit vorgewärmtem Medium, mit den zusammengeführten Medien 1 und 2 im Verhältnis 50:50. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
- Am Tag 7, stellen die zusammengeführten Medien 1 und 2 in einem Verhältnis von 20:80. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmten Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 20:80 Verhältnis. Änderungsmedien für 3 Tage mit diesem bestimmten Verhältnis. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
- Am Tag 10, stellen die kombinierten Medien 1 und 2 zu einem 0: 100 Verhältnis. Absaugen des alten Mediums und Ersetzen mit vorgewärmter Medien, mit den kombinierten Medien 1 und 2 an der 0: 100 Verhältnis. Ändern Medien jeden Tag an diesem bestimmten Verhältnis. Die Zellen sind nun in vollständig definiert Xeno-freien Medien. Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
HINWEIS: Während dieser gesamten Umwandlungsprozess wird Routine Passagieren mit einer 18-Gauge-Nadel für eine einwandfreie Kolonie Größe und Dichte zu erhalten. Plan für passaging Zellen alle 4 bis 5 Tage auf der Grundlage der Koloniegröße, Konfluenz und Differenzierung. - Coat eine Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit einer definierten xeno freien Substrat, wie vom Hersteller empfohlen.
- Mechanisch Gang ein konfluenter gut, bereits umgewandelt Xeno freien Medien Bedingungen, von einem Sechs-Well-Platte mit einer 18-Gauge-Nadel. Wichtig ist, legen Sie die neuen Medien (kombinierte Medien 2) auf die Zellen mit 1x ROCK-Hemmer für 1 Stunde, bevor Passage vor, eine Bedingung die Medien.
- Saugen Sie das synthetische Substrat-Lösung aus der neuen Platte, dass die Zellen, die sich zu übergeben. Entfernen Sie alle Medien, die die Stammzellklumpen von der alten Platte und Transfer zum neuen Platte.
- Ortszellen wieder in einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 2 Tage bei minimalem physische Störungen (idealerweise Platten, einmal im Inneren Inkubator nicht direkt in keiner Weise berührt), um maximale Befestigung ermöglichen.
HINWEIS: Die Zellen werden täglich Medien Änderungen erfordern. Kontinuierliche passaging alle 4 Tage wird wichtig sein. Mit einer 21-Gauge-Nadel, Durchgang nur die Teile der Kolonien mit optimalen ESC-ähnliche Morphologie (Hoch nukleozytoplasmatischen Verhältnis). Dies wird für die richtige Auswahl hiPSC Kolonien, die gut wachsen wird und schließlich ergeben homogene Kolonien zu gewährleisten. Insgesamt Zeit, Ableitung von ESC artige Kolonien zwischen 15-20 Tage nach der ersten kombinierten Medienwechsel. - Frieren Sie sich die GMP-Grade postgeschnitten hiPSCs vom ersten Gitterschnitt all der Kolonien mit Hilfe eines 18-Gauge-Nadel. Nehmen Sie alle Teile aus mit Hilfe eines 200 ul Pipette und übertragen alle Medien mit den Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Während die Zellen zentrifugiert, einen Gefriermedien, bestehend aus gleichen Volumen kalter kombinierten Medien 2 und Gefriermediums mit einer DMSO-Endkonzentration von 7,5%.
- Nachdem die Zellen pelletiert, absaugen alte Medium und tropfenweise resuspendieren Sie das Pellet mit den gefrierenden Medien. Unmittelbar transfer zu Einfrierröhrchen und in einem -80 ° C Gefrierschrank gelegt.
5. Charakterisierung GMP-Grade-Post-geschnitten hiPSCs
- Um eine korrekte Ausdruck Pluripotenzmarker nach Umwandlung zu gewährleisten, verwenden QPCR um die Expression von Schlüssel Pluripotenzmarker (SOX2, OCT4 und NANOG) unter Verwendung der in Tabelle 1 mit den gleichen Schritten aufgeführten Primer quantifizieren wie in Schritt 3 QPCR Methoden erwähnt folgen der gleichen Schritte wie in Schritt 3 aufgeführt.
- Verwendung der Durchflusszytometrie, um die nicht-menschlichen Sialinsäure Neu5Gc (N -glycolylneuraminic Säure) in Übereinstimmung mit in dem Kit enthalten sind, wie zuvor veröffentlicht am 10. Standardbedingungen zu erfassen.
- Wäsche leicht die Zellkulturplatten mit Zellen unter Verwendung 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Distanzieren Kolonien durch Verwendung 1x Dissoziation Reagenz für 5 min bei Raumtemperatur.
- Während der 5-min Inkubationszeit von Schritt 5.4, bereiten Sie die Blockierungslösung (in bereitgestelltKit), indem sie eine 0,5% Blockierungsmittel in eiskaltem PBS.
- Beschriften Sie den folgenden Satz von Rohren für die Durchflusszytometrie-Analyse: Ungefärbte; 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) DAPI; Kontroll-Antikörper 1: 200; Primärer Antikörper 1: 200; Sekundäre Antikörper 1: 200 Esel Anti-Huhn-IgG (H + L); Beispiel MEFs; Beispielpostgeschnitten Zellen auf Matrix; und Sample Postgeschnitten Zellen auf synthetische Substrat.
- Sanft verdrängen Zellaggregate von Schritt 5.4 durch Zugabe von 2 ml Blockierungslösung und Transfer Inhalt in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren bei 80 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Mit Blockierlösung und zentrifugiert wie in Schritt 5.7 fest Waschen Sie die Zellen zweimal.
- Vorsichtig resuspendieren etwa 1 x 10 6 Zellen in 100 & mgr; l Blockierlösung mit dem entsprechenden Verdünnungsvolumen von jedem Antikörper. Inkubiere unter leichtem Schütteln bei 4 ° C für 1 Stunde.
- Wiederholen wäscht dreimal wie in Schritt 5.8.
- Resuspendieren das Zellpellet in 400 ul Verdünnungspuffer Buffer (aus Kit) mit 1: 100 von DAPI für Rohre 2, 6, 7 und 8 wie unter Punkt 5.6 aufgeführt.
- Stamm Zellen durch ein 40 & mgr; M Sieb und Durchfluss-Zytometer laufen.
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Representative Results
Wir präsentieren ein Protokoll zur Ableitung klinischem Faktor freie hiPSCs mit der STEMCCA lentiviralen basierte Umprogrammierung. 1A zeigt ein repräsentatives Bild der drei vorgeschnitten hiPSC Linien nach Neuprogrammierung mit dem STEMCCA Ansatz auf einer Schicht aus MEFs. Der Hauptvorteil der STEMCCA Umprogrammierung Ansatzes liegt in der konsequenten Neuprogrammierung Erfolg von mehreren Wissenschaftlern erreicht, in verschiedenen Forschungsgruppen und Standorte. 1B stellt die Post-Exzision reverse Transkription-PCR-Gel, welches ein besonders Subklon (2.3), die völlig frei ist vom STEMCCA Lentivirus, wie durch das Fehlen eines Amplikons band spezifisch für eine bestimmte Sequenz endogen STEMCCA. 2A belegt zeigt die vorgeführt hiPSCs auf xeno Matrix und post exzidiert xeno freien GMP-grade hiPSCs auf synthetischen Matrix, enthaltend . Die Quantifizierung der Standard Pluripotenz-assoziierten Faktoren (SOX2, OCT4 und NANOG) mithilfe qPCR ist in 2B dargestellt. Vorkonvertierten und post umgewandelt hiPSCs GMP-grade Bedingungen wurden durch Durchflusszytometrie für die Sialinsäure N-Glycolylneuraminsäure anzeigt nichtmenschliche Antigene getestet, wie in 2C gezeigt.
Abbildung 1: Vertreter menschliche pluripotente Stammzelle Kassette (hSTEMCCA) stammenden menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) Linien. (A) Alle drei abgeleiteten Linien wurden mit nrLAM-PCR-Technologie untersucht und nur die präsentierte C8 Linie wurde festgestellt, dass eine Integration in den PRPF39 Gens aufweisen. Nur diese Leitung aufgrund der sicheren Intron STEMCCA Integration wurde ausgewählt, um Adeno-Cre-PuroR Auswahl für Cre-vermittelte Exzision unterzogen. (B) Adeno-Cre vermittelte STEMCCA Exzision aus dem C8 Zeile. Primers gegen einzigartigen Nukleotidsequenzen in STEMCCA-endo-Myc-s und A-WPRE- gefunden, dass nur ein Subklon (2.3 Postgeschnitten iPS-Zellen) wurden ordnungsgemäß ausgeschnitten und frei von transgenen Transkriptionsfaktoren aus dem integrierten Provirus. Balken = 100 um. Diese Zahl hat sich von Awe et al. 10 geändert.
Abbildung 2: Umwandlung von hiPSCs von Xeno-enthält, klinischer Qualität GMP Xeno freien Bedingungen und Charakterisierung. (A) Vertreter hiPSC Linie, die von Xeno-haltigen (Forschung Grade Matrix) umgewandelt wurde, um Xeno frei (synthetisches Substrat) Bedingungen, unter gegenwärtigen guten Herstellungspraxis (GMP) Bedingungen. (B) Quantitative Polymerase-Kettenreaktion, um Test für die richtige Pluripotenz assoziierter Genexpression nach Umwandlung in GMP Grade Bedingungen. (C) In additIonen den Standardsterilitätstests GMP Kompatibilität zu gewährleisten, eine Durchflusszytometrie basierenden Assay Testen auf die nicht-menschliche Antigen, N -glycolylneuraminic Säure wird verwendet, um zu zeigen, dass nach der Beseitigung aller umgewandelt hiPSCs Sialinsäure Erkennung (1% mit post- geschnitten Zellen auf Matrix im Vergleich zu 0% mit postgeschnitten Zellen auf einem Kunststoffträger). Maus embryonale Fibroblasten und ein hiPSC Linie unter GMP-Bedingungen abgeleitet diente als Positiv- und Negativkontrollen, bzw. in diesem Experiment. Balken = 100 um. hESC, mit menschlichen embryonalen Stammzellen; PESS, post-synthetische Substrat herausgeschnitten; PEM, Post-Matrix herausgeschnitten. Diese Zahl hat sich von Awe et al. 10 geändert.
| Gen-Name | Forward Primer 5'-3 ' | Reverse-Primer 5'-3 ' | Probe # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tabelle 1: Primer für die quantitative PCR-Analyse verwendet.
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Discussion
Wir beschreiben eine Methode zur Ableitung Faktor freie hiPSCs und macht sie durch die Umwandlung dieser Zellen in GMP-grade Bedingungen für Downstream-Zelldifferenzierung in Zukunft Humantherapeutika klinisch relevant. Obwohl dieses Protokoll ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Zelltypen, wählten wir humane dermale Fibroblasten umprogrammieren, aufgrund der Einfachheit der Entnahme aus dem Patienten und ihre Anwendbarkeit auf personalisierten menschliche Therapeutika. Sobald Einschränkungen soweit vollständige Differenzierung in klinisch relevanten Zellderivate behoben ist besorgt 14, die dargestellt Umwandlung in GMP-grade Bedingungen wird noch relevant für eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen entstehen.
Der erste Teil der Studie umfasst Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem STEMCCA Lentivirus. Diese Technik wurde zum großen Teil aufgrund ihrer Reproduzierbarkeit, relativ hohe Umprogrammierung Effizienz (0,02%), und robuste Möglichkeit, für Menschen umprogrammieren gewählteny verschiedene Zelltypen 10. Dieses Verfahren ist besser als andere Umprogrammierung Methoden wie Sendai-Virus, episomalen Plasmiden und synthetische mRNA basierend Neuprogrammierung, die aus unteren Umprogrammierung Effizienz und Reproduzierbarkeit 10 leiden. Zwar gibt es eine Korrelation zwischen HIV-basierten Vektoren die Integration in erhöhte Genaktivität Hotspots 15, gibt es keine Garantie, dass sie in ein Gen, viel weniger in einer sichereren Umgebung eines Gens, das Intron zu integrieren. Damit dieses Hindernis stellt eine bemerkenswerte Einschränkung dieses Ansatzes. Außerdem ist diese Integrationsstelle bevorzugt in eine sicherere genomischen Lage nimmt mit mehr Integrationen über das Genom. Daher ist es zwingend notwendig, dass die richtige lentiviralen Provirus Integrationsstelle und Integrations Anzahl von empfindlichen Techniken wie nrLAM-PCR-Technologie richtig abgefragt werden. Zukünftige Umprogrammierung Verwendung Zinkfingernukleasen Technologie TALEN oder CRISPR / Cas9 basierte Gen-Targeting (via homologous Rekombination) kann weiter leiten Sie dieses Feld in spezifische Loci zum Umprogrammieren 16.
Sobald die menschlichen Fibroblasten richtig programmiert und Kolonien gewonnen wurden, ein weiterer kritischer Aspekt dieses Protokolls liegt in dem Adeno-Cre-PuroR Expression zur Selektion von Post exzidiert hiPSCs. Es ist wichtig zu berücksichtigen Wiederfreilegen der Kolonien Puromycin nach wenigen Wochen der Zellkultur, um sicherzustellen, daß all das Adenovirus wurden im Rahmen der Zellreplikation verdünnt und noch nicht vereinzelt, in das Genom integriert. Unsachgemäße Integration in das Genom des Adenovirus würde ein Sicherheitsrisiko für personalisierte zellulären Therapeutika darstellen.
Die Umrechnung in GMP-grade Bedingungen ist ein wichtiger Schritt bei der Einführung klinische Anwendbarkeit dieser Faktor freie hiPSCs. Es ist wichtig, nur eine Bedingung zu einer Zeit zu ändern, wenn die Umwandlung dieser Zellen über den xeno freien Bedingungen; starten, indem man die Zellen in fremdenfreien Medien durch die langsame Umwandlung Methodik. Die hiPSCs können nicht dulden, ein Medienwechsel und eine Substratwechsel gleichzeitig. Sobald die Zellen regelmäßig mit normaler Morphologie in den neuen Medien Bedingungen Passagieren, beginnen, den Übergang in die Xeno-freien Substrat. Wenn spezifische Zelltypen haben Probleme Übertragung über auf den empfohlenen Substrat ist es möglich, sollten Sie versuchen, andere Xeno-freien Substraten auf dem Markt.
Abschließend sollte die robuste und breite Anwendbarkeit dieser Umprogrammierung Technik zusammen mit dem GMP-grade Umwandlung einfach Reproduzierbarkeit ermöglichen und dient als Grundlage für die künftige hiPSC basierte derivative Zellkultur für Humantherapeutika.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
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- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
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