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Biology

की व्युत्पत्ति और विशेषता एक transgene मुक्त मानव प्रेरित pluripotent परिभाषित क्लीनिकल ग्रेड की स्थिति में सेल लाइन और रूपांतरण स्टेम

Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52158
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

Abstract

मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) lentiviral आधारित reprogramming के तरीके के साथ उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि, जीनोम के लिए सक्रिय रूप से लिखित क्षेत्रों में शेष संभावित oncogenic जीनों के निशान, मानव चिकित्सीय अनुप्रयोगों एक में उपयोग के लिए अपनी क्षमता की सीमा। इसके अतिरिक्त, उपचारात्मक प्रासंगिक डेरिवेटिव में स्टेम सेल reprogramming या भेदभाव से व्युत्पन्न गैर मानव एंटीजन एक मानव नैदानिक ​​संदर्भ 2 में इस्तेमाल किया जा रहा से इन hiPSCs रोकता। इस वीडियो में, हम reprogramming और exogenous transgenes की मुक्त कारक मुक्त hiPSCs का विश्लेषण करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। ये hiPSCs तो lentivirus युक्त विशिष्ट Intron में जीन की अभिव्यक्ति असामान्यताओं के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। इस विश्लेषण में पहले जीन अभिव्यक्ति मतभेद तीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल कम संवेदनशील तकनीकों पर एक फायदा है जो संवेदनशील मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), का उपयोग किया जा सकता है। में पूर्ण रूपांतरणनैदानिक ​​ग्रेड अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) की स्थिति, मानव नैदानिक ​​प्रासंगिकता अनुमति देता है। हमारी प्रोटोकॉल प्रदान करता है एक और कार्यप्रणाली-प्रदान की मौजूदा सुरक्षित बंदरगाह मापदंड का विस्तार करने और मानव चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए न होने के कारण मानव एंटीजन को किसी भी प्रतिरक्षाजनकता जोखिम को खत्म करना चाहिए जो जीएमपी ग्रेड hiPSCs, पाने के लिए कारक मुक्त विशेषता hiPSC आधारित डेरिवेटिव शामिल होंगे। इस प्रोटोकॉल के किसी भी प्रकार के lentiviral reprogrammed कोशिकाओं के लिए मोटे तौर पर लागू है और जीएमपी ग्रेड स्थितियों में reprogrammed कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका प्रदान करता है।

Protocol

नोट:। इस विधि श्रद्धा एट अल 10 में रिपोर्ट अनुसंधान में इस्तेमाल किया गया था।

STEMCCA साथ 1. Reprogramming वयस्क मानव त्वचीय Fibroblasts

  1. पिघलना वयस्क त्वचीय मानव fibroblasts (एचयूएफ), 2 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पारित होने के चार या कम, पानी के साथ शीशी के शीर्ष डूब नहीं ख्याल रख रही है।
  2. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी में मानव fibroblasts की एक मिलीलीटर घोल रखें और धीरे धीरे एक बूंद के लिहाज से फैशन में, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म मानक एचयूएफ मीडिया के 4 मिलीलीटर जगह है, डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) बाहर पतला और करने के लिए फिर से निलंबित कोशिकाओं।
  3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 XG पर शीशी अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और / एमएल 100,000 कोशिकाओं का एक निलंबन पैदा करने के लिए मीडिया के एक पर्याप्त मात्रा में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और फिर एक छह अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, 0.2% जिलेटिन के साथ 20 मिनट के लिए पूर्व लेपित।
    नोट: रेखा और हालत प्रति कोशिकाओं की एक समान संख्या के साथ अच्छी तरह से एक बहन के लिए वरीयता प्राप्त करने की आवश्यकता हैआर सेल गिनती / संक्रमण (MOI), गणना की बहुलता।
  4. समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए आगे और पीछे की ओर है और थाली की ओर रॉक। एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर रातोंरात सेते हैं।
  5. पारगमन के दिन, सेल बहन से गणना (ओं) को अच्छी तरह से प्रारंभिक एचयूएफ चढ़ाना के बाद (एस) के लगभग 24 घंटा प्राप्त करते हैं।
  6. 2 एक्स 10 8 टीयू, या समकक्ष, lentiviral ध्यान (STEMCCA) बाहर पिघलना और एचयूएफ मीडिया में 1 एक्स 10 8 टीयू / मिलीलीटर पतला।
  7. 8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / अभिकर्मक एजेंट के साथ पूरक एचयूएफ मीडिया में एक 10-MOI के अनुपात में कोशिकाओं transduce। समान रूप से transduced कुओं मिक्स और एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर रातोंरात सेते हैं।
  8. Lentiviral पारगमन के बाद लगभग 24 घंटा, मानक मानव स्टेम सेल (पीएससी) मध्यम करने के लिए एचयूएफ मीडिया स्विच।
  9. दिन 2 से 6 पर, मानव पीएससी के माध्यम से दैनिक मीडिया बदल जाते हैं।
  10. 6 दिन के दो 0.2% जिलेटिन लेपित 10 सेमी प्लेटें थालीएचयूएफ मीडिया 12 में CF1 चूहों से व्युत्पन्न 1.5 10 एक्स 1.75 से 6 MEFs।
  11. दिन 7 पर, सावधान होने के बीच समान रूप से सभी कोशिकाओं चढ़ाना द्वारा एक 01:16 के अनुपात में छह अच्छी तरह से थाली और पारित होने के एक अच्छी तरह से दिन 7 reprogrammed fibroblasts के बंद लिफ्ट करने के लिए 100 से अधिक XG, उपयोग के कमरे के तापमान ट्रिप्सिन अपकेंद्रित्र के लिए नहीं एक दिन पहले MEFs साथ चढ़ाया गया है कि ताजा मानव पीएससी मीडिया, के साथ दो 10 सेमी प्लेटें,। एक 37 डिग्री सेल्सियस में एक घड़ी की सर्पिल आंदोलन और जगह में सेल समुच्चय बांटो, 5% सीओ 2 रातोंरात इनक्यूबेटर humidified।
  12. लगभग 48 घंटा तत्पश्चात MEFs और हर दिन पर reprogrammed कोशिकाओं बोने के बाद, ताजा मीडिया के साथ बिताए मानव पीएससी मीडिया बाहर बदल जाते हैं।
  13. 3 से 4 सप्ताह के बाद, एक 21 गेज सुई के साथ आकृति विज्ञान जैसे ठेठ ईएससी के साथ अलग-अलग कालोनियों लेने और एक 0.2% जिलेटिन लेपित में अलग-अलग कुओं में विशिष्ट कालोनियों के लगभग 8 से 10 व्यक्तिगत टुकड़े रखकर एक 24 अच्छी तरह से थाली में बाहर subclone 24 अच्छी तरह से थाली पूर्व बीजमानव पीएससी माध्यम में CF1 चूहों से ली गई MEFs के साथ एड।
    नोट: उठाया कालोनियों के विस्तार के बाद, कालोनियों प्रोटीन के स्तर पर embryoid शरीर गठन और pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति विश्लेषण द्वारा pluripotent विशेषता के रूप में किया जाना है।

2. वेक्टर एकता साइट विश्लेषण और STEMCCA छांटना

  1. 10 में वर्णित के रूप में गैर प्रतिबंधात्मक रैखिक प्रवर्धन पीसीआर द्वारा STEMCCA एकीकरण साइट का विश्लेषण।
  2. पुराने मानव ईएससी मध्यम बंद aspirating द्वारा जीनोम, आबकारी STEMCCA के एक वांछित क्षेत्र में एक एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए परख करने की क्रिया के बाद। फिर, 24 घंटा के लिए मानक पीएससी मीडिया के 3 मिलीलीटर में 8 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / अभिकर्मक एजेंट के साथ केंद्रित एडिनो Cre-PuroR वायरस के 45 μl गठबंधन।
  3. 24 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद, मिश्रित वायरल सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण और मानव पीएससी मीडिया के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें। 5 दिन की अवधि के लिए 2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / puromycin के साथ ताजा मानव पीएससी मीडिया प्लेस मीडिया दैनिक बुद्धि बदलतेएच ताजा मीडिया और एंटीबायोटिक।
  4. 5 दिनों के बाद, subclone एक 12 अच्छी तरह से थाली में, 0.2% जिलेटिन लेपित कुओं पर एक 21 गेज सुई के साथ कालोनियों शेष CF1mice से निकाली गई MEFs साथ पूर्व लेपित और ऊपर विस्तृत रूप में विस्तार।
    नोट: पर्याप्त विस्तार एक जमे हुए शेयर प्राप्त करने के बाद, फीडर मुक्त परिस्थितियों में रूपांतरण के लिए आवश्यक है। सबसे कोशिकाओं को सफलतापूर्वक transduced नहीं किया जाएगा और ऊष्मायन के 5 दिन की अवधि में एंटीबायोटिक का शिकार होगा के रूप में कम से कम 95% स्टेम सेल कॉलोनी मौत की अपेक्षा करें। एडिनो Cre-PuroR कारक मुक्त कालोनियों का एक नमूना reexposing, संक्रमित कोशिकाओं के मेजबान गुणसूत्रों में एक .001-1% दक्षता पर एकीकृत करता है हालांकि कोई एकीकरण 13 उत्पन्न हुई पुष्टि करेगा 100% कोशिका मृत्यु सुनिश्चित करने के लिए puromycin करने के लिए।
  5. मैट्रिक्स एक तरल है जब तक लगभग दो घंटा (निर्माता की सिफारिशों) की अवधि में, बर्फ पर पूर्व aliquoted तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की एक शीशी बाहर गला लें और ठंडा बेसल मीडिया में 01:30 के अंतिम एकाग्रता के लिए बाहर पतला। सहअच्छी तरह से प्रति 1 एमएल के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली में कुओं की वांछित संख्या में। 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं।
  6. एक अच्छी तरह से पहले से MEFs के साथ लेपित से 30 कालोनियों के लिए कम से कम 20 (एक 18 गेज सुई, या एक कांच या प्लास्टिक "टिप" का प्रयोग करके) क्रॉस हैच। MEF उत्थान को कम करने और थाली से स्थानांतरित करने के लिए सावधान रहें।
    1. एक बाँझ प्लास्टिक विंदुक टिप के सरल उपयोग करने के लिए, एक खुला लौ पर, और अधिक जटिल हीटिंग से, अलग अलग दृष्टिकोण के एक नंबर के माध्यम से एक गिलास पाश्चर विंदुक की खींच, और परिष्करण पार अंडे सेने डिवाइस उत्पन्न या, हमारे मामले में, के रूप में 21- और / या 18 गेज सुई।
  7. लेपित अच्छी तरह से करने के बाद गर्मी से मैट्रिक्स aspirate।
  8. एक 200 μl pipettor के साथ पुराने थाली से कोमल scraping द्वारा कालोनियों के टुकड़े निकालें और ध्यान मैट्रिक्स में लिपटे थाली में ताजा संयुक्त मीडिया एक के 3 मिलीलीटर में जगह है। एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं। बदले मीडिया 48 घंटा passaging के बाद।
  9. वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर अधिक से अधिक 80% confluency पर, excised-पोस्ट और फीडर से मुक्त परिवर्तित hiPSCs से जीनोमिक डीएनए निकालने।
  10. STEMCCA lentivirus के बहिर्जात एकीकरण के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ उचित छांटना के लिए विश्लेषण: gDNA-hendo-MycS-आगे, 5'-acgagcacaagctcacctct -3 '; gDNA-hWPRE-रिवर्स, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '। एक 10 माइक्रोन शेयर समाधान करने के लिए पीसीआर ग्रेड पानी के साथ lyophilized प्राइमरों पुनर्गठित।
  11. निम्नलिखित पांच कदम प्रोटोकॉल के साथ एक पीसीआर चलाएँ: प्रारंभिक विकृतीकरण 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर; 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, और विस्तार के लिए 62 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड, प्राइमर annealing के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण;: निम्न में से प्रत्येक के 35 चक्रों 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक एकल चक्र अंतिम विस्तार के द्वारा पीछा किया।
  12. Agarose के 1.5 ग्राम से बाहर वजन और 50 मिलीलीटर 1x Tris- एसीटेट-EDTA के बफर में रखकर एक 3% agarose जेल बनाओ। जब तक agarose माइक्रोवेव भंग और डीएनए जेल दाग में जगह पी में हैनट कमजोर पड़ने, मिश्रण, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जमना को जेल कैसेट में उचित मात्रा बांटना।
  13. पीसीआर उत्पाद का लोड 12 μl एक 3% agarose जेल में लोड हो रहा है डाई के 3 μl के साथ मिलाया। 80 वी में 30 मिनट के लिए जेल भागो
  14. उचित छांटना का संकेत एक बैंड के अभाव के लिए पराबैंगनी प्रकाश के साथ कल्पना।

पूर्व और बाद excised hiPSCs से मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग करके जीन एक्सप्रेशन मतभेद की 3. Quantitation

  1. वाणिज्यिक शाही सेना निकासी किट का उपयोग करके excised-पोस्ट और फीडर से मुक्त परिवर्तित hiPSCs से कुल शाही सेना निकालें।
  2. रिवर्स नक़ल निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक किट का उपयोग करके कुल शाही सेना के एक माइक्रोग्राम प्रति अप करने के लिए। लंगर-oligo (डीटी) 18 और यादृच्छिक hexamer प्राइमरों का प्रयोग करें।
    नोट: पीसीआर प्रोटोकॉल 4 KB से अधिक से अधिक या कम के जीन टेप के लिए सिलवाया है कि सुनिश्चित करें। विशिष्ट प्राइमरों जो भी जीन STEMCCA मूल एकीकृत मैं के लिए किए जाने की जरूरत होगीNto।
  3. एक 20 माइक्रोन शेयर समाधान करने के लिए पीसीआर ग्रेड पानी के साथ lyophilized प्राइमर पुनर्गठित।
  4. 10 माइक्रोन UPL जांच के होते हैं कि प्रतिक्रिया के 20 μl, 2x LightCycler 480 जांच मास्टर प्रति नमूने के 5 एनजी का प्रयोग करें, और आगे 20 माइक्रोन और प्राइमरों रिवर्स।

जीएमपी ग्रेड की स्थिति में 4. रूपांतरण

  1. जीएमपी ग्रेड शर्तों खत्म करने के लिए पोस्ट-excised hiPSCs संक्रमण का पहला दिन, संयुक्त मानव पीएससी से मिलकर मीडिया के एक मिश्रण बनाने के मीडिया 1 (संयुक्त मीडिया 1) और नैदानिक ​​ग्रेड अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) के अनुरूप मीडिया (संयुक्त मीडिया 2 ) एक 80:20 के अनुपात में।
  2. महाप्राण पुराने संयुक्त मीडिया एक और 80:20 के अनुपात में नए संयुक्त मीडिया 1 और 2, पूर्व गर्म के 3 मिलीलीटर, जगह बंद। इस विशिष्ट अनुपात के साथ तीन दिनों के लिए दैनिक मीडिया बदलें। वापस एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेस कोशिकाओं।
  3. 4 दिन, 50:50 अनुपात में संयुक्त मीडिया 1 और 2 बनाते हैं। पुराने मध्यम और replac बंद महाप्राण50:50 अनुपात में संयुक्त मीडिया 1 और 2 के साथ पूर्व गर्म मीडिया, के साथ ई। इस विशिष्ट अनुपात के साथ तीन दिनों के लिए मीडिया को बदलें। वापस एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेस कोशिकाओं।
  4. दिन 7 पर, एक 20:80 अनुपात में संयुक्त मीडिया 1 और 2 बनाते हैं। महाप्राण पुराने मध्यम बंद और 20:80 के अनुपात में संयुक्त मीडिया 1 और 2 के साथ, पूर्व गर्म मीडिया के साथ बदलें। इस विशिष्ट अनुपात के साथ तीन दिनों के लिए मीडिया को बदलें। वापस एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेस कोशिकाओं।
  5. 100 अनुपात: 10 दिन पर, एक शून्य पर संयुक्त मीडिया 1 और 2 बनाते हैं। महाप्राण पुराने मध्यम से दूर है और शून्य में संयुक्त मीडिया 1 और 2 के साथ, पूर्व गर्म मीडिया के साथ की जगह: 100 के अनुपात। इस विशिष्ट अनुपात में हर दिन मीडिया बदलें। कोशिकाओं को पूरी तरह परिभाषित Xeno मुक्त मीडिया में अब कर रहे हैं। वापस एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेस कोशिकाओं।
    नोट: इस पूरे रूपांतरण की प्रक्रिया के दौरान, एक 18 गेज सुई के साथ दिनचर्या passaging के उचित कॉलोनी आकार और घनत्व को बनाए रखने की जरूरत है। पी पर योजनाकॉलोनी आकार, confluency, और भेदभाव के आधार पर हर 4 से 5 दिनों कोशिकाओं assaging।
  6. निर्माता से सिफारिश के रूप में एक परिभाषित Xeno मुक्त सब्सट्रेट के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से कोट एक।
  7. यंत्रवत् पारित होने के एक मिला हुआ अच्छी तरह से, पहले से ही एक 18 गेज सुई के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली से, Xeno से मुक्त करने के लिए मीडिया शर्तों बदल दिया। महत्वपूर्ण बात है, मीडिया हालत के लिए पूर्व passaging से पहले, 1 घंटे के लिए 1x रॉक अवरोध करनेवाला के साथ कोशिकाओं पर नए मीडिया (संयुक्त मीडिया 2) रखें।
  8. कोशिकाओं को स्थानांतरित किया जा रहा है कि नए थाली से दूर सिंथेटिक सब्सट्रेट समाधान aspirate। पुराने थाली से स्टेम सेल clumps युक्त सभी मीडिया निकालें और नई प्लेट को हस्तांतरण।
  9. (एक बार इनक्यूबेटर अंदर, सीधे किसी भी तरह से नहीं छुआ गया है आदर्श प्लेटें,) वापस कम से कम शारीरिक अशांति के साथ दो दिनों के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेस कोशिकाओं अधिकतम कुर्की की अनुमति है।
    नोट: प्रकोष्ठों दैनिक मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता होगी। नित्य passaginजी हर 4 दिन महत्वपूर्ण होगा। एक 21 गेज सुई, इष्टतम ईएससी-जैसे आकृति विज्ञान (उच्च nucleocytoplasmic अनुपात) के साथ कालोनियों के पारित होने के केवल कुछ हिस्सों का उपयोग करना। यह अच्छी तरह से विकसित और अंततः समरूप कालोनियों निकलेगा कि उचित hiPSC कालोनियों के लिए चयन सुनिश्चित करेगा। कालोनियों की तरह ईएससी की व्युत्पत्ति को कुल मिलाकर समय प्रारंभिक संयुक्त मीडिया परिवर्तन के बाद 15-20 दिनों के बीच है।
  10. एक 18 गेज सुई का उपयोग करके पहली पार हैच द्वारा कालोनियों के सभी जीएमपी ग्रेड के बाद excised hiPSCs नीचे रुक। एक 200 μl pipettor का उपयोग करके बंद सभी टुकड़ों को लिफ्ट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार शीशी और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं से युक्त सभी मीडिया हस्तांतरण।
  11. कोशिकाओं centrifuging कर रहे हैं, ठंड संयुक्त मीडिया दो की बराबर मात्रा से मिलकर और 7.5% की एक अंतिम DMSO के एकाग्रता के साथ मध्यम ठंड एक ठंड मीडिया बनाते हैं।
  12. कोशिकाओं pelleted हैं, के बाद पुराने मध्यम बंद महाप्राण और ठंड मीडिया के साथ गोली फिर से निलंबित वार ड्रॉप। इसके तत्काल बाद टीआरठंड शीशियों को ansfer और डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक -80 डाल दिया।

5. निस्र्पक जीएमपी ग्रेड पोस्ट-excised hiPSCs

  1. चरण 3 qPCR के तरीके के रूप में उल्लेख पालन कुंजी pluripotency मार्कर (Sox2, OCT4, और NANOG) एक ही कदम के साथ तालिका 1 में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग करके की अभिव्यक्ति यों तो qPCR का उपयोग करें, pluripotency मार्करों के बाद रूपांतरण के समुचित अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए चरण 3 में सूचीबद्ध के रूप में एक ही कदम।
  2. इस्तेमाल की पहले से 10 प्रकाशित किट में सूचीबद्ध मानक शर्तों के अनुसार गैर मानव सियालिक एसिड Neu5Gc (एन -glycolylneuraminic एसिड) का पता लगाने के प्रवाह cytometry।
  3. धीरे 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग करके कोशिकाओं के साथ सेल संस्कृति प्लेटें धोने।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1x हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग करके कालोनियों अलग कर देना।
  5. कदम 5.4 से 5 मिनट ऊष्मायन समय के दौरान, में प्रदान की जाती अवरुद्ध समाधान (को तैयारठंडा पीबीएस में एजेंट अवरुद्ध 0.5% बनाकर किट)।
  6. प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए ट्यूबों के निम्नलिखित सेट लेबल: बेदाग; '4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DAPI; नियंत्रण एंटीबॉडी 1: 200; प्राथमिक एंटीबॉडी 1: 200; माध्यमिक एंटीबॉडी 1: 200 गधा विरोधी चिकन आईजीजी (एच + एल); नमूना MEFs; मैट्रिक्स पर नमूना के बाद excised कोशिकाओं; और नमूना सिंथेटिक सब्सट्रेट पर कोशिकाओं के बाद excised।
  7. धीरे एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का हल और हस्तांतरण सामग्री को रोकने के 2 मिलीलीटर जोड़कर कदम 5.4 से सेल समुच्चय बेदखल। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 80 XG पर अपकेंद्रित्र।
  8. कदम 5.7 में कहा गया है के रूप में समाधान और सेंट्रीफ्यूज रोकने के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
  9. धीरे प्रत्येक एंटीबॉडी की इसी कमजोर पड़ने की मात्रा के साथ अवरुद्ध समाधान के 100 μl में लगभग 1 x 10 6 कोशिकाओं फिर से निलंबित। कोमल 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल के साथ सेते हैं।
  10. कदम 5.8 में के रूप में washes के तीन बार दोहराएँ।
  11. मंदक व्यवस्था के 400 μl में सेल गोली पुनः निलंबितffer एक साथ (किट से): ट्यूबों 2, 6, 7 के लिए DAPI की 100, और 8 कदम 5.6 के तहत सूचीबद्ध हैं।
  12. एक 40 माइक्रोन झरनी के माध्यम से तनाव कोशिकाओं और प्रवाह के माध्यम से चला रहे हैं।

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Representative Results

हम STEMCCA lentiviral आधारित reprogramming के दृष्टिकोण का उपयोग करके नैदानिक ​​ग्रेड कारक मुक्त hiPSCs पाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। चित्रा 1 ए MEFs की एक परत पर STEMCCA दृष्टिकोण के साथ reprogramming के बाद, तीन अलग-पूर्व excised hiPSC लाइनों के एक प्रतिनिधि तस्वीर दिखाता है। STEMCCA reprogramming के दृष्टिकोण का प्राथमिक लाभ विभिन्न अनुसंधान समूहों और स्थानों में, कई वैज्ञानिकों ने हासिल की लगातार reprogramming के सफलता में निहित है। चित्रा 1 बी के बाद छांटना रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर जेल प्रस्तुत करता है, पूरी तरह से मुक्त है, जो एक विशेष subclone (2.3) दिखा STEMCCA lentivirus से, एक विशेष अनुक्रम STEMCCA। 2A चित्रा को अंतर्जात के लिए विशिष्ट एक amplicon के बैंड की कमी से सबूत के रूप में सिंथेटिक मैट्रिक्स पर मैट्रिक्स और बाद excised Xeno मुक्त जीएमपी ग्रेड hiPSCs युक्त Xeno पर पूर्व परिवर्तित hiPSCs से पता चलता है । मानक pluripotency जुड़े कारकों के quantitation (अतःX2 है, qPCR का उपयोग करके OCT4, और NANOG) चित्रा 2B में सचित्र है। चित्रा -2 के रूप में दिखाया जीएमपी ग्रेड शर्तों के पूर्व परिवर्तित और बाद परिवर्तित hiPSCs, गैर मानव एंटीजन का संकेत सियालिक एसिड एन glycolylneuraminic एसिड, के लिए प्रवाह cytometry के माध्यम से परीक्षण किया गया।

चित्रा 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि मानव स्टेम सेल कैसेट (hSTEMCCA) व्युत्पन्न मानव प्रेरित स्टेम सेल (hiPSC) लाइनों। (क) सभी तीन व्युत्पन्न लाइनों nrLAM पीसीआर तकनीक के साथ विश्लेषण किया गया और केवल प्रस्तुत सी 8 लाइन PRPF39 जीन में एक एकीकरण है पाया गया था। कारण ही सुरक्षित intronic STEMCCA एकीकरण के लिए इस लाइन, Cre की मध्यस्थता छांटना के लिए एडिनो Cre-PuroR चयन गुजरना करने के लिए चुना गया था। (बी) एडिनो Cre C8 के लाइन से बाहर STEMCCA छांटना मध्यस्थता। पीSTEMCCA-एंडो-Myc-एस और ए-WPRE- में पाया अद्वितीय न्यूक्लियोटाइड दृश्यों के खिलाफ rimers केवल एक subclone (2.3 IPSCs के बाद excised) ठीक से excised और एकीकृत provirus से ट्रांसजेनिक प्रतिलेखन कारक से मुक्त थे। बार्स 100 माइक्रोन =। यह आंकड़ा श्रद्धा एट अल। 10 से संशोधित किया गया है।

चित्रा 2
चित्रा 2: Xeno युक्त नैदानिक ​​ग्रेड जीएमपी Xeno मुक्त परिस्थितियों और लक्षण वर्णन करने से hiPSCs का रूपांतरण। (ए) Xeno युक्त (अनुसंधान ग्रेड मैट्रिक्स) से बदल दिया गया है कि प्रतिनिधि hiPSC लाइन Xeno से मुक्त करने के लिए (सिंथेटिक सब्सट्रेट) वर्तमान अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) की शर्तों के तहत शर्तों। (बी) उचित pluripotency के लिए परख करने के लिए मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन जीएमपी ग्रेड स्थितियों में जुड़े जीन की अभिव्यक्ति के बाद रूपांतरण। (सी) addit मेंमानक बाँझपन परीक्षण करने के लिए आयन जीएमपी संगतता सुनिश्चित करने के लिए, गैर मानव प्रतिजन, एन -glycolylneuraminic एसिड के लिए एक फ्लो आधारित परख परीक्षण, पोस्ट-परिवर्तित hiPSCs के बाद से (1% सभी सियालिक एसिड का पता लगाने को खत्म करने कि दिखाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है मैट्रिक्स पर excised कोशिकाओं को एक सिंथेटिक सब्सट्रेट पर पोस्ट-excised कोशिकाओं) के साथ 0% की तुलना में। माउस भ्रूणीय fibroblasts और जीएमपी शर्तों के तहत निकाली गई एक hiPSC लाइन इस प्रयोग में, क्रमशः, के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण में कार्य किया। बार्स 100 माइक्रोन =। hESC, मानव भ्रूण स्टेम सेल; PESS, सिंथेटिक सब्सट्रेट के बाद excised; पीईएम, पोस्ट-excised मैट्रिक्स। यह आंकड़ा श्रद्धा एट अल। 10 से संशोधित किया गया है।

जीन का नाम आगे प्राइमर 5'-3 ' रिवर्स प्राइमर 5'-3 ' जांच #
QRT-hPOU5F1 gaagttaggtgggcagcttg tgtggccccaaggaatagt 13
QRT-hSOX2 gggggaatggaccttgtatag gcaaagctcctaccgtacca 65
QRT-hNANOG cagtctggacactggctgaa cacgtggtttccaaacaaga 55

तालिका 1: मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल प्राइमरों।

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Discussion

हम कारक मुक्त hiPSCs पाने और भविष्य के मानव चिकित्सा विज्ञान में नीचे की ओर सेल भेदभाव के लिए जीएमपी ग्रेड स्थितियों में इन कोशिकाओं को परिवर्तित करके उन्हें नैदानिक ​​प्रासंगिक बनाने की एक पद्धति का वर्णन। इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक किस्म के लिए मोटे तौर पर लागू है, हम कारण रोगी से निकासी की आसानी और व्यक्तिगत मानव चिकित्सा विज्ञान के लिए अपने प्रयोज्यता के लिए, मानव त्वचीय fibroblasts के reprogram करने के लिए चुना है। सीमाओं नैदानिक ​​प्रासंगिक सेल डेरिवेटिव में पूर्ण भेदभाव के रूप में के रूप में दूर remedied कर रहे हैं एक बार जीएमपी ग्रेड स्थितियों में प्रस्तुत रूपांतरण विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म के लिए और भी अधिक प्रासंगिक हो जाएगा, चिंतित 14 है।

इस अध्ययन के पहले भाग STEMCCA lentivirus के साथ मानव fibroblasts reprogramming शामिल है। इस तकनीक की वजह से अपनी reproducibility के अपेक्षाकृत उच्च reprogramming दक्षता (0.02%), और आदमी भर reprogram करने के लिए मजबूत क्षमता के बड़े हिस्से में चुना गया थाY विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में 10। इस तकनीक को कम reprogramming क्षमता और reproducibility 10 से ग्रस्त हैं कि इस तरह के सेंडाइ वायरस, episomal प्लास्मिड, और सिंथेटिक mRNA के आधार पर reprogramming के रूप में अन्य reprogramming के तरीके के लिए बेहतर है। बढ़ी हुई जीन गतिविधि के आकर्षण के केंद्र 15 में एकीकृत एचआईवी-आधारित वैक्टर के बीच एक संबंध है, वे एक जीन, Intron के एक सुरक्षित क्षेत्र में बहुत कम, एक जीन में एकीकृत जाएगा कि कोई गारंटी नहीं है। इस प्रकार इस बाधा को इस दृष्टिकोण के लिए एक उल्लेखनीय सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अतिरिक्त, एक सुरक्षित जीनोमिक स्थान में इस एकीकरण साइट वरीयता जीनोम भर में अधिक एकीकरण के साथ घट जाती है। इसलिए, यह उचित lentiviral provirus एकीकरण साइट और एकीकरण संख्या ठीक से ऐसे nrLAM पीसीआर प्रौद्योगिकी के रूप में संवेदनशील तकनीक से पूछताछ की जा आवश्यक है। भविष्य reprogramming के उपयोग जस्ता उंगली nuclease प्रौद्योगिकी, talen, या CRISPR / Cas9 आधारित जीन homologou के माध्यम से (लक्ष्यीकरणएस पुनर्संयोजन) आगे 16 reprogramming के लिए विशिष्ट स्थलों में इस फील्ड गाइड कर सकते हैं।

मानव fibroblasts ठीक से reprogrammed रहे हैं और कालोनियों प्राप्त किया गया है एक बार, इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू के बाद excised hiPSCs के चयन के लिए एडिनो Cre-PuroR अभिव्यक्ति है। यह सब एडिनोवायरस सेल प्रतिकृति के माध्यम से बाहर पतला कर दिया गया है और कई मायनों जीनोम में एकीकृत नहीं किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के क्रम में, सेल संस्कृति के कुछ हफ्तों के बाद puromycin कालोनियों फिर से प्रकाश में लाने पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। Adenovirus के जीनोम में अनुचित एकीकरण व्यक्तिगत सेलुलर चिकित्सा विज्ञान के लिए एक सुरक्षा चिंता का प्रतिनिधित्व करेगा।

जीएमपी ग्रेड स्थितियों में रूपांतरण इन कारक मुक्त hiPSCs के लिए नैदानिक ​​प्रयोज्यता शुरू करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह Xeno मुक्त परिस्थितियों खत्म करने के लिए इन कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए जब एक समय में केवल एक ही हालत बदलने के लिए महत्वपूर्ण है; xeno- में कोशिकाओं को परिवर्तित करके शुरूधीमी गति से रूपांतरण पद्धति के माध्यम से स्वतंत्र मीडिया। hiPSCs एक मीडिया परिवर्तन और एक ही समय में एक सब्सट्रेट परिवर्तन को बर्दाश्त नहीं कर सकते हैं। कोशिकाओं नए मीडिया की स्थिति में सामान्य आकृति विज्ञान के साथ नियमित रूप से passaging कर रहे हैं एक बार, Xeno मुक्त सब्सट्रेट पर संक्रमण शुरू करते हैं। विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की सिफारिश की सब्सट्रेट पर स्थानांतरित परेशानी हो रही है, यह बाजार पर अन्य Xeno मुक्त substrates के लिए कोशिश कर रहा पर विचार करने के लिए संभव है।

अंत में, जीएमपी ग्रेड रूपांतरण के साथ इस reprogramming तकनीक के मजबूत और व्यापक प्रयोज्यता आसान reproducibility के लिए अनुमति चाहिए और मानव चिकित्सा विज्ञान के लिए भविष्य hiPSC आधारित व्युत्पन्न सेल संस्कृति के लिए एक आधार के रूप में कार्य करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and reagents
DMEM/F12 (basal media) Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 11330057
Fetal bovine serum Invitrogen 16000044
Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x Invitrogen 11140050
Glutamax, 100x Invitrogen 35050-061
PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x Invitrogen 15140-122 Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Knockout serum replacement Invitrogen 10828028 Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C
Trypsin/EDTA, 0.5% Invitrogen 15400-054 Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS
Basic fibroblast growth factor GlobalStem (Rockville, MD, USA) GSR-2001 Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C
β-mercaptoethanol Millipore (Billerica, MA, USA) ES-007-E
Matrigel (basement membrane matrix) BD Biosciences (San Jose, CA, USA) 356231 Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C.
CELLstart (Synthetic Substrate) Invitrogen A1014201
Stemmolecule Y27632 Stemgent (Cambridge, MA, USA) 04-0012-02
Puromycin Invitrogen A1113802
LightCycler 480 Probes Master Roche (Basel, Switzerland) 4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing medium Lonza (Basel, Switzerland) 12-769E
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) D8418
PBS Invitrogen 14190-250
100 BP DNA Ladder Invitrogen 15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x Invitrogen S33102
Agarose Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) 161-3101
Gelatin, from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-100G Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature.
mTeSR1 StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) 5850 Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium Stemgent 05-100-1A Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks.
Primocin InvivoGen (San Diego, CA, USA) ant-pm-1
Accutase (Dissociation Reagent) Invitrogen A1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) 703-546-155
Polybrene/transfection agent Millipore TR-1003-G
Plasticware
12-well plates VWR (West Chester, PA, USA) 29442-038
6-well plates VWR 29442-042
10-cm plates Sigma-Aldrich Z688819
18-gauge needle Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) 148265D
21-gauge needle Fisher Scientific 14-829-10D
Equipment
BD LSRII Flow Cytometer KSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 Software BD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen K182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) KK2601
High Pure RNA Isolation Kit Roche 11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit Roche 4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit Sialix (Newton, MA, USA) Basic Pack
Media
Combined media 1 StemCell Technologies and Stemgent Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem
Combined media 2 StemCell Technologies and Stemgent Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem
HUF Media Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell Media DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.
DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline.

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References

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Awe, J. P., Vega-Crespo, A., Byrne, J. A. Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions. J. Vis. Exp. (93), e52158, doi:10.3791/52158 (2014).

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