Abstract
Umane pluripotenti indotte (cellule staminali hiPSCs) possono essere generati con le metodologie di riprogrammazione basata lentivirali-. Tuttavia, tracce di geni potenzialmente oncogeni rimanenti nelle regioni attivamente trascritti del genoma, limitano il loro potenziale per l'uso in applicazioni terapeutiche umani 1. Inoltre, antigeni non umani derivanti dalla riprogrammazione di cellule staminali o di differenziazione in derivati terapeuticamente rilevanti escludono questi hiPSCs vengano utilizzati in un contesto clinico umano 2. In questo video, vi presentiamo una procedura per la riprogrammazione e l'analisi hiPSCs senza fattore gratuitamente transgeni esogeni. Questi hiPSCs poi possono essere analizzati per alterazioni di espressione genica nel introne specifica l'lentivirus. Questa analisi può essere condotta utilizzando sensibile reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR), che ha un vantaggio rispetto meno sensibili tecniche precedentemente utilizzato per rilevare le differenze di espressione genica 3. La conversione completa inbuone prassi di fabbricazione clinica-grade (GMP) condizioni, permette di rilevanza clinica umana. Il nostro protocollo offre un altro metodo, a condizione che i criteri esenti attuali espandere e comprendono caratterizzati derivati basati hiPSC senza fattore di applicazioni, ad terapeutiche umane derivanti hiPSCs GMP-grade, che dovrebbero eliminare qualsiasi rischio di immunogenicità a causa di antigeni non-umani. Questo protocollo è ampiamente applicabile per lentivirali riprogrammato cellule di qualsiasi tipo e fornisce un metodo riproducibile per la conversione di cellule riprogrammate in condizioni di GMP-grade.
Protocol
NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata nel Awe et al 10..
1. Riprogrammazione umano adulto Dermal fibroblasti con STEMCCA
- Fibroblasti dermici Thaw adulti umani (HUFS), di passaggio a 4 o inferiore, in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 minuti, avendo cura di non immergere la parte superiore del flaconcino con l'acqua.
- Posizionare la poltiglia 1 ml di fibroblasti umani in una fiala conica 15 ml e posizionare lentamente 4 ml di supporti HUF standard preriscaldata a 37 ° C, in un modo goccia a goccia, per diluire le dimetil solfossido (DMSO) e risospendere le cellule.
- Centrifugare la fiala a 200 xg per 10 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in un volume adeguato di media per creare una sospensione di 100.000 cellule / ml e aggiungere 2 ml in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, pre-rivestito per 20 minuti con 0,2% di gelatina.
NOTA: Una sorella bene con un numero uguale di cellule per linea e condizione deve essere seminato for il conteggio delle cellule / molteplicità di infezione (MOI) di calcolo. - Oscillare la piastra di lato all'altro e avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
- Il giorno di trasduzione, ottenere conta delle cellule (s) dalla sorella ben (s) circa 24 ore dopo la placcatura HUF iniziale.
- Scongelare 2 x 10 8 TU, o, concentrato lentiviral equivalente (STEMCCA) e portare a 1 x 10 8 TU / ml in HUF media.
- Trasdurre cellule con un rapporto di 10-MOI in HUF multimediale integrato con 8 mg / ml agente trasfezione. Mescolare pozzi trasdotte uniformemente e incubare una notte a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato.
- Circa 24 ore dopo la trasduzione lentivirale, passare i mezzi di HUF di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) medie standard.
- Nei giorni 2 a 6, cambiare i media quotidiana di media PSC umana.
- Il giorno 6, piatto due 0,2% di gelatina rivestite piatti da 10 cm di1,5-1,75 x 10 6 MEF derivati da CF1 topi in HUF supporti 12.
- Il giorno 7, facendo attenzione a non centrifugare più di 100 grammi, l'uso della temperatura ambiente tripsina per sollevare la giornata 7 fibroblasti riprogrammate da un pozzetto della piastra sei bene e il passaggio ad un rapporto di 01:16, placcando tutte le cellule in modo uniforme tra due piastre 10 cm, con i media PSC umano fresco, che sono stati placcati con MEF il giorno prima. Distribuire aggregati di cellule in un movimento a spirale in senso orario e posto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato notte.
- Circa 48 ore dopo la semina le cellule riprogrammate sul MEF e ogni giorno dopo, cambiare fuori trascorsi supporti PSC umani con mezzi freschi.
- Dopo 3 o 4 settimane, prendere le singole colonie con tipico ESC come la morfologia con un ago 21-gauge e subclone fuori in un 24-pozzetti stipulando circa 8 a 10 pezzi singoli di colonie specifiche nei singoli pozzetti in un 0,2% di gelatina rivestita 24 pozzetti pre-seeded con MEF derivate da topi CF1 a medio PSC umana.
NOTA: Dopo l'espansione delle colonie raccolte, le colonie devono essere caratterizzato come pluripotenti dalla formazione corpo embrioide e analisi di espressione di marcatori pluripotenza a livello proteico.
2. Vector Integrazione analisi in loco e STEMCCA Excision
- Analizzare il sito di integrazione STEMCCA da amplificazione lineare non restrittiva PCR come descritto 10.
- Dopo saggiare per garantire una integrazione in una zona desiderata del genoma, STEMCCA accise aspirando il vecchio supporto ESC umana. Poi, unire 45 ml di virus adeno-Cre-PuroR concentrato con 8 mg / ml agente trasfezione in 3 ml di media PSC standard per la 24 ore.
- Dopo il periodo di incubazione di 24 ore, aspirare il surnatante virale mista e lavare le cellule due volte con i media PSC umani. Inserire supporti PSC umani freschi insieme con 2 ug / ml puromicina per un periodo di 5 giorni, cambiando i media ingegno giornalierah mezzi freschi e antibiotici.
- Dopo 5 giorni, subclone rimanendo colonie con un ago 21-gauge su 0,2% pozzi gelatina rivestite, in un 12-pozzetti pre-rivestito con MEF derivati da CF1mice ed espandere come sopra.
NOTA: Dopo l'espansione sufficiente per ottenere un titolo congelato, è necessaria la conversione in condizioni di assenza di alimentazione. Aspettatevi almeno il 95% la morte colonia di cellule staminali, come la maggior parte delle cellule non saranno trasdotte con successo e si soccombere antibiotico nel periodo di 5 giorni di incubazione. Sebbene adeno-Cre-PuroR integra in un efficienza 0,001-1% in cromosomi di accoglienza delle cellule infette, reexposing un campione di colonie senza fattore di puromicina per assicurare la morte cellulare 100% confermerà nessuna integrazione è verificato 13. - Scongelare una fiala di pre-aliquotati matrice membrana basale su ghiaccio, per un periodo di circa 2 ore (raccomandazioni del produttore) finché la matrice è un liquido e diluire ad una concentrazione finale di 1:30 fredda mezzi basale. Coal numero desiderato di pozzetti in una piastra a sei pozzetti di 1 ml per pozzetto. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Cross-botola (con un ago calibro 18, o un bicchiere di plastica o "punta"), almeno 20 o 30 colonie da un pozzo in precedenza rivestito con MEF. Fare attenzione a ridurre MEF edificante e trasferire dalla piastra.
- Generare il dispositivo tratteggio attraverso un certo numero di approcci differenti, dal riscaldamento più complicato, tirando, e la finitura di una pipetta Pasteur di vetro su una fiamma libera, per il semplice utilizzo di una punta di plastica pipetta sterile o, come nel nostro caso, 21- e / o calibro 18 aghi.
- Aspirare la matrice dal rivestito ben dopo incubazione.
- Togliere i pezzi delle colonie delicatamente raschiando dal vecchio piatto con una pipetta 200 microlitri e posizionare con cura in 3 ml di mezzi freschi combinate 1 nel piatto di matrice rivestita. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato. Cambia i media 48 ore dopo passaging.
- Estratto DNA genomico da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore, a più del 80% di confluenza, con kit di estrazione del DNA commerciale.
- Analizzare per una corretta asportazione con primer specifici per le integrazioni esogeni del lentivirus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-reverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Ricostituire primer liofilizzati con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 10 micron.
- Eseguire una PCR con il seguente protocollo cinque fasi: denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 35 cicli di ciascuno dei seguenti: denaturazione a 98 ° C per 20 sec, ricottura di primer a 62 ° C per 15 sec, ed estensione a 72 ° C per 15 sec; seguito da un singolo ciclo di estensione finale a 72 ° C per 3 min.
- Effettuare un gel di agarosio al 3% in peso su 1,5 g di agarosio e l'immissione in 50 ml di tampone Tris-acetato 1x-EDTA. Forno a microonde fino agarosio è sciolto e posto in gel macchia DNA a pdiluizione Roper, mescolare e dispensare il volume corretto in cassette gel a solidificare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Carico 12 ml di prodotto di PCR mescolato con 3 ml di colorante di caricamento in un gel di agarosio al 3%. Eseguire il gel per 30 minuti a 80 V.
- Visualizza con luce ultravioletta per l'assenza di una banda che indica il corretto escissione.
3. La quantificazione di differenze di espressione genica utilizzando PCR quantitativa di pre e post-hiPSCs asportati
- Estratto RNA totale da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore utilizzando kit di estrazione RNA commerciali.
- Reverse-trascrivere fino a 1 mg di RNA totale utilizzando kit commerciali in conformità con le istruzioni del produttore. Utilizzare ancorato-oligo (dT) 18 e primer esameriche casuali.
NOTA: Assicurarsi che il protocollo PCR è su misura per le trascrizioni gene di più o di meno di 4 kb. Dovranno essere fatti per i qualsiasi gene STEMCCA originariamente integrato primer specificinto. - Ricostituire il primer liofilizzato con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 20 micron.
- Utilizzare 5 ng di campione per 20 microlitri di reazione che consiste di sonda UPL 10 micron, 2x LightCycler 480 Sonde Maestro, e 20 micron avanti e indietro primer.
4. Conversione in condizioni GMP-grade
- Il primo giorno di transizione i hiPSCs post- asportato verso condizioni di GMP-grade, fare una miscela di mezzi composto da PSC umana combinata multimediali 1 (i media combinata 1) e di grado clinico buone pratiche di fabbricazione (GMP) di media compatibile (supporti combinate 2 ) ad un rapporto di 80:20.
- Aspirare off i vecchi media combinato 1 e collocare 3 ml di nuovi media combinati 1 e 2, pre-riscaldato, al rapporto di 80:20. Cambiare i media al giorno per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno 4, rendere il supporto combinato 1 e 2 con un rapporto 50:50. Aspirare il vecchio media e soste con i media pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 al rapporto di 50:50. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno 7, rendere i media combinata 1 e 2 con un rapporto 20:80. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinati 1 e 2 al rapporto di 20:80. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno 10, effettuare i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Cambiare media ogni giorno a questo rapporto specifico. Le cellule sono ora in media liberi-xeno completamente definito. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
NOTA: Durante l'intero processo di conversione, è necessario passaging routine con un ago calibro 18 per mantenere la giusta dimensione delle colonie e la densità. Piano su passaging cellule ogni 4 o 5 giorni sulla base della dimensione delle colonie, confluenza, e differenziazione. - Coat un pozzetto in una piastra a sei pozzetti con un substrato senza xeno definito come raccomandato dal produttore.
- Passaggio meccanicamente un confluente bene, già convertito in-Xeno gratuita condizioni di media, da una piastra di sei bene con un ago 18-gauge. È importante sottolineare che, posizionare nuovi media (supporti combinati 2) sulle cellule con un inibitore ROCK 1x per 1 ora, prima passaging pre-condizione di media.
- Aspirare la soluzione substrato sintetico largo della nuova piastra che le cellule vengono trasferiti. Rimuovere tutti i supporti contenenti i grumi di cellule staminali dal vecchio piatto e trasferimento a nuova piastra.
- Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 2 giorni con il minimo disturbo fisico (idealmente piatti, una volta all'interno dell'incubatrice, non sono direttamente toccati in alcun modo) per una massima attaccamento.
NOTA: Le cellule richiederanno cambiamenti di media al giorno. Passagin continuag ogni 4 giorni saranno importanti. Utilizzando un ago 21-gauge, passaggio solo le parti di colonie con ottima morfologia ESC-like (elevato rapporto nucleocytoplasmic). Ciò garantirà la selezione per le colonie hiPSC corretto che crescerà bene e alla fine produrranno colonie omogenee. Tempo complessivo di derivazione del CES come colonie è tra 15-20 giorni dopo il cambio di supporto iniziale combinato. - Congelare le hiPSCs post- asportato GMP-grade per primo tratteggio incrociato tutte le colonie utilizzando un ago calibro 18. Sollevare tutte le parti fuori utilizzando una pipetta 200 microlitri e trasferire tutti i supporti contenenti le cellule ad una fiala conica 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Mentre le cellule sono centrifugazione, fare un supporto congelamento costituito da volumi uguali di supporto combinato freddo 2 e congelamento media con una concentrazione finale di DMSO del 7,5%.
- Dopo le cellule sono pellettizzati, aspirare off vecchia medio e goccia a goccia risospendere il pellet con i media di congelamento. Immediatamente transfer di fiale congelamento e mettere in un -80 ° C freezer.
5. hiPSCs Characterizing GMP-grade Post-asportati
- Per garantire una corretta espressione dei marcatori pluripotenza post-conversione, utilizzare QPCR per quantificare l'espressione di marcatori pluripotenza chiave (SOX2, OCT4, e Nanog) utilizzando i primer elencati nella tabella 1 con la stessa procedura di cui al punto 3. metodologie QPCR seguire la stessi passaggi elencati al punto 3.
- Utilizzare citometria a flusso per rilevare l'acido non umano sialico Neu5Gc (N acido -glycolylneuraminic) in base a condizioni standard elencati nel kit come precedentemente pubblicato 10.
- Lavare delicatamente le piastre di coltura cellulare con cellule utilizzando PBS 1x (PBS).
- Dissociate colonie utilizzando 1x reagente di dissociazione per 5 min a temperatura ambiente.
- Durante il tempo di incubazione di 5 minuti di passo 5.4, preparare la soluzione di blocco (disponibile inkit) facendo un 0,5% agente di blocco in ghiacciata PBS.
- Etichettare la seguente serie di tubi per citometria a flusso di analisi: senza macchia; 4 ', 6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) DAPI; Controllo anticorpo 1: 200; Anticorpo primario 1: 200; Anticorpo secondario 1: 200 Donkey Anti-Pollo IgG (H + L); MEF campione; Cellule post-asportato esempio a matrice; e celle su supporto sintetico Campione post-asportato.
- Scuotendo leggermente aggregati di cellule dal punto 5.4 con l'aggiunta di 2 ml di soluzione bloccante e trasferire il contenuto di un tubo da 15 ml. Centrifugare a 80 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Lavare le cellule due volte con soluzione bloccante e centrifugare come indicato al punto 5.7.
- Delicatamente risospendere circa 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri di soluzione bloccante con il corrispondente volume di diluizione di ciascun anticorpo. Incubare con dolce dondolo a 4 ° C per 1 ora.
- Ripetere lava tre volte al punto 5.8.
- Risospendere il pellet cellulare in 400 ml di diluente Buffer (dal kit) con 1: 100 di DAPI per tubi 2, 6, 7, e 8 come elencato passo 5.6.
- Cellule filtrare con un colino 40 micron e attraversano citofluorimetro.
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Representative Results
Vi presentiamo un protocollo per derivare clinico-grade hiPSCs senza fattore utilizzando l'approccio basato riprogrammazione-lentivirali STEMCCA. La figura 1A mostra un quadro rappresentativo di tre diverse linee di pre-asportato hiPSC, dopo la riprogrammazione con l'approccio STEMCCA su uno strato di MEF. Il vantaggio principale del metodo riprogrammazione STEMCCA risiede nel successo riprogrammazione coerente ottenuto da più scienziati, in diversi gruppi di ricerca e posizioni. Figura 1B presenta post-escissione trascrizione inversa-PCR gel, mostrando un particolare subclone (2.3), completamente libera dal lentivirus STEMCCA, come dimostra la mancanza di una banda amplicone specifico per un particolare endogeno alla STEMCCA. Figura 2A sequenza mostra i hiPSCs pre-convertito in un Xeno contenente matrice e hiPSCs GMP-grade gratuito-xeno-asportati post su matrice sintetica . Quantificazione dei fattori pluripotenza associata normali (SOX2, OCT4 e NANOG) utilizzando QPCR è illustrato in Figura 2B. HiPSCs pre-e post-convertiti convertito a condizioni GMP-grade sono stati testati mediante citometria a flusso per l'acido sialico acido N-glicolilneuraminico, indicativo di antigeni non umani, come mostrato nella Figura 2C.
Figura 1: cassette di cellule staminali pluripotenti umane (hSTEMCCA) di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) linee -derived Rappresentante. (A) Tutte e tre le linee derivate sono stati analizzati con la tecnologia nrLAM-PCR e solo la linea C8 presentato è stato trovato per avere una integrazione nel gene PRPF39. Solo questa linea, dovuto alla integrazione sicura STEMCCA intronico, è stato scelto di sottoporsi selezione adeno-Cre-PuroR per escissione Cre-mediata. (B) adeno-Cre mediata STEMCCA escissione dalla linea C8. Primers contro sequenze nucleotidiche unici trovati in STEMCCA-endo-Myc-s e A-WPRE- scoperto che solo un subclone (2.3 post-asportato iPSCs) sono stati opportunamente asportato e privo di fattori di trascrizione transgeniche dal provirus integrato. Bar = 100 micron. Questa cifra è stata modificata da Awe et al. 10.
Figura 2: Conversione di hiPSCs da-Xeno contenente le condizioni cliniche di grado GMP senza xeno e caratterizzazione. (A) linea hiPSC Rappresentante che è stato convertito da (matrice grade ricerca)-Xeno contenente a-Xeno libero (supporto sintetico) le condizioni in base alle attuali norme di buona fabbricazione (GMP) condizioni. (B) Quantitative PCR per test per il corretto pluripotenza espressione del gene associato post-conversione in condizioni di qualità GMP. (C) In Addition ai test di sterilità standard per garantire la compatibilità GMP, un test di analisi basato su citometria di flusso per l'antigene non umano, l'acido N -glycolylneuraminic, viene utilizzato per mostrare che hiPSCs pubblicare convertiti eliminano tutti rilevamento di acido sialico (1% con post- cellule asportati sulla matrice, rispetto allo 0% con cellule post-asportato su un supporto sintetico). Mouse fibroblasti embrionali e una linea hiPSC derivato in condizioni di GMP servito come controlli positivi e negativi, rispettivamente, in questo esperimento. Bar = 100 micron. hESC, di cellule staminali embrionali umane; PESS, post-asportato substrato sintetico; PEM, di matrice post-asportato. Questa cifra è stata modificata da Awe et al. 10.
| Gene Nome | Forward Primer 5'-3 ' | Reverse Primer 5'-3 ' | Probe # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tabella 1: Primer utilizzati per l'analisi quantitativa PCR.
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Discussion
Descriviamo una metodologia di derivazione hiPSCs senza fattore e renderli clinicamente rilevante convertendo queste cellule in condizioni GMP-grade per la differenziazione delle cellule a valle in future terapie umane. Sebbene questo protocollo è ampiamente applicabile ad una varietà di tipi cellulari, abbiamo scelto di riprogrammare fibroblasti dermici umani, a causa della facilità di estrazione dal paziente e la loro applicabilità alle terapie umane personalizzati. Una volta che le limitazioni sono state sanate, per quanto piena differenziazione in derivati di cellule clinicamente rilevanti è preoccupato 14, la conversione presentato in condizioni di GMP-grade diventerà ancora più rilevante per una varietà di diversi tipi di cellule.
La prima parte di questo studio comporta la riprogrammazione fibroblasti umani con il lentivirus STEMCCA. Questa tecnica è stata scelta in gran parte a causa della sua riproducibilità, efficienza relativamente alta riprogrammazione (0,02%), e la robusta capacità di riprogrammare tutta uomoy diversi tipi di cellule. 10 Questa tecnica è superiore ad altre metodologie di riprogrammazione come Sendai, plasmidi episomiale, e sintetici riprogrammazione basato mRNA che soffrono di efficienza riprogrammazione inferiori e riproducibilità 10. Anche se vi è una correlazione tra vettori basati HIV integrano in un aumento hotspot di attività genica 15, non vi è alcuna garanzia che integreranno in un gene, tanto meno in una zona più sicura di un gene, il introne. Così questo ostacolo rappresenta una limitazione notevole a questo approccio. Inoltre, questa integrazione sito preferenza in una posizione più sicura genomico diminuisce con più integrazioni tutto il genoma. Pertanto, è imperativo che l'integrazione sito corretto lentivirale provirus e numero integrazione essere opportunamente interrogati da tecniche sensibili come tecnologia nrLAM-PCR. Riprogrammazione Future utilizzando zinco tecnologia finger nucleasi, il targeting TALEN, o CRISPR / gene-based Cas9 (via homologous ricombinazione) guidi ulteriormente questo settore in loci specifici per la riprogrammazione 16.
Una volta che i fibroblasti umani siano riprogrammate e le colonie sono state derivate, un altro aspetto critico di questo protocollo è l'espressione adeno-Cre-PuroR per la selezione di hiPSCs post- asportato. È importante considerare ri-esporre le colonie a puromicina dopo poche settimane di coltura cellulare, in modo da garantire che tutti gli adenovirus è stato diluito attraverso la replicazione cellulare e non ha sporadicamente integrato nel genoma. Integrazione improprio nel genoma del adenovirus rappresenterebbe un problema di sicurezza per terapie cellulari personalizzati.
Conversione in condizioni di GMP-grade è un passo importante nell'introduzione applicabilità clinica di questi hiPSCs libera-factor. È importante modificare solo una condizione in un tempo convertendo queste cellule verso condizioni senza Xeno; avviare convertendo le cellule in biamedia liberi attraverso la metodologia di conversione lenta. I hiPSCs non possono tollerare una variazione media e un cambiamento substrato allo stesso tempo. Una volta che le cellule sono Passaging regolarmente con morfologia normale nelle nuove condizioni mediatici, iniziare la transizione sul substrato senza xeno. Se specifici tipi cellulari stanno avendo problemi nel trasferimento sopra sul substrato consigliato, è fattibile in considerazione cercando altri substrati senza xeno sul mercato.
In conclusione, l'applicabilità robusta e ampia di questa tecnica riprogrammazione insieme con la conversione GMP-grade dovrebbe consentire un facile riproducibilità e serve come base per basato hiPSC futuro coltura cellulare derivata per terapie umane.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
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