Abstract
Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) могут быть получены лентивирусными на основе перепрограммирования методологий. Тем не менее, следы потенциально онкогенных генов, оставшихся в активно транскрибируются областей генома, ограничить их потенциал для использования в терапевтических применений человека 1. Кроме того, нечеловеческие антигены, полученные из стволовых клеток перепрограммирования или дифференциации в терапевтически соответствующих производных исключает эти hiPSCs от использования в человеческом клиническом контексте 2. В этом видео мы представляем процедуру перепрограммирования и анализа факторов без hiPSCs бесплатно экзогенных трансгенов. Эти hiPSCs затем могут быть проанализированы на экспрессии генов отклонений в конкретной интрона, содержащего лентивирусов. Этот анализ может быть проведен с использованием чувствительной количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), который имеет преимущество по сравнению с менее чувствительными методами, ранее использованный для определения различий экспрессии генов 3. Полная конверсия вклинико-класс надлежащей производственной практики (GMP) условия, позволяет клиническое значение человека. Наш протокол предлагает другой методологии, при условии, что текущие критерии безопасной гавани будет расширяться и включать в себя охарактеризованные hiPSC на основе производных Фактор-бесплатно терапевтических применений-для получения GMP-класса hiPSCs, которые должны устранить любую иммуногенности риск из-за нечеловеческих антигенов человека. Этот протокол широко применима к лентивирусов перепрограммировать клетки любого типа и обеспечивает воспроизводимый метод для преобразования перепрограммировать клетки в условиях GMP-класса.
Protocol
Примечание: Этот метод был использован в исследованиях сообщается в страхе и др 10..
1. Перепрограммирование взрослого человека фибробласты кожи с STEMCCA
- Оттепель взрослых кожные фибробласты человека (HUFs), прохождение 4 или ниже, в C водяной бане 37 ° в течение 2 мин, следя за тем, чтобы не погрузиться в верхней части флакона с водой.
- Поместите 1 мл суспензии фибробластов человека в 15-мл коническую пробирку и медленно поместить 4 мл стандартного HUF информации, предварительно нагретой до 37 ° С, в каплям, чтобы разбавить из диметилсульфоксид (ДМСО) и повторно приостанавливать клеток.
- Центрифуга пробирку при 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клеток в достаточный объем информации для создания суспензии 100000 клеток / мл, а затем добавить 2 мл в одну лунку в шесть-луночного планшета, предварительно покрытых в течение 20 мин с 0,2% желатина.
ПРИМЕЧАНИЕ: сестра также с равным количеством клеток в строке и состояния должна быть заполнена FOR клеток учета / множественность заражения (МВД) расчета. - Рок плиты из стороны в сторону и назад и вперед, чтобы равномерно распределить клетки. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
- В день трансдукции, получить количество клеток (ов) из сестры хорошо (ов) примерно через 24 часа после начального форинтов покрытия.
- Оттаять 2 х 10 8 Вт, или эквивалент, Lentiviral концентрат (STEMCCA) и доводят до 1 х 10 8 TU / мл в HUF СМИ.
- Трансдукции клеток в соотношении 10 MOI в HUF среде с добавлением 8 мкг / мл трансфекции агента. Смешайте трансдуцированных скважин равномерно и инкубировать в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
- Примерно 24 часа после лентивирусным трансдукции, включите СМИ HUF к стандартному человек плюрипотентных стволовых клеток (PSC) среды.
- В те дни, со 2 по 6, изменить СМИ ежедневно с человека PSC среды.
- На 6-й день, два пластине 0,2% желатина покрытием 10 см пластиныОт 1,5 до 1,75 х 10 6 MEFs, полученные из CF1 мышей форинтов СМИ 12.
- На 7-й день, стараясь не центрифугировать более чем 100 XG, используйте при комнатной температуре трипсин поднять выходной день 7 перепрограммировать фибробласты из одной скважины из шести-луночного планшета и прохождения в соотношении 1:16, при посеве все клетки равномерно между два 10 см пластинах, с свежей человеческой PSC СМИ, что высевали с MEFs день раньше. Распределить клеточных агрегатов по часовой спиральной движения и места в 37 ° C, 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе в течение ночи.
- Примерно через 48 часов после посева перепрограммировать клетки на MEFs и каждый день после этого, измените из потратили PSC СМИ человека со свежими СМИ.
- После 3-х до 4 недель, выбрать отдельные колонии с типичной морфологии ESC как с 21-калибровочной иглой и субклонирования вне в 24-луночный планшет, поместив примерно от 8 до 10 отдельных частей конкретных колоний на отдельные лунки в 0,2% желатина покрытием 24-луночный планшет предварительно семянред с MEFs, полученных от мышей CF1 в человеческой PSC среды.
Примечание: После расширения выбраны колонии, колонии должны быть охарактеризованы как плюрипотентные по эмбриоидного формирования тела и анализа экспрессии маркеров плюрипотентности на уровне белка.
2. вектор интеграции Анализ сайта и STEMCCA Удаление
- Анализ сайта интеграции STEMCCA государств, не являющихся ограничительными линейного усиления ПЦР, как описано 10.
- После опробования, чтобы обеспечить один интеграцию в нужной области генома, акцизов STEMCCA путем аспирации от старого человека ESC среду. Затем объединить 45 мкл концентрированной аденовирус-Cre-Puror с 8 мкг / мл трансфекции агента в 3 мл стандартных средах PSC в течение 24 ч.
- После 24-часового инкубационного периода, аспирация от смешанного вирусной супернатант и промыть клетки в два раза с PSC СМИ человека. Поместите свежей человеческой PSC носитель вместе с 2 мкг / мл пуромицин в течение 5 дней, изменения медиа-дневной умч свежей среды и антибиотик.
- После 5 дней, субклон остальные колонии с 21-калибровочной иглой на 0,2% желатином лунок, в 12-луночный планшет, предварительно покрытые MEFs, полученных из CF1mice и расширить, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: После достаточное расширение для получения замороженного состава, преобразование в фидерных без условий требуется. Ожидать по крайней мере 95% колоний стволовых клеток смерть как большинство клеток не будет успешно трансдуцированных и поддаваться антибиотика в течение 5-дневного периода инкубации. Хотя Adeno-Cre-Puror объединяет в 0,001-1 эффективности в хромосомы хозяина инфицированных клеток%, reexposing образец фактора без колоний Пуромицин, чтобы обеспечить смерть 100% клеток подтвердит никакой интеграции не произошло 13. - Оттепель одну ампулу предварительно аликвоты базальной мембраны матрицы на льду, в течение приблизительно 2 ч (рекомендациями производителя) до тех пор, пока матрица представляет собой жидкость и разбавленной к конечной концентрации 1:30 в холодной базальной средах. Компанияна желаемое количество лунок в шесть-луночного планшета с 1 мл на лунку. Пусть сидят при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Кросс-люк (с помощью 18-иглы, или стекла или пластика "наконечник") по крайней мере от 20 до 30 колоний от хорошо предварительно покрыты MEFs. Будьте осторожны, чтобы уменьшить MEF поднимает настроение и передать от пластины.
- Генерирование штриховкой устройство с помощью ряда различных подходов, с более сложной нагрева, потянув, и заканчивая стеклянной пипетки Пастера на открытом пламени, в простом использованием стерильной пластиковой пипетки наконечник, или, как в нашем случае, 21- и / или 18 калибра иглы.
- Аспирируйте матрицу из лунку, покрытую после инкубации.
- Удалить части колоний, осторожно выскабливание от старого пластины с 200 мкл, пипетки и осторожно поместите в 3 мл свежего комбинированных СМИ 1 в пластине матрицы покрытием. Выдержите в течение ночи в 37 ° C, 5% CO 2 увлажненном инкубаторе. Изменить массовой информации 48 часа после пересева,
- Извлечение геномной ДНК из пост-вырезали и фидерных без преобразованных hiPSCs, более чем на 80% слияния, используя комплекты коммерческой добычи ДНК.
- Анализ для правильного удаления с праймерами, специфичными для внешних интеграции лентивирусов STEMCCA: гДНК-Hendo-MycS вперед, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; гДНК-hWPRE-наоборот, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ». Восстановить лиофилизированные праймеры с ПЦР-класса водой до 10-мкМ исходного раствора.
- Запуск ПЦР со следующими пятиступенчатой протокола: начальная денатурация при 95 ° С в течение 3 мин; 35 циклов каждого из следующего: денатурации при 98 ° С в течение 20 сек, отжиг праймеров при 62 ° С в течение 15 сек и удлинение при 72 ° С в течение 15 сек; с последующим одного цикла конечного удлинения при 72 ° С в течение 3 мин.
- Сделать 3% агарозном геле путем взвешивания 1,5 г агарозы и размещение его в 50 мл 1x Трис-ацетат-ЭДТА буфера. Микроволновая печь до агарозы растворяются и место в ДНК в геле пятно на рРазбавление Ропер, смешать, а обойтись надлежащего объема в геле кассеты для отверждения в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Нагрузка 12 мкл ПЦР-продукта смешивали с 3 мкл загрузочного красител в 3% агарозном геле. Запустите гель в течение 30 мин при 80 В.
- Визуализация ультрафиолетовым светом для отсутствие полосы индикации надлежащего иссечение.
3. Количественный анализ различий экспрессии генов с помощью количественной ПЦР с пре- и пост-подакцизных hiPSCs
- Извлечение общую РНК из пост-вырезали и фидерных без преобразованных hiPSCs с помощью наборов коммерческих экстракции РНК.
- Обратное записать до 1 мкг суммарной РНК с помощью коммерческих наборов в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Используйте якорь-олиго (дТ) 18 и случайных праймеров гексамерных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что протокол ПЦР специально для генных транскриптов более или менее 4 кб. Специфические праймеры должны быть сделаны для какой ген STEMCCA первоначально Встроенные входыNto. - Развести лиофилизированный праймера с ПЦР-класса водой до 20 мкМ исходного раствора.
- Использование 5 нг образца в 20 мкл реакции, который состоит из 10 мкм UPL зонда, 2x LightCycler 480 Probes Master и 20 мкМ прямого и обратного праймеров.
4. Преобразование в GMP-класса условий
- На первый день перехода пост-вырезали hiPSCs к условиям GMP-класса, сделать смесь массовой информации, состоящей из человеческого PSC в сочетании СМИ 1 (1 в сочетании СМИ) и клиническая оценка надлежащей производственной практики (GMP), совместимые средства массовой информации (в сочетании СМИ 2 ) при соотношении 80:20.
- Аспирируйте от старых комбинированных средах 1 и 3 место мл нового комбинированного СМИ 1 и 2, предварительно нагретой при отношении 80:20. Изменение формата носителя в день в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- На 4-й день, чтобы объединенный носитель 1 и 2 в соотношении 50:50. Аспирируйте от старого среды и замее с предварительно нагретой СМИ, с комбинированными сред 1 и 2 в соотношении 50:50. Изменение формата носителя в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- На 7-й день, чтобы объединенный носитель 1 и 2 в соотношении 20:80. Аспирируйте от старого среды и заменить подогретого СМИ, с комбинированным сред 1 и 2 в соотношении 20:80. Изменение формата носителя в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- На 10 день, чтобы суммарный сред 1 и 2 на 0: соотношение 100. Аспирируйте от старого среды и заменить подогретого СМИ, с комбинированными сред 1 и 2 на 0: соотношение 100. Изменение формата носителя каждый день в этом определенном соотношении. Клетки сейчас в совершенно определенной Xeno без средств массовой информации. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время всего этого процесса преобразования, процедура пассажи с 18-иглы необходимо для поддержания нужного размера колонии и плотность. План по рassaging клетки каждые 4 до 5 дней на основе размера колонии, слияния и дифференциации. - Шерсть один и в шесть-луночного планшета с определенной Xeno свободной подложки в соответствии с рекомендациями производителя.
- Механически проход сливной хорошо, уже превращается в Xeno без условия медиа, от шести-луночного планшета с 18-иглы. Важно отметить, что размещать новые средства массовой информации (в сочетании с медиа-2) на клетках с рок-ингибитора 1x в течение 1 часа, прежде чем пассажей в предварительное условие СМИ.
- Аспирируйте синтетический раствор субстрата с нового пластины, что клетки перечисляется на. Удалите все носители, содержащие стволовые клетки сгустки из старой плиты и передать новой пластинкой.
- Место клетки обратно в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 2 дней с минимальной физической нарушения (в идеале пластины, как только внутри инкубатора, непосредственно не затронуты в любом случае), чтобы обеспечить максимальную вложение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки потребует ежедневные изменения средств массовой информации. Постоянное passaginг каждые 4 дня будут иметь важное значение. Использование 21-иглы, прохождение только части колоний с оптимальным ESC морфологию (высокая цитоплазматический отношение). Это позволит обеспечить выделение для собственных колоний hiPSC, которые будут расти хорошо и в конечном итоге дают однородные колонии. Общее время на выводе ESC как колоний между 15-20 дней после первого комбинированного смены носителя. - Промерзать пост-вырезали hiPSCs GMP-класса по первой штриховки всех из этих колоний, используя 18-иглы. Лифт все куски у с помощью 200 мкл пипетки и передавать все носители, содержащие клетки в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- В то время как клетки центрифугированием, чтобы морозильную носитель, состоящий из равных объемов холодной комбинированных средах 2 и замораживания среды с конечной концентрацией ДМСО 7,5%.
- После Клетки осаждают, аспирация от старого среды и по каплям вновь приостановить гранул с морозильной СМИ. Сразу TRansfer во флаконы замораживания и поставить в -80 ° C морозильнике.
5. Характеризуя GMP-класса Post-подакцизных hiPSCs
- Для обеспечения надлежащего выражения маркеров плюрипотентности после преобразования используйте QPCR для количественной оценки экспрессии ключевых маркеров плюрипотентности (SOX2, OCT4 и NANOG) с помощью праймеров, перечисленных в таблице 1 те же действия, как указано в пункте 3. QPCR методологий следовать те же самые шаги, перечисленные в пункте 3.
- Использование проточной цитометрии для обнаружения не-человеческого сиаловой кислоты Neu5Gc (N -glycolylneuraminic кислоты) в соответствии со стандартными условиями, перечисленными в комплекте, как описано ранее 10.
- Осторожно промыть клеточной культуры пластины с клетками с помощью 1x фосфатно-солевом буфере (PBS).
- Диссоциируют колонии с помощью 1x диссоциации реагента в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Во время 5-минутного периода инкубации на стадии 5.4, подготовить блокирующий раствор (представленную вКомплект), сделав 0,5% блокирующий агент в ледяной PBS.
- Этикетка следующий набор труб для проточной цитометрии: неокрашенные; 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) DAPI; Антитело управления 1: 200; Первичное антитело 1: 200; Вторичный антитела 1: 200 осел Анти-курицы IgG (H + L); Примеры MEFs; Примеры пост-вырезали клетки на матрице; и образец после вырезали клетки на синтетической подложке.
- Осторожно сместить клеточных агрегатов с шага 5,4 путем добавления 2 мл блокирующего раствора и передачи содержимого в 15-мл коническую трубку. Центрифуга на 80 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Вымойте клетки в два раза с блокирующим раствором и центрифуги, как указано в пункте 5.7.
- Осторожно повторно приостанавливать приблизительно 1 × 10 6 клеток в 100 мкл блокирующего раствора с соответствующим объемом разбавления каждого антитела. Инкубируют при осторожном встряхивании при 4 ° С в течение 1 часа.
- Повторите моет три раза, как в шаге 5.8.
- Повторное приостановить осадок клеток в 400 мкл разбавителя Buffer (с комплектом) с 1: 100 в DAPI для труб 2, 6, 7, и 8, перечисленных в соответствии с шагом 5,6.
- Штамм клеток через 40 мкм сито и проходят через проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы представляем протокол для получения фактора без hiPSCs клинико-класса с помощью подход перепрограммирования STEMCCA лентивирусный основе. 1А показывает репрезентативную картину трех различных предварительно вырезали линий hiPSC, после перепрограммирования с подходом STEMCCA на слое MEFs. Основное преимущество подхода перепрограммирования STEMCCA заключается в последовательном успеха перепрограммирования достигается несколькими учеными, в различных научно-исследовательских групп и мест. Фиг.1В представляет после вырезания обратной транскрипции-ПЦР гель, показывающий один конкретный субклон (2.3), которое полностью свободным от лентивирусом STEMCCA, о чем свидетельствует отсутствие ампликона группы, специфического для конкретной последовательности эндогенных к STEMCCA. рис 2А показана предварительная преобразуется hiPSCs от А Xeno, содержащей матрицу и после вырезанные Xeno без GMP-класса hiPSCs на синтетической матрицы , Количественное определение стандартных плюрипотентности факторов, ассоциированных с (SOХ2, Oct4, и NANOG) с помощью количественной ПЦР показано на фиг.2В. Предварительно преобразованные и после преобразованы hiPSCs в условиях GMP-класса были испытаны с помощью проточной цитометрии на сиаловой кислоты N-гликолилнейраминовая кислоты, что свидетельствует о не-человеческих антигенов, как показано на фиг.2С.
Рисунок 1: Типичные плюрипотентных кассета стволовых клеток человека (hSTEMCCA) -derived человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линии. (А) Все три полученные линии анализировали с помощью технологии nrLAM-ПЦР и только представлены С8 линии было установлено, что одна интеграции в геном PRPF39. Только эта линия, из-за безопасной интронной интеграции STEMCCA, был выбран для прохождения выбор Адено-Cre-Puror для Cre-опосредованного удаления. (В) Адено-Cre опосредованной STEMCCA удаление из C8 линии. Primers против уникальных последовательностей нуклеотидов, обнаруженных в STEMCCA-эндо-Мус-х и А-WPRE- обнаружили, что только один субклон (2,3 после вырезали ИПСК) были должным образом вырезали и бесплатно трансгенных факторов транскрипции с интегрированной провирусу. Бары = 100 мкм. Эта цифра была изменена с трепет и др. 10.
Рисунок 2: Преобразование hiPSCs из Зенона, содержащей клинических класса GMP Xeno без условий и характеристик. () Представитель hiPSC линия, которая была преобразована из Xeno содержащих (исследования класса матрицы) для Зенона бесплатно (синтетический субстрат) условия в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (GMP) условиях. (B) количественной полимеразной цепной реакции для анализа на правильном плюрипотентности связанные экспрессии генов после преобразования в условиях GMP класса. (C) В допиона в стандартные тесты на стерильность, чтобы обеспечить совместимость GMP, цитометрии на основе анализа потока испытания для не-человеческого антигена, N -glycolylneuraminic кислоты, используется, чтобы показать, что пост-преобразуется hiPSCs устранить все обнаружения сиаловой кислоты (1% в пост- Вырезанные клетки на матрице по сравнению с 0% при пост-вырезали клеток на синтетической подложке). Мышиных эмбриональных фибробластов и hiPSC линию, полученную в условиях GMP служили в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно, в этом эксперименте. Бары = 100 мкм. чЭСК, человеческих эмбриональных стволовых клеток; PESS, после вырезали синтетический субстрат; PEM, после вырезали матрица. Эта цифра была изменена с трепет и др. 10.
| Джин Имя | Прямой праймер 5'-3 ' | Обратный праймер 5'-3 ' | Зонд # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Таблица 1: Праймеры, используемые для количественного анализа ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем методологию получения фактора без hiPSCs и сделать их клиническое значение путем преобразования этих клеток в условиях GMP-класса для последующего дифференцировки клеток в будущих терапии человека. Хотя этот протокол является широко применимы к различным типам клеток, мы выбрали перепрограммировать дермальные фибробласты человека, из-за простоты извлечения из пациента и их применимости к индивидуальной терапии человека. После того, как ограничения устранены, насколько полной дифференциации в клинически значимых производных клеточных обеспокоен 14, представлены преобразования в условиях GMP-класса станет еще более актуальной для множества различных типов клеток.
Первая часть этого исследования предполагает перепрограммирование фибробластов человека с лентивирусом STEMCCA. Этот метод был выбран в значительной степени из-за его воспроизводимости, эффективности относительно высокой перепрограммирования (0,02%), и надежной способностью перепрограммировать через человекау различных типов клеток 10. Этот метод превосходит другие методики перепрограммирования, таких как вирус Сендай, эписомальные плазмид, а также синтетические перепрограммирования основе мРНК, которые страдают от более низкой эффективностью перепрограммирования и воспроизводимости 10. Несмотря на то, корреляция между ВИЧ-векторы на основе интеграции в увеличение точек доступа экспрессии генов 15, нет никакой гарантии, что они будут интегрироваться в геном, а тем более в безопасную зону гена, интрон. Таким образом, это препятствие представляет собой заметное ограничение в этом подходе. Кроме того, эта интеграция сайт предпочтения в более безопасное геномной месте уменьшается с более интеграций по всему геному. Поэтому, крайне важно, что надлежащее лентивирусный провирус сайт интеграция и номер интеграция должным образом допрошен чувствительных методов, таких как технология nrLAM-ПЦР. Будущее перепрограммирование использования цинка технология палец нуклеазы, ориентированных Тален или CRISPR / Cas9 на основе гена (с помощью homologouс рекомбинация) может также направлять это поле в конкретной локусов для перепрограммирования 16.
После того, как фибробласты человека правильно перепрограммировать и колонии были получены, другой важный аспект этого протокола является выражение Adeno-Cre-Puror для выбора пост-вырезали hiPSCs. Важно, чтобы рассмотреть повторно подвергая колонии, чтобы пуромицин после нескольких недель в культуре клеток, с тем чтобы обеспечить, чтобы все аденовируса было разбавлено через репликации клеток и не спорадически интегрированы в геном. Неправильное интеграции в геном аденовируса будет представлять собой касаются безопасности для персональных сотовых терапии.
Преобразование в условиях GMP-класса является важным шагом на пути внедрения клинических применимость этих факторов без hiPSCs. Важно изменить только одно условие, в то время, когда преобразования этих клеток к Xeno без условий; начать с преобразования клеток в ксенофобовсвободные средства массовой информации через методологии медленного преобразования. В hiPSCs не может терпеть изменение средств массовой информации и изменения субстрата в то же время. Как только клетки регулярно пассажей с нормальной морфологией в новых условиях СМИ, начать переход на Xeno без подложки. Если конкретные типы клеток возникли проблемы передаче по на рекомендованной подложки, то целесообразно рассмотреть возможность пробовать другие Xeno без подложки на рынке.
В заключение, надежный и широкую применимость этого метода перепрограммирования вместе с преобразованием GMP-класса должен обеспечить свободный воспроизводимость и служит основой для будущих hiPSC на основе производного клеточной культуры для терапии человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
