Abstract
İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) lentiviral bazlı yeniden programlama yöntemleri ile üretilebilir. Bununla birlikte, genomun aktif transkribe bölgelerde kalan potansiyel onkojenik genlerin izleri, insanlar için terapötik uygulamalar 1 kullanım için potansiyelini sınırlamaktadır. Buna ek olarak, tedavi edici olarak uygun türevleri olarak, kök hücre yeniden programlanması ya da farklılaşma elde edilen insan olmayan antijenleri, insan klinik bağlamda 2'de kullanılan bu hiPSCs engellemektedir. Bu videoda, biz yeniden programlanması ve eksojen transjenlerin ücretsiz faktör ücretsiz hiPSCs analiz etmek için bir prosedür sunuyoruz. Bu hiPSCs sonra lentivirüs ihtiva eden özel bir intron gen sentezleme anormallikleri analiz edilebilir. Bu analiz, önceden gen ekspresyonu farklılıklarını 3 tespit etmek için kullanılan daha hassas teknikler üzerinde bir avantaja sahiptir hassas bir kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Içine tam dönüşümKlinik dereceli iyi üretim uygulamaları (GMP) koşullar, insan klinik önemi veriyor. Bizim protokol sunan başka bir metodoloji sağlanan akım güvenli liman kriterleri genişletmek ve insan terapötik uygulamalar-nedeniyle insan olmayan antijenlere karşı herhangi bir immünojenisite riskini ortadan kaldırmak gerekir GMP dereceli hiPSCs, türetmek için faktör içermeyen karakterize hiPSC-tabanlı türevlerini içerir ki. Bu protokol, her tür lentiviral yeniden programlanması hücrelerin geniş çapta uygulanabilir GMP dereceli koşullarına programlanması hücreleri dönüştürmek için yeniden üretilebilir bir yöntem sağlar.
Protocol
Not:. Bu yöntem, Awe ark 10'da rapor araştırmada kullanılmıştır.
STEMCCA 1. yeniden programlanması Yetişkin insan dermal fibroblastlarında
- Çözülme yetişkin dermal insan fibroblastlarının (HUFS), 2 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde geçiş 4 ya da daha düşük, su ile şişenin üst batırmak için özen.
- 15 ml konik bir şişe, insan fibroblast 1 ml'lik bir bulamaç koyun ve yavaş yavaş damla damla bir tarzda, 37 ° C'ye önceden ısıtılmış, standart HUF ortam, 4 ml yerleştirmek, dimetil sülfoksit (DMSO) sulandırmak ve yeniden askıya hücreleri.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'de şişe santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve / mi 100,000 hücre süspansiyonu elde etmek üzere ortam yeterli bir hacimde hücrelerin yeniden askıya ve daha sonra, altı gözlü bir plakanın bir kuyuya 2 mi ekleme,% 0.2 jelatin ile 20 dakika için önceden kaplanmış.
NOT: hat ve durumun başına hücre eşit sayıda iyi bir kardeş fo seribaşı gerekiyorr hücre sayımı / enfeksiyon (İB) hesaplama çokluğu. - Eşit hücreleri dağıtmak için ileri geri yan ve plaka yan Kaya. Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edin.
- Transdüksiyon gününde hücre kardeş gelen sayısı (ler) de, ilk HUF sonra kaplama (lar) ile, takriben 24 saat elde edin.
- 2 x 10 8 TU, ya da eşdeğeri, lentiviral konsantre (STEMCCA) çözülme ve HUF medya 1 x 10 8 TU / ml sulandırmak.
- 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile takviye edilmiş HUF ortam içinde 10-İB oranında hücreleri nakletmek. Eşit kalıt kuyu karıştırın ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca inkübe edilir.
- Lentiviral transdüksiyon sonra yaklaşık 24 saat, standart insan pluripotent kök hücre (PSC) orta HUF medya geçiş.
- Gün 2 6 aracılığıyla, insan PSC orta günlük ortamı değiştirmek.
- 6. günde, iki% 0.2 jelatin kaplı 10 cm plakayıHUF ortam 12 CF1 fareler elde edilen 1,5 ila 10 x 1.75 ila 6 MEF'ler.
- Günde 7 günü, dikkatli olmak arasında eşit tüm hücreleri kaplama ile, bir 1:16 oranında altı plaka ve geçit bir kuyudan günde 7 yeniden programlanması fibroblastlar kaldırın 100'den fazla xg, kullanım oda sıcaklığı tripsin santrifüj değil bir gün önce MEF'ler ile kaplandı taze insan PSC medya, iki 10 cm tabak,. 37 ° C bir saat yönünde sarmal hareket ve yer hücre toplulukları dağıtmak,% 5 CO2, gece boyunca inkübatör nemlendirilmiş.
- Yaklaşık 48 saat sonra MEF'ler ve her gün üzerine yeniden programlanması hücreleri tohumlama sonra, taze medya ile harcanan insan PSC medya dışarı değiştirmek.
- 3-4 hafta sonra, bir 21 gauge iğne ile morfoloji gibi tipik ESC ile ayrı ayrı koloniler, çekme ve% 0.2 jelatin kaplı tek tek oyuklara belirli kolonilerin yaklaşık 8-10 bireysel parçaları yerleştirilerek 24 kuyucuklu plaka içerisine alt klonlamak 24-iyi plaka ön-çekirdekİnsan PSC ortamda CF1 fareler türetilen MEF'ler ile ed.
NOT: seçilmiş kolonilerin büyütüldükten sonra, koloniler protein seviyesinde embriyoit vücut formasyonu ve Pluripotency markerlerinin ifadesi analizi ile pluripotent, özelliği gerekir.
2. Vektör Entegrasyon Site Analizi ve STEMCCA eksizyonu
- 10 anlatıldığı gibi olmayan kısıtlayıcı doğrusal amplifikasyon PCR ile STEMCCA entegrasyon siteyi analiz.
- Eski insan ESC orta kapalı aspire genomu, tüketim STEMCCA istenen alana bir entegrasyon sağlamak için tahlil sonra. Daha sonra, 24 saat süre ile standart PSC ortam 3 ml 8 ug / ml transfeksiyon maddesi ile konsantre Adeno Cre PuroR virüsünün 45 ul birleştirir.
- 24 saatlik bir bekletme süresinden sonra, karışık bir viral süpernatan aspire ve insan PSC ortamı ile iki kez yıkama hücreleri. 5 gün arasında bir süre için 2 ug / ml puromisin ile taze insan PSC ortamlarını ortam günlük wit değiştirmekh taze medya ve antibiyotik.
- 5 gün sonra, alt-klon 12-oyuklu bir plaka içerisinde,% 0.2 jelatin kaplı oyuklara üzerine 21-gauge iğne ile koloniler kalan CF1mice türetilen MEF'ler ile önceden kaplanmış ve yukarıda açıklandığı gibi genişletmek.
Not: yeterli genişleme donmuş stok elde etmek üzere sonra besleyici içermeyen koşullar dönüştürme gereklidir. En hücreler başarılı bir şekilde transdüksiyona olmayacak ve kuluçkalama 5 günlük bir süre boyunca antibiyotiğe ölmek olarak en az% 95, kök hücre koloni ölümü bekliyoruz. Adeno Cre PuroR faktörü içermeyen koloni örnek reexposing, enfekte olmuş hücrelerin konukçu kromozomları içine 0.001-1 verimliliği% entegre olmasına rağmen, entegrasyon 13 oluştu doğrular% 100 hücre ölümünü sağlamak için puromisin için. - Matris bir sıvı olduğu kadar, yaklaşık 2 saat (imalatçının önerileri) bir süre boyunca buz üzerinde ön aliquoted taban membran matrisi bir vial çözülme ve soğuk bazal ortam içinde 1:30 arasında nihai bir konsantrasyona kadar sulandırmak. Cooyuk başına 1 ml bir altı yuvalı plaka içindeki yuvalara istenen sayıda. 1 saat oda sıcaklığında bekletin.
- Bir de daha önce MEF'ler ile kaplanmış 30 koloniler en az 20 (18 iğne, ya da bir cam veya plastik "ucu" kullanarak) çapraz çizgili. MEF canlandıran azaltmak ve plaka aktarmak dikkatli olun.
- Steril plastik pipet basit kullanımına açık alev üzerinde, daha karmaşık ısıtma, farklı yaklaşımların bir numara ile bir cam Pasteur pipet çekerek ve terbiye çapraz tarama cihazı üretmek ya, bizim olduğu gibi, 21- ve / veya 18 gauge iğne.
- Kaplanmış de sonra inkübasyon matrisi aspire.
- 200 ul pipet ile eski plaka hafif bir kazıma ile kolonilerin parçasını çıkarın ve dikkatli bir şekilde matris kaplı plaka taze kombine ortam 1, 3 ml içine koyun. 37 ° C,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde bir gece boyunca inkübe edin. Değişim Medya 48 saat Pasajlanması sonra.
- Ticari DNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak,% 80'den fazla confluency, eksize-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs genomik DNA ayıklayın.
- STEMCCA lentivirüs eksojen entegrasyon için özel primerler ile birlikte uygun bir eksizyon için Analiz: gDNA-Hendo-MycS ileri, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-ters, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. 10-uM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile Liyofilize primerler sulandırın.
- Aşağıdaki beş aşamalı protokol ile bir PCR çalıştırın: ilk denatürasyon 3 dakika boyunca 95 ° C'de; 15 saniye için 72 ° C 'de 15 saniye ve uzatılması için 62 ° C'de 20 saniye, primer tavlama için 98 ° C' de denatürasyon, aşağıdaki her bir 35 döngü 3 dakika boyunca 72 ° C 'de, tek bir döngü son uzatma eklenmiştir.
- Agaroz 1.5 gram tartılması ve 50 mi 1 x Tris-asetat-EDTA tampon içine yerleştirerek bir% 3 agaroz jel olun. Agaroz kadar Mikrodalga çözülmüş ve DNA jel leke olarak yer p de olduğuroper seyreltme, karıştırma, ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca katılaşmaya jel kasetine doğru hacminin dağıtımı.
- PCR ürününün yüklenebilir 12 ul% 3 agaroz jel içine yükleme boyası 3 ul ile karıştırılır. 80 V de 30 dakika boyunca jel başlat
- Uygun eksizyon gösteren bir grubun olmaması için ultraviyole ışık ile gözünüzde canlandırın.
Öncesi ve Sonrası-kesilmiş hiPSCs gelen Kantitatif PCR kullanarak Gen İfadesi Farklar 3. kantitasyonu
- Ticari RNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak kesilmiştir-sonrası ve besleyici içermeyen dönüştürülen hiPSCs toplam RNA ayıklayın.
- -Ters uyarlamak üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari kitler kullanılarak toplam RNA 1 ug kadar. Demirli-oligo (dT) 18 ve rasgele heksamer primer kullanın.
NOT: PCR protokolü 4 kb daha fazla veya daha az gen transkriptleri için özel olduğundan emin olun. Spesifik primerler hangisi gen STEMCCA başlangıçta entegre i için yapılan gerekecektirnGoogle'a. - 20 mcM stok solüsyonu PCR-dereceli su ile liyofilize astar sulandırın.
- 10 mcM UPL prob oluşan reaksiyon 20 ul, 2x LightCycler 480 Problar Lisans başına numune 5 ng kullanın ve ileri 20 uM ve geri primerler.
GMP dereceli Koşullar içine 4. Dönüşüm
- GMP dereceli koşullarına üzerinde post-eksize hiPSCs geçiş ilk gününde, kombine insan PSC oluşan medya karışımı yapmak ortam 1 (kombine medya 1) ve klinik notu iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu medya (kombine medya 2 ) 80:20 oranında.
- Aspire eski kombine medya 1 ve 80:20 oranında yeni kombine medya 1 ve 2, önceden ısıtılmış 3 ml, koyun kapalı. Bu özel oran ile 3 gün boyunca günde ortamı değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
- 4. günde, 50:50 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Eski orta ve Replac kapalı aspire50:50 oranında bir araya ortam 1 ve 2 ile önceden ısıtılmış ortam, e. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
- 7. günde, bir 20:80 oranında bir araya ortamı 1 ve 2 olun. Aspire eski orta kapalı ve 20:80 oranında kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin. Bu özel oran ile 3 gün boyunca medya değiştirin. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
- 100 oranında: günde 10, bir 0 kombine Ortam 1 ve 2 yapmak. Aspire eski orta kapalı ve 0 kombine medya 1 ve 2 ile, önceden ısıtılmış medya ile değiştirin: 100 oranında. Bu özel bir oranda her gün medya değiştirin. Hücreler, tam olarak tanımlanmış kseno-içermeyen ortam artık. Lütfen 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör içine yerleştirin hücreleri.
Not: Bu, tüm dönüştürme işlemi sırasında bir 18 gauge iğne ile rutin pasajı uygun koloni büyüklüğü ve yoğunluğu sağlamak için gereklidir. S Planıkoloni boyutu akma ve farklılaşma olarak her 4-5 gün hücreler assaging. - Üretici tarafından tavsiye edildiği gibi tanımlanmış bir kseno-serbest alt-tabaka ile, altı gözlü bir plakanın üzerindeki çukurların kaplayın on.
- Mekanik geçit konfluent iyi, zaten 18-gauge iğne ile altı-kuyu plaka, kseno ücretsiz medya koşullarını dönüştürülür. Önemlisi, medya pre-condition için pasaj önce, 1 saat 1x ROCK inhibitörü olan hücreler üzerinde yeni medya (kombine medya 2) yerleştirin.
- Hücreler transfer ediliyor, yeni plaka kapalı sentetik substrat solüsyonu aspire. Eski plaka kök hücre kümeleri içeren tüm ortamları çıkarın ve yeni plaka transfer.
- (Kez inkübatör içinde, doğrudan herhangi bir şekilde dokunulmaz olan ideal plakaları) geri az fiziksel rahatsızlık ile 2 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO 2 kuvöz içine yerleştirin hücreleri maksimum eki izin vermek.
NOT: Hücreler günlük medya değişiklikleri gerektirir. Sürekli passaging her 4 günde önemli olacaktır. 21-gauge iğne, optimum ESC-benzeri morfolojisi (yüksek Nükleositoplazmik oranı) ile kolonilerin geçişi yalnızca parçalarını kullanarak. Bu iyi büyür ve sonunda homojen koloniler verecek uygun hiPSC koloniler için seçimi sağlayacaktır. Kolonilerin gibi ESC derivasyon genel zaman ilk kombine medya değişiminden sonra 15-20 gün arasındadır. - 18-gauge iğne ile ilk çapraz-hatch ile kolonilerin tüm GMP dereceli sonrası eksize hiPSCs aşağı dondurun. 200 ul pipet kullanılarak atık tüm parçaları kaldırın ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle 200 x g'de 15 ml konik bir şişe ve santrifüj hücreleri ihtiva eden tüm medya aktarın.
- Hücreler santrifüje tabi olsa da, soğuk kombine ortam 2 eşit hacimlerde oluşan ve% 7.5 nihai bir DMSO konsantrasyonu ile orta donması dondurma ortamı olun.
- Hücreler pelet sonra, eski orta aspire ve dondurma medya ile pelet yeniden askıya-damla damla. Hemen trdonma şişelere ansfer ve ° C derin dondurucuda bir -80 koydu.
5. karakterizasyon GMP dereceli Post-eksize hiPSCs
- 3. adımda qPCR yöntemleri de belirtildiği gibi takip anahtar Pluripotency belirteçlerinin (Sox2 Oct4 ve Nanog) aynı adımları Tablo 1'de listelenen primerler kullanılarak ifadesinin miktarını belirlemek için, QPCR kullanarak Pluripotency belirteçlerinin sonrası dönüşüm uygun bir ifade sağlamak için Aşama 3 'de gösterildiği gibi, aynı adım.
- Kullanımlar, daha önce 10 yayınlanan kitte yer alan standart koşullara uygun olarak, insan olmayan bir sialik asit Neu5Gc (N -glycolylneuraminic asit) tespit etmek için akış sitometrisi.
- Yavaşça 1x Fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanarak, hücrelerin bulunduğu hücre kültürü plakaları yıkayın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1x ayrışma ajanı kullanılarak koloni ayrıştırmaları.
- Aşama 5.4, 5-dakikalık inkübasyon süresi esnasında verilen engelleme çözeltisi (hazırlamakbuz soğukluğunda PBS içinde bloke edici madde, bir% 0.5 yaparak Kit) birleştirildi.
- Flow sitometri analizi için tüplerin aşağıdaki kümesi Etiket: lekesiz; 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) DAPI; Kontrol antikoru 1: 200; Birincil antikor, 1: 200; İkincil antikor, 1: 200 Eşek anti-tavşan IgG'si (H + L); Örnek MEF'ler; Matris üzerinde örnek sonrası eksize hücreler; ve Numune sentetik alt tabaka üzerine hücreleri sonrası çıkarıldı.
- Yavaşça, 15 ml konik bir tüp çözeltisi ve aktarma içeriği bloke 2 ml ilave adım 5.4 hücre agregatları neden olacaktır. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 80 x g'de santrifüjleyin.
- Adım 5.7 belirtildiği gibi çözüm ve santrifüj engelleme ile iki kez hücreleri yıkayın.
- Yavaşça her bir antikorun uygun seyrelme hacmi ile bloke etme çözeltisi 100 ul, yaklaşık 1 x 10 6 hücre yeniden askıya. Yumuşak, 1 saat boyunca 4 ° C'de sallanarak inkübe edin.
- Adım 5.8 gibi yıkar üç kez tekrarlayın.
- Seyreltici Bu yüklenmiştir 400 ul hücre pelletini yeniden askıyaffer 1 ile (kit): tüpler 2, 6, 7 için DAPI 100 ve 8 adımda 5.6 altında listelenen.
- 40 mcM süzgecinden Gerinim hücreleri ve akış sitometresinin koşuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu STEMCCA Lentiviral bazlı yeniden programlama yaklaşımı kullanarak, klinik sınıf faktörü içermeyen hiPSCs türetmek için bir protokol mevcut. Şekil 1A MEF'ler bir tabakası üzerinde STEMCCA yaklaşımı ile yeniden programlama sonra, üç farklı önceden kesilmiş hiPSC hatları temsili görüntüsünü gösterir. STEMCCA yeniden programlama yaklaşımının temel avantajı, farklı araştırma grupları ve yerlerde, birden fazla bilim adamları tarafından elde tutarlı yeniden programlama başarı yatıyor. Şekil 1B sonrası eksizyon ters transkripsiyon-PCR jel sunar, tamamen ücretsiz belirli bir alt klon (2.3) gösteren STEMCCA lentivirüs gelen, belirli bir sekans STEMCCA. Şekil 2A, endojen özgü bir amplikon bandının olmayışının kanıtladığı gibi, sentetik matris üzerinde matris ve sonrası kesilmiş kseno içermeyen GMP dereceli hiPSCs ihtiva eden bir xeno önceden dönüştürülmüş hiPSCs göstermektedir . Standart pluripotency ilişkili faktörlerin miktar tayini (SOX2, QPCR kullanılarak Oct4 ve Nanog) Şekil 2B'de de gösterilmiştir. Şekil 2C'de gösterildiği gibi, GMP-dereceli koşulları önceden dönüştürülmüş ve sonrası dönüştürülmüş hiPSCs, insan olmayan antijenlerin gösterge sialik asit, N-glikolilnöraminik asit için akış sitometrisi ile test edilmiştir.
Şekil 1: Temsilci insan pluripotent kök hücre kaset (hSTEMCCA) türevi insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları. (A) Her üç edilen hatlar nrLAM PCR teknolojisi ile analiz edildi ve sadece sunulan C8 hattı PRPF39 gen içine bir entegrasyon sahip olduğu bulunmuştur. Sadece nedeniyle güvenli intronik STEMCCA entegrasyonu bu çizgi, Kre-aracılı eksizyon için Adeno-Cre-PuroR seçimi geçmesi seçildi. (B) Adeno-Cre C8 hattı üzerinden STEMCCA eksizyonu aracılı. PSTEMCCA-Endo-Myc-lar ve A-WPRE- bulunan eşsiz nükleotid dizileri karşı rimers sadece bir alt klon (2.3 iPSCs sonrası eksize) düzgün kesilmiş ve entegre provirüs gelen transgenik transkripsiyon faktörlerinin serbest olduğunu bulmuşlardır. Barlar 100 mikron =. Bu rakam Dehşet ve ark., 10 modifiye edilmiştir.
Şekil 2: xeno içeren klinik sınıf GMP xeno-içermeyen koşullar ve karakterizasyonu için hiPSCs dönüştürülmesi. (A) xeno içeren (araştırma notu matris) dönüştürülmüş Temsilcisi hiPSC hattı kseno-free (sentetik substrat) mevcut iyi imalat uygulamaları (GMP) koşullar altında koşullar. (B) Doğru pluripotensin için tahlile Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu GMP kalite koşullarına ilişkili gen ifadesi sonrası dönüşüm. (C) addit olarakStandart sterilite testleri için iyon GMP uyumluluğu sağlamak için, insan olmayan bir antijen, N -glycolylneuraminic asit için bir akış sitometri tabanlı tahlil test sonrası dönüştürülmüş hiPSCs Direk- ile (% 1 Tüm siyalik asit algılama ortadan kaldırmak olduğunu göstermek için kullanılır matris üzerinde kesilmiş hücreler sentetik alt-tabaka üzerinde sonrası kesilmiş hücreleri) ile% 0 ile karşılaştırıldığında. Fare embriyonik fibroblastlar ve GMP koşullarına türetilmiş bir hiPSC hattı Bu deneyde, sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet etmiştir. Barlar 100 mikron =. HESC, insan embriyonik kök hücre; PESS, sentetik substrat sonrası çıkarıldı; PEM, post-eksize matris. Bu rakam Dehşet ve ark., 10 modifiye edilmiştir.
| Gen Adı | İleri primer 5'-3 ' | Ters primer, 5'-3 ' | Probe # |
| QRT-hPOU5F1 | gaagttaggtgggcagcttg | tgtggccccaaggaatagt | 13 |
| QRT-hSOX2 | gggggaatggaccttgtatag | gcaaagctcctaccgtacca | 65 |
| QRT-hNANOG | cagtctggacactggctgaa | cacgtggtttccaaacaaga | 55 |
Tablo 1: kantitatif PCR analizi için kullanılan primerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz faktör ücretsiz hiPSCs kaynaklanan ve gelecekteki insan tedavide mansap hücre farklılaşması için GMP dereceli koşulları içine bu hücrelerin dönüştürerek onları klinik açıdan yapma bir metodoloji açıklar. Bu protokol, hücre tiplerinde çeşitli geniş çapta uygulanabilir olsa da, bağlı hastadan çıkarma kolaylığı ve kişiye özel insan terapötiklere uygulanabilirlikleri, insan dermal fibroblastları yeniden programlamak seçtik. Sınırlamalar klinik açıdan anlamlı hücre türevleri içine tam farklılaşma kadarıyla giderildiği sonra GMP dereceli koşullarına sunulan dönüşüm, farklı hücre tiplerinin çeşitli daha uygun olacak, endişe 14 olduğunu.
Bu çalışmanın ilk bölümü STEMCCA lentivirüs insan fibroblast yeniden programlanması içerir. Bu teknik, üretilebilmesi, nispeten yüksek bir yeniden programlama verimliliği (% 0.02) ve insan üzerinde yeniden programlamak için sağlam yeteneği büyük ölçüde seçildiY farklı hücre türleri 10. Bu teknik alt yeniden programlama verimliliği ve üretkenlik 10 muzdarip gibi sendai virüsü, epizomal plazmidler ve sentetik mRNA tabanlı yeniden programlama gibi diğer yeniden programlama metodolojileri üstündür. Artan gen aktivitesi noktaları 15 entegre HIV-tabanlı vektörler arasında bir korelasyon olmasına rağmen, onlar bir genin, intron daha güvenli bir alana daha az, bir genin entegre edecek hiçbir garantisi yoktur. Böylece bu engel, bu yaklaşımın bir önemli sınırlama temsil eder. Ayrıca, daha güvenli bir genomik konuma Bu entegrasyon sitesi tercihi genom boyunca daha fazla entegrasyonları ile azalır. Bu nedenle, bu doğru lentiviral provirüs entegrasyon sitesi ve entegrasyon numarası düzgün şekilde nrLAM-PCR teknolojisi gibi hassas tekniklerle sorguya şarttır. Gelecek yeniden programlama kullanan çinko parmak nükleaz teknolojisi, TALEN, ya CRISPR / Cas9 dayalı gen homologou yoluyla (hedeflemes rekombinasyon) ayrıca 16 yeniden programlanması için özel loci içine bu alanda yol açabilir.
İnsan fibroblastlar düzgün yeniden programlanması ve koloniler elde edilmiştir sonra, bu protokolün bir başka kritik yönü sonrası eksize hiPSCs seçimi için Adeno-Cre-PuroR ifadesidir. Tüm adenovirüs hücre çoğaltma yoluyla seyreltildikten ve düzensiz genom içine entegre değildir sağlamak amacıyla, hücre kültürünün bir kaç hafta sonra, puromisin için koloniler yeniden açığa dikkate alınması önemlidir. Adenovirüs genomuna hatalı entegrasyon kişiselleştirilmiş hücresel tedavi için bir emniyet endişe temsil edecektir.
GMP dereceli koşulları dönüştürme, bu faktör içermeyen hiPSCs klinik uygulanabilirliğini tanıtımında önemli bir adımdır. Bu xeno-içermeyen koşullar üzerinde bu hücrelerin dönüştürürken bir seferde sadece tek bir koşulu değiştirmek için önemlidir; kseno içine hücreleri dönüştürerek başlayınYavaş dönüşüm metodolojisi ile ücretsiz medya. hiPSCs bir medya değişikliği ve aynı zamanda bir alt tabaka değişikliği tahammül edemez. Hücreler yeni medya koşullarında normal morfolojiye sahip düzenli pasaj sonra, xeno-serbest tabaka üzerine geçişi başlar. Belirli bir hücre tipleri önerilen alt tabaka üzerine üzerine transfer sorun yaşıyorsanız, piyasadaki diğer xeno-serbest yüzeylerde çalışırken dikkate mümkündür.
Sonuç olarak, GMP dereceli dönüşüm ile birlikte bu yeniden programlama tekniği sağlam ve geniş uygulanabilirliği kolay tekrarlanabilirlik izin vermeli ve insan tedavi için gelecek hiPSC dayalı türev hücre kültürü için bir temel olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and reagents | |||
| DMEM/F12 (basal media) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Minimum essential medium (MEM) non-essential amino acids (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillin-streptomycin, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at −20 °C |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Invitrogen | 15400-054 | Dilute stock out to 0.05% in 1x PBS |
| Basic fibroblast growth factor | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Reconstitute to 10 µg/ml stock in 0.1% bovine serum albumin dissolved in 1x PBS and store at −80 °C |
| β-mercaptoethanol | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (basement membrane matrix) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Dilute stock Matrigel vial with 10 ml of DMEM/F12 while on ice for a 1:2 dilution. Aliquot and store at −20 °C. |
| CELLstart (Synthetic Substrate) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basel, Switzerland) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/freezing medium | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-769E | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Make stock at 0.2% in PBS, autoclave and store at room temperature. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combine Supplement 5x with the basic medium, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Culture Medium | Stemgent | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at 4 °C for up to 2 weeks. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (Dissociation Reagent) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/transfection agent | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12-well plates | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| 6-well plates | VWR | 29442-042 | |
| 10-cm plates | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| 18-gauge needle | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| 21-gauge needle | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Japan) | ||
| BD FACSDiva Version 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Basic Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts mTeSR1 and Nutristem | |
| Combined media 2 | StemCell Technologies and Stemgent | Consists of equal parts TeSR2 and Nutristem | |
| HUF Media | Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] supplemented with 10% fetal bovine serum, 1x non-essential amino acids, 1x Glutamax, and 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 supplemented with 20% knockout serum replacement, 1x Glutamax, 1x non-essential amino acids, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12; PBS, phosphate-buffered saline. | |||
References
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
- Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
- Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
- Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
- Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
- Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
- Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
- Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
