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Biology

पोल्ट्री उत्पादन नमूनों से बैक्टीरियल समुदाय के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक हाइब्रिड डीएनए निष्कर्षण विधि

Published: December 10, 2014 doi: 10.3791/52161
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 1, 5
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

Abstract

डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता जांच की जा रही नमूना के प्रकार और प्रदर्शन किया बहाव के विश्लेषण के प्रकार दोनों पर अत्यधिक निर्भर हो सकता है। नई बैक्टीरियल समुदाय विश्लेषण तकनीक (जैसे, microbiomics, metagenomics) के उपयोग से इन विषयों के कृषि और पर्यावरण विज्ञान और कई पर्यावरण के नमूनों में अधिक प्रचलित होता जा रहा है यह देखते हुए कि physiochemically और microbiologically (अद्वितीय से जैसे, मल और कूड़े / बिस्तर नमूने किया जा सकता है पोल्ट्री उत्पादन स्पेक्ट्रम), उपयुक्त और प्रभावी डीएनए निष्कर्षण तरीकों सावधानी से चुना जाना चाहिए। इसलिए, एक उपन्यास अर्द्ध स्वचालित संकर डीएनए निष्कर्षण विधि पर्यावरण पोल्ट्री उत्पादन के नमूनों के साथ उपयोग के लिए विशेष रूप से विकसित किया गया था। यांत्रिक और enzymatic: इस विधि में डीएनए निष्कर्षण के दो प्रमुख प्रकार का एक संयोजन है। एक दो कदम तीव्र यांत्रिक homogenization के कदम (का उपयोग कर मनका पिटाई विशेष रूप से पर्यावरणीय के लिए तैयारमल के नमूने नमूना मैट्रिक्स से बैक्टीरिया के हटाने और डीएनए को बढ़ाने और ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया समुदाय के सदस्यों की वसूली में सुधार करने के लिए ताल नमूने) "सोने के मानक 'एंजाइमी डीएनए निष्कर्षण विधि की शुरुआत करने के लिए जोड़ा गया है। संकर विधि के enzymatic निकासी भाग शुरू किया गया था एक बार, शेष शुद्धिकरण की प्रक्रिया नमूना throughput बढ़ाने और नमूना प्रसंस्करण त्रुटि को कम करने के लिए एक रोबोट कार्य केंद्र का उपयोग कर स्वचालित किया गया था। पोल्ट्री मल और कूड़े के नमूने प्रसंस्करण जब सख्त यांत्रिक और enzymatic डीएनए निष्कर्षण तरीकों की तुलना में, इस उपन्यास संकर विधि मात्रात्मक जब विचार सबसे अच्छा समग्र संयुक्त प्रदर्शन कुल बैक्टीरियल समुदायों का अनुमान (microbiomics का प्रयोग करके) (-16 rRNA qPCR का उपयोग) और गुणात्मक प्रदान की ।

Protocol

पर्यावरण पोल्ट्री उत्पादन नमूनों की 1. यांत्रिक Homogenization

  1. निकासी के लिए पहले, 95 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान सेट और पानी के स्नान समय है कि तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं।
  2. एक 2 मिलीलीटर lysing मैट्रिक्स ई ट्यूब में मिट्टी या fecal सामग्री की 0.33 ग्राम वजन।
    1. इस ट्यूब की क्षमता से अधिक के लिए निम्न समाधान का कारण होगा, के बाद से ट्यूब में नमूने के 0.33 छ अधिक नहीं है।
    2. आरटी के लिए पिघलना जमे हुए नमूने वजन करने के लिए पहले।
    3. मिट्टी / मल की 1 ग्राम की कुल विश्लेषण करने के लिए, बाहर तीन तौलना प्रत्येक व्यक्ति पर्यावरण के नमूने के लिए 0.33 जी नमूने पेश करता है।
    4. पूर्व निकासी के लिए शंक्वाकार मैट्रिक्स नलियों के भीतर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के नमूने, अगर जरूरत है।
  3. 825 μl सोडियम फॉस्फेट बफर और एक नमूना ट्यूब pls करने के समाधान के 275 μl जोड़ें। ~ 15 सेकंड के लिए एक भंवर का उपयोग कर मिलाई और फिर 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  4. Superna छाननाउग्रवादी बफर एएसएल के 700 μl जोड़ें। 5 सेकंड के लिए एक भंवर का उपयोग कर मिलाएं।
    1. Headspace इस बिंदु पर शंक्वाकार ट्यूब में उपलब्ध (~ 10% की कुल मात्रा) है कि वहाँ सुनिश्चित करें। कोई headspace है, तो नलियों पार संदूषण और / या नमूना नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकता है जो अगले homogenization के चरण के दौरान रिसाव के लिए एक प्रवृत्ति है।
  5. एक FastPrep 24 साधन में नमूने हैं, जगह और 40 सेकंड के लिए 6.0 मी / सेकंड की गति से नमूने homogenize।
  6. 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर homogenized नमूना अपकेंद्रित्र। एक बाँझ 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
  7. नमूना से डीएनए वसूली को अधिकतम करने के लिए, दोहराने वही बाँझ, 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में supernatants के संयोजन, 1.4-1.6 कदम।

नमूना homogenates से inhibitors के 2. एंजाइमी निषेध

नोट: इस प्रोटोकॉल QIAamp डीएनए स्टूल मिनी किट का उपयोग करता है।

  1. सेना5 मिनट के लिए एक 95 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सतह पर तैरनेवाला सतह पर तैरनेवाला के भीतर किसी भी शेष कोशिकाओं से डीएनए वसूली को अधिकतम करने के लिए।
    1. ज्यादातर ग्राम नकारात्मक जीवों से युक्त नमूने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ग्राम पॉजिटिव जीवों (पोल्ट्री मल के नमूनों के साथ मामला है) मौजूद हैं, हालांकि, अगर 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. दबाव इन सील microcentrifuge ट्यूब में निर्माण कर सकते हैं के रूप में ट्यूब खुला "पॉप" नहीं होगा कि यह सुनिश्चित करने और संभावित नमूना मात्रा कम करने के लिए microcentrifuge ट्यूब पर प्लास्टिक ताला लगा क्लिप का प्रयोग करें।
  2. दबाव, फिर से टोपी microcentrifuge ट्यूब जारी है और 15 सेकंड के लिए एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण करने के लिए प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब खोलें।
  3. , 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला के 1.2 मिलीलीटर को हटाने और एक नया बाँझ 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जगह।
  4. प्रत्येक नमूने के लिए एक InhibitEx टैब जोड़ें, और नमूना एक समान रूप से सफेद / बंद सफेद तरल हो जाता है जब तक एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण।
    1. टी बचेंनमूना युक्त microcentrifuge ट्यूब में रखकर जबकि InhibitEx टैब ouching। इसे पूरा करने के लिए खुला microcentrifuge ट्यूब पर सीधे टैब युक्त ब्लिस्टर पैक जगह है और धीरे ब्लिस्टर पैक के बाहर और microcentrifuge ट्यूब में टैब धक्का।
  5. 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर आर टी (~ 25 डिग्री सेल्सियस) पर 1 मिनट के लिए नमूना और सेंट्रीफ्यूज सेते हैं।
  6. 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र करने के लिए सभी तरल स्थानांतरण।
    1. तरल जब स्थानांतरित 2.5 कदम के अंत में microcentrifuge ट्यूब के तल पर pelleted हो सकता है कि किसी भी शेष विविक्त से बचें।

QIAcube रोबोट कार्य केंद्र का उपयोग 3. स्वचालित डीएनए शुद्धि

नोट: प्लास्टिक उपभोग्य की संख्या, सेंट्रीफ्यूज के भीतर नमूना रोटर एडेप्टर की व्यवस्था है, और buffers / समाधान की आवश्यक मात्रा NUM पर निर्भर कर रहे हैंचलाई जा रही हैं कि नमूनों की संख्या।

  1. रोटर एडेप्टर के भीतर उचित स्लॉट के लिए क्षालन ट्यूब और फिल्टर ट्यूबों जोड़ें। प्रत्येक नमूना के लिए, रोटर एडाप्टर के बीच स्लॉट के लिए 400 μl जोड़ें। नमूनों की संख्या शुद्ध किया जा रहा है के अनुसार सही व्यवस्था में कार्य केंद्र अपकेंद्रित्र में रोटर एडेप्टर रखें।
    1. एक विफलता शुद्धि प्रोटोकॉल का centrifugation के कदमों में से एक के दौरान बाल काटना में परिणाम सकता है ऐसा करने के बाद से microcentrifuge ट्यूब lids के सभी ठीक से रोटर एडाप्टर के भीतर सुरक्षित हैं सुनिश्चित करें।
  2. कार्य केंद्र के लिए 1000 μl और 200 μl फिल्टर सुझावों की अपेक्षित संख्या को जोड़ें, और buffers की आवश्यक मात्रा के साथ आपूर्ति बफर बोतलें भरने।
    नोट: इस शुद्धि प्रोटोकॉल (एएल, AW1, AW2, और एई) के लिए आवश्यक बफ़र्स सभी QIAamp डीएनए स्टूल मिनी किट के भीतर समाहित कर रहे हैं। उपयोगकर्ता ऐडवर्ड्स बू के लिए आवश्यक है कि 100% इथेनॉल की आपूर्ति करने की जरूरत हैffers और शोधन प्रक्रिया में इस्तेमाल एक समाधान के रूप में।
  3. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में आपूर्ति की proteinase कश्मीर के समाधान के लिए आवश्यक मात्रा में जोड़ें और वर्कस्टेशन पर स्लॉट ए में जगह। इसके अलावा, कार्य केंद्र के शेखर अनुभाग के लिए 2 मिलीलीटर सुरक्षित ताला microcentrifuge नमूना ट्यूब आरबी की (शुद्ध किया जा रहा नमूनों की संख्या के बराबर) आवश्यक संख्या में जोड़ें।
    1. नमूना ट्यूब के lids सुरक्षित रूप से मशीन शुरू में सभी आवश्यक प्लास्टिक और तरल पदार्थ का अनुरोध के लिए उपलब्ध हैं सुनिश्चित करने के लिए कार्य केंद्र को स्कैन करता है जब एक त्रुटि में परिणाम होगा ऐसा करने के लिए एक विफलता के बाद से, कार्य केंद्र पर उचित स्थान में रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करें भागना।
  4. पैथोजन जांच प्रोटोकॉल, और वर्कस्टेशन सही ढंग से लोड किया गया था कि यह सुनिश्चित करने के बाद स्क्रीन के माध्यम से पढ़ा - मानव मल - कार्य केंद्र पर टचस्क्रीन का उपयोग करना, डीएनए स्टूल का चयन करें। एक बार जब सभी चेक स्क्रीन इस प्रोटोकॉल को चलाने के लिए, का चयन करें प्रारंभ पारित कर रहे हैं।
    1. 12 से अधिक नमूनों से डीएनए निकालने यदि 12 नमूनों में से एक रन वर्कस्टेशन पर पूरा करने के लिए ~ 72 मिनट लगते हैं, के बाद से, नमूने के अगले सेट के लिए homogenization प्रक्रिया (चरण 1) शुरू करते हैं।
  5. बाद में नीचे की ओर विश्लेषण के लिए जब तक जरूरत -20 डिग्री सेल्सियस पर, रोटर एडेप्टर से नमूने निकालें उन्हें टोपी, और जगह।
    1. इस बिंदु पर, एक centrifugation / वाष्पीकरण आधारित प्रणाली का उपयोग करते हुए एक व्यक्ति को नमूना (कुल का विश्लेषण राशि = 1 जी) के लिए 3 को दोहराने purifications गठबंधन। Tris-ETDA बफर के 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए प्रतिकृति और फिर से Elute जुडा है।

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Representative Results

इस अध्ययन के लिए, ताजा मल गोबर और कूड़े के नमूने दक्षिणी अमेरिका में एक व्यावसायिक विवाद के घर (~ 25,000 पक्षी) से बरामद किए गए। broilers (Gallus Gallus) कोब-500 को पार कर रहे थे, और वे नमूने के समय में 59 दिन पुरानी थे। ताजा मल और कूड़े के नमूने (waterer / फीडर लाइनों के बीच में, waterer / फीडर लाइनों के पास, पैड ठंडा के पास है, और निकास प्रशंसकों के पास) घर के भीतर चार अलग क्षेत्रों से बरामद किया है, और इन क्षेत्रों में से प्रत्येक से नमूने जमा पांच निहित गया उस क्षेत्र के भीतर से नमूने हैं। घर के चार क्षेत्रों से नमूने निकाले और मात्रात्मक / गुणात्मक नमूना प्रकार (मल या कूड़े) के अनुसार अलग-अलग विश्लेषण किया गया। नीचे प्रस्तुत डेटा दोनों पर्यावरण नमूना प्रकार के लिए पूरे घर के लिए मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं।

कुल -16 rDNA abundances, एक नमूना भीतर निहित कुल बैक्टीरियल समुदाय के एक अनुमान, पहले प्रकाशित एक का उपयोग कर निर्धारित किया गया हैएड qPCR के प्रोटोकॉल 20, और मूल्यों के डीएनए की राशि प्रत्येक निकासी विधि से बरामद का उपयोग कर सामान्यीकृत थे (fluorometric विश्लेषण के आधार पर पहले से 21 में वर्णित है। तीन निकासी तरीकों का, चित्रा एक यांत्रिक विधि लगातार उच्चतम कुल बैक्टीरियल सामान्यीकृत जीन बहुतायत प्रदान की जाती है कि पता चलता है दोनों मल और कूड़े के नमूने के लिए अनुमान (5.85 ± 0.16 और 5.56 ± 0.08 प्रवेश 10 -16 rDNA प्रतियां एनजी -1 डीएनए क्रमशः, निकाले); एंजाइमी विधि लगातार सबसे कम मल और कूड़े अनुमान (4.83 ± 0.54 और 4.61 ± प्रदान की है, जबकि 0.13 प्रवेश 10 -16 rDNA प्रतियां -1 डीएनए), क्रमशः निकाली गई। उपन्यास संकर निकासी विधि 0.05 ≤ (पी) एंजाइमी विधि की तुलना में अधिक है, लेकिन के लिए यांत्रिक विधि करने के लिए सांख्यिकीय इसी तरह काफी होना पाया गया है कि सामान्यीकृत -16 rDNA abundances झुकेंगे एनजी मल और कूड़े के नमूने (5.50 ± 0.16 दोनों और5.23 ± 0.14 प्रवेश एनजी 10 -16 rDNA प्रतियां -1 क्रमशः निकाले डीएनए)। इसलिए, यांत्रिक और संकर निकासी तरीकों दोनों एंजाइमी विधि की तुलना में इन नमूनों के भीतर कुल बैक्टीरियल समुदायों का एक बड़ा गुणात्मक अनुमान प्रदान की है।

Navas-मोलिना एट अल। में समीक्षा के रूप में गुणात्मक प्रत्येक नमूने के प्रकार और निकासी विधि, microbiomic कार्यप्रवाह से कुल बैक्टीरियल समुदायों का आकलन करने के क्रम में (2013) 22 इस्तेमाल किया गया था। संक्षेप में, -16 rRNA जीन की V4 के क्षेत्र पीसीआर MiSeq अनुक्रमण एडेप्टर युक्त प्राइमरों और Golay बारकोड के साथ परिलक्षित किया गया था और Illumina MiSeq मंच 23,24 पर अनुक्रम। कच्चे अनुक्रमण डेटा तो डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग QIIME 1.7.0 देव 25,26,27 में संसाधित किया गया था। अनुक्रम डाटा प्रोसेसिंग शामिल: गुणवत्ता छानने; OTU क्लस्टरिंग (97% दहलीज पर खुले संदर्भ) UCLUST 27 का उपयोग करते हुए; <0.005% 22 की OTU बहुतायत छानने स्तर31; Greengenes 13_5 संदर्भ डेटाबेस में 28 के खिलाफ आरडीपी क्लासीफायर का उपयोग वर्गीकरण असाइनमेंट; Greengenes कोर 28 सेट के खिलाफ PyNAST 29 के साथ अनुक्रम संरेखण; FastTree 30 का उपयोग कर वंशावली पेड़ निर्माण। core_diversity_analyses.py स्क्रिप्ट सभी अल्फा बीटा विविधता मेट्रिक्स को चलाने के लिए और नमूना प्रति 7865 दृश्यों की एक अनुक्रमण गहराई पर सभी भूखंडों, चार्ट, और आँकड़े उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

चुना डीएनए निष्कर्षण विधि बरामद मल और कूड़े microbiomes पर एक स्पष्ट प्रभाव का प्रदर्शन किया। जाति-स्तर पर शुरू (तालिका 1), समग्र डेटा (मल और कूड़े के नमूने दोनों के लिए लेखांकन) तरीकों अत्यधिक विघटनकारी homogenization के कदम (यांत्रिक, संकर) ग्राम पॉजिटिव संघ के उच्च abundances साथ आम तौर पर सामने आए समुदायों (98.0 रखने से पता चला कि और 97.49%, एंजाइमी विधि (81.74%) को क्रमशः) रिश्तेदार। इसके विपरीत, ग्राम नकारात्मक संघया तो यांत्रिक (1.89%) या संकर (2.38%) तरीकों की तुलना में एंजाइमी विधि (17.49%) से बरामद समग्र बैक्टीरियल समुदाय का एक बहुत बड़ा हिस्सा प्रतिनिधित्व किया। समग्र microbiomic प्रोफाइल पर यह अंतर निकासी प्रभाव और ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नकारात्मक जीवों की व्यापकता को प्रभावी ढंग से जीनस स्तर पर प्रदर्शन किया गया (चित्रा 2) एंजाइमी विधि microbiome से पता चला है, जबकि अपेक्षाकृत समान microbiomic प्रोफाइल के उत्पादन व्याप्ति में यांत्रिक और संकर विधियों बरामद taxa की रिश्तेदार बहुतायत का एक अलग वितरण। उदाहरण के लिए, मल के नमूने spp.in ग्राम नकारात्मक Alistipes (ए के साथ लाल ब्लॉक; कुल समुदाय के 7.71%) (एंजाइमी विधि गंभीर रूप से अन्य दो निष्कर्षण तरीकों के लिए उंगलियों के निशान में कम हो जाता है लाल तीर का उपयोग कर निकाला; 0.47 -0.81%), लेकिन ग्राम पॉजिटिव लैक्टोबैसिलस एसपीपी। Enz का उपयोग करते समय (एल के साथ बड़े बैंगनी ब्लॉक) और अधिक प्रचलित कम हो जाता है थायांत्रिक या संकर तरीकों (क्रमशः 57.22% और 61.85%) की तुलना में ymatic विधि (42.71%)। Taxa की रिश्तेदार abundances तीन निष्कर्षण तरीकों के बीच कुछ मतभेद का प्रदर्शन करते हुए बहरहाल, पता चला taxa की कुल संख्या दोनों मल (92 taxa 112) और कूड़े (96 से 112 taxa) के लिए सभी तीन तरीकों के लिए इसी तरह के थे।

एंजाइमी विधि लगातार लगातार इन पारिस्थितिक के लिए सबसे कम अनुमान दिखाने यांत्रिक विधि के साथ, मल और कूड़े के नमूने लिए दोनों (chao1, जातिवृत्तिक विविधता, और equitability मैट्रिक्स, क्रमशः का उपयोग) सबसे बड़ी समृद्धि, विविधता, और समता के साथ बैक्टीरियल समुदायों झुकेंगे मानकों (तालिका 2)। संकर विधि लगातार अन्य दो तरीकों के लिए पारिस्थितिक मेट्रिक्स मध्यस्थ का प्रदर्शन किया। सांख्यिकीय, सभी नमूनों से पारिस्थितिक का अनुमान है, की परवाह किए बिना निकासी विधि की, इसी तरह होना पाया गया एंजाइमी विधि हालांकिकूड़े के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए जब यांत्रिक विधि की तुलना में एक काफी अमीर (पी = 0.045) microbiome में परिणाम था। कोई अन्य महत्वपूर्ण मतभेद निष्कर्षण तरीकों के बीच पाया गया, वहीं पारिस्थितिक मापदंडों के बीच सबसे बड़ा मतभेद आम तौर पर संकर विधि अन्य दो तरीकों के लिए समान रूप से अच्छा प्रदर्शन के साथ, एंजाइमी और यांत्रिक तरीकों के बीच पाया गया था; इन निकासी तरीकों का मात्रात्मक आकलन करने के लिए इसी तरह की (चित्रा 1)।

चित्रा 1
चित्रा 1. गुणात्मक बैक्टीरियल समुदाय तुलना डीएनए निष्कर्षण तरीकों पर आधारित है। कॉलम डीएनए की मात्रा के खिलाफ सामान्यीकृत qPCR के द्वारा निर्धारित मल (ठोस सलाखों) से बरामद या कूड़े (धराशायी सलाखों) नमूना (के रूप में मतलब 10 -transformmed -16 rRNA जीन प्रतियां लॉग ऑन प्रतिनिधित्व ) fluorometric दृढ़ संकल्प के आधार पर। गुइन मूल्यों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए गए ई डीएनए निष्कर्षण विधि एक्स अक्ष पर संकेत दिया है। त्रुटि सलाखों 4 को दोहराने के नमूनों के बीच मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक नमूने प्रकार (मल या कूड़े) के लिए, स्तंभ के ऊपर पत्र Tukey के एकाधिक तुलना परीक्षण (पी = 0.05) का उपयोग कर एक तरह से एनोवा विश्लेषण के आधार पर काफी अलग साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 2
डीएनए निष्कर्षण तरीकों चित्रा 2. परिकलित-स्तर microbiomic तुलना। प्रत्येक स्तंभ मल (पहले तीन स्तंभों) और कूड़े के लिए प्रत्येक निकासी विधि के लिए बरामद taxa की (-16 rRNA जीन Illumina MiSeq डेटा के आधार पर) औसत कुल बैक्टीरियल समुदाय (प्रतिनिधित्व करता है पिछले तीन स्तंभों) नमूने हैं। प्रत्येक स्तंभ विवाद के घर के भीतर अलग क्षेत्रों से चार अलग अलग नमूनों की औसत प्रतिनिधित्व करता है। कॉलम के आधार पर पत्र extr इंगित करता हैकार्रवाई विधि (एम = मैकेनिकल, ई = एंजाइमी, एच = संकर)। प्रत्येक स्तंभ में अलग अलग रंग प्रत्येक पीढ़ी के लिए एक समग्र समुदाय के भीतर जीनस, और रंग के रिश्तेदार बहुतायत सभी स्तंभों के लिए ही है प्रतिनिधित्व करते हैं।

तालिका 1
डीएनए निष्कर्षण तरीकों की तालिका 1. जाति-स्तर microbiomic तुलना। रिश्तेदार abundances (% कुल दृश्यों बरामद) प्रत्येक दो ग्राम पॉजिटिव (Actinomycetes और Firmicutes) के डीएनए निष्कर्षण विधि और 3 ग्राम नकारात्मक के लिए (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) संघ दोनों नमूने प्रकार से microbiomic विश्लेषण से बरामद किया।

तालिका 2
आर ichness तालिका 2 जोड़ो तुलना, QIIME का उपयोग कर विश्लेषण जीनस-स्तर microbiomic जीवाणु समुदाय के आधार पर तीन डीएनए निष्कर्षण तरीकों के लिए विविधता, और समता का अनुमान है। दोनों प्रकार नमूना के लिए, जोड़ो में तुलना के तीन संभावित निकासी विधि संयोजन के लिए प्रदर्शन किया गया। का आकलन कुल बैक्टीरियल समुदाय मानकों (chao1 आँकड़ों के आधार पर α-विविधता), विविधता (β-विविधता जातिवृत्तिक विविधता आँकड़ों के आधार पर), और (equitability आँकड़ों के आधार पर) समता समृद्धि शामिल हैं। मान विवाद के घर के भीतर चार अलग क्षेत्र के नमूनों का मतलब है (मानक विचलन) का प्रतिनिधित्व करते हैं, और एक α = 0.05 स्तर जोड़ो में तुलना के बीच महत्व को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस्तेमाल किया डीएनए निष्कर्षण विधि नमूना पहले से 1,3,6 देखा डीएनए निष्कर्षण तरीकों के आश्रित प्रकृति का विश्लेषण करती है समर्थन कर रहा है, दोनों मल और कूड़े के नमूने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक कुल बैक्टीरियल समुदाय अनुमानों प्रभावित। मल और कूड़े के नमूने दोनों के लिए, डीएनए निष्कर्षण तरीकों के प्रदर्शन का क्रम मात्रात्मक (मैकेनिकल> हाइब्रिड> एंजाइमी) और गुणात्मक (एंजाइमी> हाइब्रिड> यांत्रिक) कुल बैक्टीरियल समुदाय अनुमानों के लिए अलग था। संकर विधि उच्चतम मात्रात्मक या गुणात्मक अनुमानों का उत्पादन नहीं किया है, जबकि दोनों ही मामलों में संकर विधि जिससे गुणात्मक और मात्रात्मक कुल का सबसे अच्छा संयोजन के उत्पादन, उच्चतम प्रदर्शन निकासी विधि (चित्रा 1, 2 टेबल) के लिए सांख्यिकीय इसी तरह के थे कि परिणामों का उत्पादन तीन निकासी तरीकों का जीवाणु समुदाय के अनुमानों का परीक्षण किया। यह जीवाणु समुदाय प्रोफ़ाइल उल्लेखनीय है कि पूर्वोत्तर चाहिएइस अध्ययन (चित्रा 2, 1 टेबल) और पर्यावरणीय नमूने 4,5,8,9,11,12 का उपयोग अन्य पिछले अध्ययनों से परिणाम के रूप में देखा तों दृढ़ता, डीएनए निष्कर्षण विधि से प्रभावित किया जा सकता है, और ये अंतर प्रभाव दृढ़ता से हो सकता है अध्ययन विश्लेषण और डेटा की व्याख्या प्रभावित करते हैं। ये जानने के बाद, शोधकर्ताओं ने दृढ़ता से उनके नमूने प्रकार के और एक अध्ययन-दर-अध्ययन के आधार पर प्रयोगात्मक लक्ष्यों के लिए उपयुक्त निष्कर्षण विधि पर विचार करना चाहिए।

उपन्यास संकर विधि की प्रभावशीलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम शक्तिशाली homogenization के बहुत जटिल मल / मिट्टी के matrices से न केवल में बैक्टीरियल कोशिकाओं की रिहाई की सहायता करने के लिए कदम है, लेकिन यह भी ग्राम पॉजिटिव समुदाय के सदस्यों की मुश्किल सेल दीवारों को तोड़ने के लिए है । उच्च मात्रात्मक अनुमानों (चित्रा 1) और इस homogenization के कदम का इस्तेमाल किया है कि दोनों निकासी तरीकों के लिए microbiomes भीतर ग्राम पॉजिटिव Actinobacteria और Firmicutes की उच्च अनुपात ( 1,2,4-6,9 शामिल किया गया था जब में सुधार समुदाय का विश्लेषण करती है कि मल के नमूने का उपयोग कर पिछले अध्ययनों के साथ समझौते में हैं। कोशिकाओं और / या डीएनए एक बार / disassociated रहे हैं इन matrices से रिहा, संकर विधि में "सोने के मानक 'एंजाइमी पद्धति के उपयोग को कुशलता से इन नमूनों से डीएनए शुद्ध। संकर निष्कर्षण प्रोटोकॉल के भीतर एंजाइमी विधि से अवरोध करनेवाला बाध्यकारी कदम का समावेश इस अध्ययन में इस्तेमाल जटिल नमूने पर्यावरण के भीतर मौजूद inhibitors के लिए एक अधिक कुशल हटाने के लिए अनुमति देता है। यांत्रिक निष्कर्षण प्रोटोकॉल से अनुपस्थित है कि यह कदम। इसलिए, एंजाइमी purificat के साथ संयोजन के रूप में एक यांत्रिक homogenization के कदम के अलावा के साथ संकर निष्कर्षण विधि,जारी की डीएनए के आयन, पर्यावरण पोल्ट्री उत्पादन के नमूनों से कुल बैक्टीरियल समुदायों के आकलन के लिए एक कारगर तरीका है।

इस विधि के रूप में वर्णित है, उपयोगकर्ताओं को जागरूक होने की आवश्यकता होगी, जिनमें से कुछ विशिष्ट आवश्यकताओं में शामिल है। सबसे पहले एक उच्चस्तरीय homogenizer के उपयोग के रूप में अच्छी तरह से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निकासी किट के कुछ घटकों है। पिछले अध्ययनों अन्य यांत्रिक मनका-पिटाई कदम या उच्चस्तरीय homogenizers डीएनए निष्कर्षण दक्षता में सुधार और 4,5,9 उपज प्रदर्शन किया है कि; (विभिन्न विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है) इसलिए, यांत्रिक homogenization के कदम का एक अलग प्रकार संकर निकासी विधि में एकीकृत किया जा सकता है। यहाँ भी वर्णित संकर विधि के कारण पोल्ट्री नमूने 15 से पिछले समुदाय आधारित अध्ययन में इस lysing मैट्रिक्स की सफलता के लिए विशेष रूप से पर्यावरण के नमूने के लिए विशिष्ट homogenizer के लिए तैयार है और कर रहे हैं कि मनका-पिटाई ट्यूब का उपयोग करता है, 31-33। यह दिखाया गया है, क्योंकि अंत में, "सोने के मानक 'एंजाइमी डीएनए निष्कर्षण विधि (QIAamp डीएनए स्टूल मिनी किट) मल के नमूने का उपयोग करते समय सबसे प्रभावी एंजाइमी निकासी तरीका हो, संकर प्रोटोकॉल में नमूना डीएनए के enzymatic शुद्धि के लिए आवश्यक है 3,18,19। रोबोट कार्य केंद्र के उपयोग (किट के साथ निर्देश हाथ से किया जा सकता है) की आवश्यकता नहीं है, रोबोट कार्य केंद्र का उपयोग बहुत, थ्रूपुट बढ़ जाती प्रसंस्करण त्रुटि को कम करता है, और आगे बहाव के विश्लेषण 7 के लिए उच्च गुणवत्ता के डीएनए में परिणाम है। इस प्रकार के स्वचालन, मौजूदा यांत्रिक किट का उपयोग संकर विधि का एक और लाभ का प्रतिनिधित्व करता है, जो वर्तमान में उपलब्ध नहीं है।

वर्तमान में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित रोबोट वर्कस्टेशन 72 मिनट में 12 नमूनों की एक अधिकतम प्रसंस्करण के लिए सीमित है, लेकिन प्रारंभिक काम इस विधि उच्च throughput workstati में समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है कि दिखाया गया हैकि 40 मिनट के भीतर 96 नमूने प्रक्रिया कर सकते हैं पर (डेटा) नहीं दिखाया। अधिक नमूनों एक खास दिन के भीतर एक अर्ध-स्वचालित ढंग से संसाधित किया जा सकता है, क्योंकि यह बहुत उच्च throughput विकल्प के आगे के परीक्षण के बहुत संकर विधि की प्रभावकारिता में वृद्धि होगी। इसके अलावा, इस उपन्यास डीएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग प्रारंभिक आंकड़ों में इसे अन्य पोल्ट्री से संबंधित नमूने के लिए प्रभावी है कि दिखाया गया है (उदाहरण के लिए, त्वचा / पंख rinses, शव rinses, cecal सामग्री homogenates) के रूप में अच्छी तरह के रूप में पर्यावरण के नमूने (जैसे, कृषि मिट्टी के अन्य प्रकार स्वाइन मल, घोड़े मल, बकरी मल, गोजातीय मल)। इसलिए, भविष्य के अध्ययन में कई कृषि और पर्यावरण के नमूनों से डीएनए की निकासी के लिए इस संकर विधि की प्रभावकारिता निर्धारित करने की आवश्यकता होगी। भविष्य के अध्ययन से इस विधि के आगे मान्यता संभावित कृषि और पर्यावरण सेटिंग्स की एक किस्म से कुल बैक्टीरियल समुदायों के आकलन के लिए इस पद्धति का एक व्यापक गोद लेने के लिए अनुमति होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix E tube MPBio 6914-050 Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate Solution MPBio 6570-205 Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS Buffer MPBio 6570-201
Buffer ASL (560 ml) Qiagen 19082
FastPrep 24 homogenizer MPBio 116004500 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen 51504
QIAcube24 (110V) Qiagen 9001292 Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024) Qiagen 990352
Filter-Tips, 200 ml (1024) Qiagen 990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) Qiagen 990394 For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml) Qiagen 990381 Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

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References

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 94 डीएनए निष्कर्षण मुर्गी पालन पर्यावरण मल कूड़े अर्द्ध स्वचालित microbiomics qPCR
पोल्ट्री उत्पादन नमूनों से बैक्टीरियल समुदाय के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक हाइब्रिड डीएनए निष्कर्षण विधि
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Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).

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