Abstract
Эффективность протоколов выделения ДНК может быть очень зависит как от типа образца изучается и типов ниже по течению анализов, выполненных. Учитывая, что использование новых методов анализа бактериальное сообщество (например, microbiomics, Метагеномика) становится все более распространенным в сельскохозяйственных и экологических наук и многих проб окружающей среды в рамках этих дисциплин может быть физико-химически и микробиологически уникальный (например, фекальные и образцы помета / постельные принадлежности от птицеводства спектр), надлежащие и эффективные методы выделения ДНК должны быть тщательно подобраны. Таким образом, роман полуавтоматический метод извлечения гибридная ДНК была разработана специально для использования с образцами производства на окружающую птицы. Этот метод является комбинацией двух основных типов выделения ДНК: механические и ферментативных. Двухступенчатый интенсивный ступенчатой механической гомогенизации (с помощью валика избиение специально разработан для Environmenтий) был добавлен в начале "золотого стандарта" ферментативного способа экстракции ДНК образцы фекалий для повышения удаление бактерий и ДНК из матрицы образца и улучшить восстановление грамположительных членов бактериальных сообществ. После того, как ферментативная добыча часть гибридного метода была начата, оставаясь Процесс очистки автоматизирован с использованием роботизированной рабочей станции увеличить пропускную способность и уменьшить ошибку обработки образца. По сравнению с жесткими механическими и ферментативных методов извлечения ДНК, этот роман гибридный метод обеспечивает наилучшее общее совместное выступление при рассмотрении количественных (с использованием 16S рРНК кПЦР) и качественную (с использованием microbiomics) оценки общего бактериальных сообществ при обработке мяса птицы фекалии и образцы для мусора ,
Protocol
1. Механическая Гомогенизация окружающей среды птица Образцы продукции
- Перед экстракцией, установлен на водяной бане до 95 ° С и позволяют время на водяной бане, чтобы достичь этой температуры.
- Взвесить 0,33 г почвы или фекального материала в 2 мл Lysing матрицы Е трубки.
- Не превышайте 0,33 г образца в трубке, так как это вызовет следующие решения превышать пропускную способность трубы.
- Оттепель замороженные образцы до комнатной температуры перед взвешиванием.
- Для анализа в общей сложности 1 г почвы / кал, отвесить 3 репликации 0,33 г образцов для каждого отдельного окружающей образец.
- Магазин образцы при -20 ° С в течение конических труб матричных перед экстракцией, если это необходимо.
- Добавить 825 мкл натрий фосфатного буфера и 275 мкл раствора PLS к пробирку. Смешайте использованием вихревой за ~ 15 сек, а затем центрифуги образцов при 14000 х г в течение 5 мин.
- Слейте supernaдаря добавить 700 мкл буфера ASL. Смешайте с использованием вихрь в течение 5 сек.
- Убедитесь, что имеется свободное пространство (~ 10% от общего объема) доступны в конической трубе в этой точке. Если нет свободного пространства, трубы будут иметь тенденцию к протеканию во время следующей стадии гомогенизации, которая может привести к перекрестного загрязнения и / или потери образца.
- Поместите образцы в FastPrep 24 инструмента, и гомогенизировать образцы при скорости 6,0 м / сек в течение 40 сек.
- Центрифуга гомогенизированный образец при 14000 х г в течение 5 мин. Передача супернатант в стерильную 2 мл микроцентрифужных трубки.
- Чтобы максимизировать восстановление ДНК из образца, повторите шаги 1,4 до 1,6, комбинируя супернатантов в стерильной же, 2 мл микроцентрифужных трубки.
2. Ферментативный Ингибирование ингибиторов от образца гомогенаты
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует QIAamp ДНК стул Mini Kit.
- ВыдержитеСупернатант в C водяной бане 95 ° С в течение 5 мин, чтобы максимизировать восстановление ДНК из оставшихся клеток в супернатанте.
- Инкубируют при 70 ° С для образцов, содержащих в основном грамотрицательных микроорганизмов. Тем не менее, если грамположительные организмы присутствуют (как это имеет место с образцами птицы фекальных), инкубируют при 95 ° С.
- Используйте пластиковые стопорные защелки на микропробирок для того, чтобы трубы не будет "поп" открытым и потенциально теряют объем образца как давление может создать в этих закрытых микропробирок.
- Откройте каждый микроцентрифужную трубку, чтобы освободить от давления, повторно колпачок микроцентрифужных пробирок и смешать с использованием вихрь в течение 15 сек.
- Центрифуга образца при 14 000 мкг в течение 1 мин, снять 1,2 мл супернатанта и поместите его в новый стерильный 2 мл микроцентрифужных трубки.
- Добавить 1 вкладку Inhibitex к каждому образцу, и смешивать с помощью вихря, пока образец не станет равномерно белый / не совсем белого жидкости.
- Избегайте тouching вкладку Inhibitex при размещении его в микроцентрифужных трубки, содержащей образец. Чтобы достичь этого, поместить блистерную упаковку, содержащую вкладку непосредственно над открытой трубки микроцентрифужных и осторожно нажать на вкладку из блистерной упаковки и в микроцентрифужных трубки.
- Инкубируйте образца в течение 1 мин при комнатной температуре (~ 25 ° С) и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин.
- Передача всю жидкость в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин.
- Во избежание любых оставшихся твердых частиц, которые могут быть осаждали в нижней части трубки микроцентрифужных в конце стадии 2,5 при переносе жидкости.
3. Автоматизированная Очистка ДНК с использованием QIAcube Robotic Workstation
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество пластиковых расходных материалов, расположение образец ротора адаптерами в центрифуге, а также необходимые объемы Буферы / решений зависит от питчество образцов, которые в настоящее время работают.
- Добавить элюирования ламп и фильтрующих труб в соответствующие пазы внутри ротора адаптеров. Для каждого образца, добавить 400 мкл к среднему гнездо адаптера ротора. Поместите ротора адаптеры в рабочей станции центрифуге в правильном расположении в зависимости от числа проб очистки.
- Убедитесь, что все крышки трубки микроцентрифужных надежно закреплены в держатель ротора с неспособность сделать это может привести к сдвигу во время одного из этапов центрифугирования протокола очистки.
- Добавьте необходимое количество 1000 мкл и 200 мкл фильтр-советы на рабочую станцию, и заполнить предоставленный буфер бутылки с необходимым объемом буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: буферы, необходимые для этого протокола очистки (AL, AW1, AW2 и АЭ) все содержащиеся в QIAamp ДНК стул Mini Kit. Пользователь должен поставить 100% этанола, который необходим для бу AWffers и в виде раствора, используемого в процессе очистки. - Добавьте требуемый объем поставляемого протеиназы решения K в стерильный 1,5 мл трубки микроцентрифужных и поместить его в слот А на рабочей станции. Кроме того, добавить необходимое количество (равное количеству образцов очищается) из 2 мл безопасной блокировки образца микроцентрифужных пробирках RB в разделе шейкер рабочей станции.
- Убедитесь, что крышки пробирки с образцом надежно помещаются в соответствующие пазы на рабочей станции, так как неспособность сделать это приведет к ошибке, когда машина первоначально сканирует рабочую станцию, чтобы убедиться, все необходимые пластмасс и жидкости для просили запустить.
- Использование сенсорного на рабочей станции, выберите ДНК Стульчик - Человек Стульчик - обнаружение протокола возбудителя и прочитать последующих экранах для того, чтобы станция была загружена правильно. После того как все проверки экраны прошло, выберите Пуск, чтобы запустить этот протокол.
- Если экстракции ДНК из более чем 12 образцов, начать процесс гомогенизации (шаг 1) для следующего набора образцов, так как пробег 12 образцов занимает ~ 72 минут, чтобы завершить на рабочей станции.
- Удалить образцы из ротора адаптеров, крышка их, и место при температуре от -20 ° С до использования в последующих последующих анализов.
- В этот момент, объединить три дублирующие очисток для отдельного образца (общее количество анализировали = 1 г) с использованием / испарения на основе системы центрифугированием. Смешайте повторов и повторного элюата до конечного объема 100 мкл Трис-ЭДТА буфера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для этого исследования, свежие фекальные помет и образцы помета были извлечены из коммерческих птичника (~ 25 000 птиц) в юго-востоке США. Бройлеров (Gallus Gallus) были Кобб-500 крестов, и они были 59 дней на момент отбора проб. Свежие фекальные и подстилки образцы были извлечены из четырех различных областях в доме (рядом охлаждающая подставка, недалеко от поливальщик / фидерных линий, между поливальщик / фидерных линий, а рядом вытяжных вентиляторов), а образцы из каждой из этих областей были включены пять объединенного Образцы изнутри этой области. Образцы из четырех областей дома были извлечены и количественно / качественно анализировать отдельно в зависимости от типа образца (кала или подстилки). Представленные ниже данные представляют собой средние значения для всего дома для обоих типов образцов окружающей среды.
Всего распространенности 16S рДНК, оценка общего бактериального сообщества, содержащейся в образце, были определены с использованием ранее опубликоватьред КПЦР протокола 20, и значения были нормализованы с помощью количество ДНК, выделенной из каждого способа экстракции (на основе флуорометрического анализа описано выше 21. Из трех методов экстракции, на фиг.1 показано, что механический метод последовательно при условии, что высокий общий бактериальный ген нормализованное изобилие оценки для обоих фекальных и подстилки образцов (5,85 ± 0,16 и 5,56 ± 0,08 log 10 16S рДНК копии нг -1 ДНК, выделенную, соответственно), в то время, метод ферментативного последовательно проводили самые низкие фекальные и мусора оценки (4.83 ± 0,54 и 4,61 ± 0,13 журнала 10 16S рДНК копии нг -1 ДНК, выделенную, соответственно). Новый способ гибрид добыча дали нормированные распространенность 16S рДНК, которые были найдены, чтобы быть достоверно (р ≤ 0,05) выше, чем ферментативный метод, но статистически похож на механического метода как фекальные и подстилки образцы (5,50 ± 0,16 и5.23 ± 0,14 журнала 10 16S рДНК копии нг -1 ДНК, извлеченной соответственно). Таким образом, обе механические и гибридные методы добычи обеспечили большую качественную оценку общего объема бактериальных сообществ в этих образцах, чем метод ферментативного.
Для того чтобы качественно оценить общее бактериальных сообществ из каждого типа образца и способа экстракции, в microbiomic процесса, как рассмотрено в Навас-Молина и др. (2013) 22 был использован. Короче говоря, V4 область гена 16S рРНК ПЦР-амплификации с праймерами, содержащими MiSeq секвенирования адаптеры и Golay штрих-кодов и последовательность на платформе Illumina MiSeq 23,24. То Исходные данные секвенирования была обработана в QIIME 1.7.0-DEV 25,26,27 с использованием параметров по умолчанию. Обработка данных последовательность включала: качество фильтрации; ОТУ кластеризации (открытый ссылка на 97% порога) с помощью UCLUST 27; ОТУ уровень фильтрации обилие <0,005% 22, 31; Назначение таксономии с помощью RDP Классификатор против справочной базы данных Greengenes 13_5 28; выравнивание последовательности с PyNAST 29 против основной Greengenes установить 28; филогенетическое Построение дерева с использованием FastTree 30. Core_diversity_analyses.py сценарий был использован для запуска всех альфа бета разнообразия показателей и создать все участки, диаграммы и статистические данные на глубину последовательности 7865 последовательностей в образце.
Выбранный метод выделения ДНК выставлены несомненное влияние на восстановленном фекальных и подстилки microbiomes. Начиная с Тип-уровне (таблица 1), общие данные (с учетом обеих фекальных и подстилки образцов) показал, что методы, обладающие высоко разрушительное стадии гомогенизации (механического, гибрид), как правило, дали сообществ с более высокими численности грамположительных типам (98,0 и 97,49%, соответственно) по отношению к ферментативным методом (81,74%). С другой стороны, грам-отрицательных филпредставляет собой гораздо большую часть общего бактериального сообщества извлекают из ферментативного метода (17,49%) по сравнению с либо механических методов (1,89%) или гибридной (2,38%). Этот эффект дифференциального извлечения от общих microbiomic профилей и распространенность грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов эффективно продемонстрирован на уровне рода (рисунок 2) .The механические и комбинированные методы производства относительно аналогичных microbiomic профили, в то время как метод ферментативного микробиомом показали отличается распределение относительной численности восстановленного таксонов. Например, грамм-отрицательные Alistipes spp.in образцов кала (красный блок с А; 7,71% от общего сообщества) извлекается с помощью метода ферментативного сильно уменьшается в отпечатков пальцев для двух других методов извлечения (красные стрелки; 0,47 -0,81%), но грамположительных Lactobacillus SPP. (Большой фиолетовый блок с L) было гораздо более распространенным уменьшается при использовании ENZСпособ ymatic (42,71%), по сравнению с механическими или гибридных методов (57,22% и 61,85%, соответственно). Тем не менее, в то время как относительное содержание таксонов выставлены некоторые различия между тремя методами экстракции, общее число таксонов обнаружили были одинаковы для всех трех методов и фекальные (92 112 таксонов) и подстилки (96 112 таксонов).
Метод Ферментативный последовательно дали бактериальных сообществ с наибольшим богатством, разнообразием, и равномерности (с помощью chao1, филогенетического разнообразия, и справедливость показатели, соответственно) для обоих фекальных и подстилки образцов, с механическим способом последовательно показывая самые низкие оценки этих экологических Параметры (таблица 2). Гибридный метод последовательно демонстрирует экологических метрик посредника для двух других методов. Статистически, экологические оценки из всех образцов, независимо от способа экстракции, было обнаружено, что аналогичные, хотя и ферментативным способомсделал результат в значительно более богатой (р = 0,045) микробиомом по сравнению с механическим способом при анализе образцов помета. Пока никаких других значительных различий не было обнаружено между методами экстракции, наибольшие различия между экологическими параметрами, как правило, находится между ферментативного и механическим способами, с гибридный метод выполнения одинаково хорошо с двумя другими методами; похож на количественной оценки этих методов экстракции (Рисунок 1).
Рисунок 1. качественное сравнение бактериальное сообщество на основе методов выделения ДНК. Колонны представляют среднее войти 10 -transformmed 16S рРНК генов копии, как определяется кПЦР нормализуется против количества ДНК, выделенной из фекалий (твердых баров) или мусор (пунктирные линии) образца ( на основе флуорометрического определения). Thе Способ экстракции ДНК использовали для получения этих значений отображается на оси абсцисс. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение между 4 образцов репликации. Для каждого типа образца (кала или подстилки), тем выше столбцов буквы представляют значительно различные средства на основе односторонней ANOVA анализа с использованием тест множественного сравнения Тьюки (р = 0,05).
Microbiomic сравнение Рисунок 2. Род-уровень методов выделения ДНК. Каждый столбец представляет собой среднее общее микробное сообщество (на основе гена 16S рРНК Illumina MiSeq данных) восстановленного таксонов для каждого метода экстракции для фекалий (первые три колонки) и подстилки ( Последние три колонки) образцов. Каждый столбец представляет собой среднее из четырех различных образцов из различных областей в птичник. Буква в основании колонны показывает ЕхПИметод действия (M = механический, E = Ферментативный, H = гибрид). Различные цвета в каждом столбце представляют относительное обилие рода в пределах общего сообщества, и цвета для каждого родов является одинаковым для всех столбцов.
Microbiomic Сравнительная таблица 1. Тип уровня методов выделения ДНК. Относительное содержание (% от общего восстановлены последовательности) для каждого метода экстракции ДНК из 2 грамположительных (актиномицетов и Firmicutes) и 3 грам-отрицательных (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) филюмы оправилась от microbiomic анализа из обоих типов образцов.
Таблица 2. Парные сравнения г ichness, Разнообразие и оценки ровность для методов экстракции три ДНК на основе родо-уровня microbiomic бактериальное сообщество анализа с использованием QIIME. Для обоих типов образцов, парные сравнения проводились для трех возможных комбинаций метод извлечения. Общие бактериальные параметры сообщества для оценки являются богатство (α-разнообразия на основе chao1 статистики), разнообразие (β-разнообразия на основе статистики филогенетического разнообразия) и ровность (на основе Справедливость статистики). Значения представляют собой среднее (стандартное отклонение) 4 образцов различных территорий в рамках птичника, и α = 0,05 уровень был использован для определения значимости между парных сравнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой таблице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод извлечения ДНК используется осуществляться количественные и качественные общей сметы бактериальные сообщества в отношении фекальных и подстилки образцов, поддерживая анализы проб зависимый характер методов экстракции ДНК видел ранее 1,3,6. Для обоих фекальных и подстилки образцов, порядок выполнения методов экстракции ДНК была различной для количественного (механические> гибридный> ферментативной) и качественного (ферментативной> гибридный> механические) Общая смета бактериальные сообщества. В то время как гибридный метод не производят самые высокие количественные или качественные оценки, в обоих случаях гибридный метод результаты, которые были статистически похож на самый производительный метод экстракции (рис 1, таблица 2), таким образом, создавая оптимальное сочетание качественного и количественного общей бактериальные оценки община трех методов экстракции испытания. Следует NE отметил, что бактериальное сообщество анкетаES может быть сильно осуществляется методом экстракции ДНК, как видно из результатов этого исследования (рис 2, таблица 1) и других предыдущих исследованиях с использованием проб окружающей среды 4,5,8,9,11,12, и эти дифференциальные эффекты могут сильно влиять на анализ и интерпретацию данных исследования. Зная это, исследователи должны серьезно рассмотреть соответствующий метод извлечения для своих типов образцов и экспериментальных целей на основе учебно-по-исследования.
Ключевым шагом в эффективности нового гибридного метода является мощным стадию гомогенизации значительно помочь в не только выпуск бактериальных клеток из сложных фекальных матриц / почвы, но и сломать жесткие клеточные стенки членов грам-положительных сообщества , Более высокие количественные оценки (Рисунок 1) и высокая доля грамположительных Actinobacteria и Firmicutes в microbiomes для обоих методов извлечения, которые используются этой стадии гомогенизации (
Этот метод, как описано выше, содержит некоторые специфические требования, и пользователи должны быть осведомлены. Первый состоит в использовании высокой мощности гомогенизатора, а также некоторые компоненты коммерчески доступного набора для экстракции. Предыдущие исследования показали, что другие шаги, механическая шарик избиение или мощные гомогенизаторы улучшить эффективность экстракции ДНК и дают 4,5,9; Поэтому, другой тип механической стадии гомогенизации может быть интегрирован в способе гибридом экстракции (хотя может потребоваться использование другой специальной техники). Гибридный метод, описанный здесь, также использует бортовых избиение трубы, которые специально разработаны для гомогенизатора и специфичны для проб окружающей среды в связи с успехом этого лизирующим матрицы в предыдущих исследованиях общинных из образцов мяса птицы 15, 31-33. И, наконец, "золотым стандартом" ферментативный метод экстракции ДНК (ДНК QIAamp Стул Mini Kit) необходим для очистки ферментативного образца ДНК в гибридной протокола, поскольку было показано, что наиболее эффективным методом ферментативной экстракции при использовании фекальные образцы 3,18,19. В то время как использование роботизированной станции не требуется (инструкции к комплекту может быть выполнена вручную), использование роботизированной станции значительно увеличивает пропускную способность, сводит к минимуму ошибку обработки, и приводит к более высокому качеству ДНК для дальнейшего анализа вниз по течению 7. Автоматизация этого типа, используя существующие механические наборы в данный момент недоступна, который представляет еще одно преимущество гибридного метода.
В настоящее время автомат станция описано в данном протоколе ограничен обработки максимум 12 образцов в 72 мин, но предварительная работа показала, что этот метод работает одинаково хорошо в более высокой пропускной способности рабочей станна которые может обрабатывать 96 проб в течение 40 мин (данные не показаны). Дальнейшее тестирование этого намного выше опции пропускная способность значительно повысить эффективность гибридного метода, так как больше образцов может быть обработано в полу-автоматическом режиме в течение обычного рабочего дня. Кроме того, предварительные данные, используя этот новый метод извлечения ДНК показал, что он эффективен для других птицеводческих связанных образцов (например, кожи / перо полоскания, полоскания каркаса, ободочнокишечных гомогенаты контент), а также другие виды проб окружающей среды (например, сельскохозяйственных почв , свиней кал, фекалий лошадей, коз кал, крупного рогатого скота, фекалии). Таким образом, будущие исследования должны определить эффективность этого гибридного метода для извлечения ДНК из многих сельскохозяйственных и экологических образцов. Кроме того проверка этого метода будущих исследований потенциально позволит для более широкого применения этого метода для оценки общего бактериальных сообществ из различных сельскохозяйственных и экологических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
- McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
- Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
- Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
- Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
- Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
- Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
- Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
- Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
- Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
- Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
- Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
- Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
- Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
- Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
- Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
- Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
- Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
