Abstract
فعالية بروتوكولات استخراج الحمض النووي يمكن أن تعتمد بشكل كبير على كل من نوع العينة التي يجري التحقيق فيها وأنواع من التحليلات المصب تنفيذها. يمكن النظر إلى أن استخدام تقنيات تحليل المجتمع البكتيرية الجديدة (على سبيل المثال، microbiomics، metagenomics) أصبحت أكثر انتشارا في مجال العلوم الزراعية والبيئية والعينات البيئية العديدة ضمن هذه التخصصات تكون physiochemically وفريدة من نوعها الميكروبيولوجية (على سبيل المثال، البراز وعينات القمامة / الفراش من الدواجن الطيف الإنتاج)، بحاجة الى طرق استخراج الحمض النووي المناسبة والفعالة ليتم اختياره بعناية. لذلك، تم تطوير DNA هجين طريقة استخراج رواية شبه الآلي خصيصا للاستخدام مع عينات إنتاج الدواجن البيئي. هذا الأسلوب هو مزيج من اثنين من أنواع رئيسية من استخراج الحمض النووي: الميكانيكية والأنزيمية. ومكثفة خطوة التجانس الميكانيكية من خطوتين (باستخدام حبة الضرب وضعت خصيصا للبالبيءهتمت إضافة عينات التل) إلى بداية "المعيار الذهبي" الأنزيمية طريقة استخراج الحمض النووي لعينات البراز لتعزيز إزالة البكتيريا وDNA من عينة مصفوفة وتحسين الانتعاش من أعضاء غرام إيجابي المجتمع البكتيري. مرة واحدة وقد بدأ الجزء استخراج الأنزيمي من الأسلوب الهجين، تم أتمتة عملية تنقية المتبقية باستخدام محطة عمل الروبوتية لزيادة الإنتاجية وتقليل العينة خطأ معالجة العينة. وبالمقارنة مع طرق استخراج الحمض النووي صارمة الميكانيكية والأنزيمية، وقدم هذه الطريقة الهجينة الرواية على أفضل أداء مجتمعة عموما عند النظر في الكمية (باستخدام 16S الرنا الريباسي QPCR) والنوعي (باستخدام microbiomics) تقديرات من إجمالي المجتمعات البكتيرية عند معالجة البراز الدواجن والعينات القمامة .
Protocol
1. التجانس الميكانيكي للدواجن البيئي عينات الإنتاج
- قبل استخراج، تعيين حمام مائي إلى 95 درجة مئوية، وتسمح في الوقت حمام الماء لتصل إلى أن درجة الحرارة.
- تزن من 0.33 غرام من التربة أو المواد البرازية إلى 2 مل الناشر مصفوفة E الأنبوب.
- لا تتجاوز 0.33 غرام من العينة في الأنبوب، لأن هذا سوف يتسبب في الحلول التالية لتتجاوز قدرة الأنبوب.
- العينات المجمدة ذوبان الجليد لRT قبل وزنها.
- من أجل تحليل ما مجموعه 1 غرام من التربة / البراز، وتزن من 3 تكرار 0.33 ز عينات لكل عينة البيئية الفردية.
- عينات في مخزن -20 ° C داخل أنابيب مصفوفة المخروطية قبل الاستخراج، وإذا لزم الأمر.
- إضافة 825 ميكرولتر فوسفات الصوديوم العازلة و 275 ميكرولتر من PLS حل لأنبوب العينة. مزيج باستخدام الدوامة ل~ 15 ثانية ثم الطرد المركزي العينات في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- صب supernaتانت وإضافة 700 ميكرولتر من العازلة ASL. مزيج باستخدام الدوامة لمدة 5 ثانية.
- ضمان وجود فراغ الرأس (~ الحجم الكلي 10٪) متوفرة في أنبوب مخروطي الشكل في هذه المرحلة. إذا لم يكن هناك فراغ الرأس، فإن أنابيب لديهم ميل إلى تسرب خلال الخطوة التجانس المقبلة مما قد يؤدي إلى انتقال التلوث و / أو فقدان العينة.
- وضع العينات في FastPrep 24 الصك، والتجانس العينات بسرعة 6.0 م / ثانية لمدة 40 ثانية.
- أجهزة الطرد المركزي لعينة متجانسة في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف لالعقيمة 2 مل أنبوب microcentrifuge.
- لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش DNA من العينة، كرر الخطوات من 1،4-1،6، والجمع بين supernatants في نفس عقيمة، 2 مل أنبوب microcentrifuge.
2. الأنزيمية تثبيط المانعون من عينة الخليط
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول كيت QIAamp DNA البراز البسيطة.
- احتضانطاف في 95 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق لتعظيم الانتعاش DNA من أي الخلايا المتبقية داخل طاف.
- احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة العينات التي تحتوي على الكائنات الحية في معظمها سلبية الغرام. لكن في حالة وجود (كما هو الحال مع عينات البراز الدواجن) الكائنات إيجابية الجرام، في احتضان 95 درجة مئوية.
- استخدام البلاستيك قفل قطات على أنابيب microcentrifuge للتأكد من أن أنابيب لن "البوب" فتح ويحتمل أن تفقد حجم العينة كما ضغط يمكن أن تتراكم في هذه أنابيب microcentrifuge مختومة.
- فتح كل أنبوب microcentrifuge للافراج عن الضغط، وإعادة للحد الأقصى للأنابيب microcentrifuge ومزيج باستخدام الدوامة لمدة 15 ثانية.
- الطرد المركزي العينة في 14،000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة 1.2 مل من طاف ووضعه في العقيمة 2 مل أنبوب microcentrifuge جديد.
- إضافة 1 التبويب InhibitEx لكل عينة، ومزيج باستخدام الدوامة حتى تصبح العينة أبيض موحد / السائل من البيض.
- تجنب رouching علامة التبويب InhibitEx حين وضعها في أنبوب microcentrifuge تحتوي العينة. ولتحقيق ذلك، وضع حزمة نفطة التي تحتوي على علامة التبويب مباشرة فوق أنبوب microcentrifuge مفتوحة ودفع برفق فوق علامة التبويب للخروج من حزمة نفطة وإلى أنبوب microcentrifuge.
- احتضان العينة لمدة 1 دقيقة في RT (~ 25 ° C) وأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- نقل جميع السائل إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
- تجنب أي الجسيمات المتبقية التي قد تكون مكعبات في الجزء السفلي من الأنبوب microcentrifuge في نهاية الخطوة 2.5 عند نقل السائل.
3. الآلي DNA تنقية باستخدام الروبوتية محطة QIAcube
ملاحظة: عدد من المواد الاستهلاكية البلاستيكية، وترتيب محولات عينة الدوار داخل أجهزة الطرد المركزي، والكميات المطلوبة من مخازن / حلول تعتمد على الأسطواناتنوفمبر من العينات التي يتم تشغيل.
- إضافة أنابيب شطف وأنابيب مرشح لفتحات مناسبة داخل محولات الدوار. لكل عينة، إضافة 400 ميكرولتر إلى فتحة الوسطى من محول الدوار. وضع محولات الدوار في أجهزة الطرد المركزي محطة عمل في الترتيب الصحيح وفقا لعدد من العينات التي تنقيته.
- تأكد من أن جميع الأغطية أنبوب microcentrifuge يتم تأمينها بشكل صحيح داخل محول الدوار منذ الفشل في القيام بذلك قد يؤدي إلى قص خلال واحدة من الخطوات الطرد المركزي من بروتوكول تنقية.
- إضافة العدد المطلوب من 1،000 ميكرولتر و 200 ميكرولتر تصفية نصائح إلى محطة العمل، وملء الزجاجات عازلة المتوفرة مع حجم المطلوب من المخازن المؤقتة.
ملاحظة: وترد جميع المخازن المؤقتة اللازمة لهذا البروتوكول تنقية (AL، AW1، AW2، وAE) ضمن مجموعة QIAamp DNA البراز البسيطة. يحتاج المستخدم لتوريد الإيثانول بنسبة 100٪ أن هناك حاجة لبو AWffers وكحل المستخدمة في عملية التنقية. - إضافة الكمية المطلوبة من بروتين K الحل الموردة إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ووضعه في فتحة وعلى محطة العمل. أيضا، إضافة العدد المطلوب (مساو لعدد العينات التي يجري تنقيتها) من 2 مل آمنة للانغلاق أنابيب العينات ميكروسنتريفوج RB إلى قسم شاكر من محطة العمل.
- تأكد من أن أغطية الأنابيب عينة يتم وضعها بإحكام في فتحات مناسبة على محطة العمل، لأن عدم القيام بذلك سيؤدي إلى خطأ عندما يكون الجهاز بمسح البداية محطة العمل للتأكد كلها البلاستيك والسوائل اللازمة المتاحة للطلب تشغيل.
- استخدام الشاشة التي تعمل باللمس على محطة العمل، حدد البراز DNA - البراز البشري - بروتوكول كشف مسببات الأمراض، وقراءة من خلال شاشات اللاحقة للتأكد من أن محطة العمل تم تحميلها بشكل صحيح. مرة واحدة يتم تمرير جميع الشاشات الاختيار، حدد ابدأ لتشغيل هذا البروتوكول.
- إذا استخراج الحمض النووي من أكثر من 12 عينة، تبدأ عملية التجانس (الخطوة 1) للمجموعة التالية من العينات، منذ سلسلة من 12 عينة يأخذ ~ 72 دقيقة لإكمال على محطة العمل.
- إزالة عينات من محولات الدوار، وكأب لهم، ومكان في -20 ° C لحين الحاجة إليها لتحليل المصب اللاحقة.
- في هذه المرحلة، والجمع بين التنقيات تكرار 3 لعينة الفردية (المجموع تحليل كمية = 1 غرام) باستخدام / نظام قائم على التبخر الطرد المركزي. الجمع بين مكررات وإعادة أزل إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من العازلة تريس، ETDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لهذه الدراسة، تم انتشال فضلات البراز الطازجة وعينات القمامة من منزل التجاري اللاحم (~ 25،000 الطيور) في جنوب شرق الولايات المتحدة. وكانت الفراريج (جالوس جالوس) كوب-500 الصلبان، وكانوا 59 يوما من العمر في وقت أخذ العينات. تم انتشال عينات برازية والقمامة جديدة من أربع مناطق داخل المنزل (قرب تبريد وسادة، بالقرب من خطوط الساقي / المغذية، في ما بين السطور الساقي / المغذية، وبالقرب مراوح العادم)، وعينات من كل من هذه المجالات يتضمن خمسة المجمعة عينات من داخل تلك المنطقة. تم استخراج عينات من المجالات الأربعة من المنزل وكميا / تحليلها نوعيا على حدة وفقا لنوع العينة (برازي أو القمامة). البيانات الواردة أدناه تمثل القيم المتوسطة للمنزل بأكمله لكلا النوعين عينة البيئية.
وتم تحديد مجموع الكميات المتوفرة 16S rDNA، تقديرا من المجتمع البكتيري الكلي الواردة ضمن عينة، وذلك باستخدام نشر سابقاتم تطبيع إد QPCR بروتوكول 20، والقيم باستخدام كمية DNA تعافى من كل طريقة استخراج (على أساس تحليل فلوروميتريك الموصوفة سابقا 21. ومن بين أساليب الاستخراج الثلاثة، ويبين الشكل 1 أن الطريقة الميكانيكية قدم باستمرار على أعلى نسبه البكتيرية تطبيع فرة الجين تقديرات لكل من عينات برازية والقمامة (5.85 ± 0.16 و 5.56 ± 0.08 سجل 10 نسخ 16S rDNA نانوغرام -1 الحمض النووي المستخرج، على التوالي)، في حين، وطريقة الأنزيمية قدم باستمرار على أقل التقديرات البرازية والقمامة (4.83 ± 0.54 و 4.61 ± 0.13 سجل 10 نسخ 16S rDNA NG -1 الحمض النووي المستخرج، على التوالي). أثمرت طريقة استخراج الهجين رواية تطبيع فرة 16S rDNA التي وجدت ليكون معنويا (P ≤ 0.05) أعلى من طريقة الأنزيمية، ولكن مماثل إحصائيا لطريقة ميكانيكية ل كل من عينات برازية والقمامة (5.50 ± 0.16 و5.23 ± 0.14 سجل 10 نسخ 16S rDNA نانوغرام -1 الحمض النووي المستخرج، على التوالي). لذلك، قدمت كل من أساليب الاستخراج الميكانيكية والهجين تقدير النوعي أكبر من إجمالي المجتمعات البكتيرية داخل هذه العينات من الطريقة الأنزيمية.
من أجل تقييم نوعيا مجموع المجتمعات البكتيرية من كل نوع العينة وطريقة الاستخراج، وسير العمل microbiomic كما استعرضت في نافاس مولينا وآخرون (2013) 22 تم استخدام. وباختصار، فإن المنطقة V4 من الجينات 16S الرنا الريباسي كان PCR تضخيم مع الاشعال تحتوي على محولات التسلسل MiSeq والباركود غولي والتسلسل على منصة البورشيد MiSeq 23،24. ثم تم معالجة البيانات تسلسل الخام في QIIME 1.7.0-DEV 25،26،27 باستخدام المعلمات الافتراضية. وتضمن معالجة البيانات تسلسل: جودة الترشيح. OTU التجميع (المرجع المفتوح في عتبة 97٪) باستخدام UCLUST 27؛ اتو مستوى وفرة تصفية <0.005٪ 22، 31؛ احالة التصنيف باستخدام RDP مصنف ضد قاعدة البيانات المرجعية Greengenes 13_5 28؛ تسلسل المحاذاة مع PyNAST 29 ضد تعيين الأساسية Greengenes 28؛ بناء شجرة النشوء والتطور باستخدام FastTree 30. تم استخدام برنامج نصي core_diversity_analyses.py لتشغيل جميع المقاييس التنوع ألفا بيتا وتوليد كل المؤامرات والمخططات والإحصاءات على عمق تسلسل 7865 تسلسل لكل عينة.
عرضت طريقة استخراج الحمض النووي اختار تأثير واضح على تعافى microbiomes البراز والقمامة. بدءا من مستوى بعائلة (الجدول 1)، وكشفت البيانات الشاملة (المحاسبة للعينات برازية والقمامة) أن أساليب امتلاك خطوة مدمرة للغاية التجانس (الميكانيكية، الهجين) المجتمعات أسفرت عادة مع وفرة أعلى من إيجابية الجرام من الكائنات الحية (98.0 و97.49٪، على التوالي) نسبة إلى طريقة الأنزيمية (81.74٪). على العكس، من الكائنات الحية سلبية الغراميمثل جزءا أكبر بكثير من المجتمع البكتيري الكلي تعافى من طريقة الأنزيمي (17.49٪) مقارنة إما الميكانيكية (1.89٪) أو الهجينة (2.38٪) الأساليب. وقد تجلى هذا التأثير استخراج التفاضلي على ملامح microbiomic الشاملة وانتشار الكائنات الحية غرام إيجابية وسلبية الغرام بشكل فعال على مستوى جنس (الشكل 2)، والطرق الميكانيكية وهجينة تنتجها ملامح microbiomic متشابهة نسبيا، في حين أظهر طريقة الأنزيمية microbiome توزيع مختلف من الوفرة النسبية للأصناف استردادها. على سبيل المثال، Alistipes سالبة الجرام spp.in عينات البراز (كتلة حمراء مع A؛ 7.71٪ من المجتمع الكلي) المستخرجة باستخدام يتم خفض طريقة الأنزيمية بشدة في بصمات الأصابع لأساليب الاستخراج الآخران (السهام الحمراء، 0.47 -0.81٪)، ولكن موجبة الجرام الملبنة النيابة. كان (كتلة الأرجواني كبير مع L) أكثر انتشارا بكثير ينخفض عند استخدام ENZطريقة ymatic (42.71٪) بالمقارنة مع الطرق الميكانيكية أو الهجينة (57.22٪ و 61.85٪ على التوالي). ومع ذلك، في حين أن الكميات المتوفرة النسبية للأصناف أظهرت بعض الاختلافات بين أساليب الاستخراج الثلاثة، وكان العدد الإجمالي للأصناف اكتشاف مماثل لجميع الأساليب الثلاثة لكل من برازي (92 من 112 الأصناف) والقمامة (96 من 112 الأصناف).
طريقة الأنزيمية أسفرت باستمرار المجتمعات البكتيرية مع أعظم ثراء والتنوع والتوزيع المتساوي (باستخدام chao1، ذو علاقة بالتطور النوعي البيولوجي، ومقاييس الإنصاف، على التوالي) لكل من عينات برازية والقمامة، مع أسلوب الميكانيكية تظهر باستمرار على أقل التقديرات لهذه إيكولوجية المعلمات (الجدول 2). طريقة الهجين أظهرت باستمرار المقاييس البيئية وسيط لطريقتين الأخرى. إحصائيا، وتقديرات البيئية من جميع العينات، بغض النظر عن طريقة استخراج، تم العثور على لتكون مشابهة، على الرغم من أن طريقة الأنزيميلم يؤدي إلى ثراء معنويا (P = 0.045) microbiome مقارنة مع الطريقة الميكانيكية عند تحليل عينات القمامة. بينما لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين غيرها من أساليب الاستخراج، وعادة ما وجدت أعظم الفروق بين المعلمات البيئية بين الأنزيمية والطرق الميكانيكية، مع أسلوب هجين أداء جيد على قدم المساواة إلى طريقتين الأخرى؛ على غرار التقييم الكمي لهذه أساليب الاستخراج (الشكل 1).
الشكل 1. النوعية مقارنة المجتمع البكتيري على أساس أساليب استخراج الحمض النووي. الأعمدة تمثل متوسط تسجيل 10 -transformmed 16S الرنا الريباسي نسخ الجينات على النحو الذي يحدده QPCR تطبيع ضد كمية DNA تعافى من البراز (القضبان الصلبة) أو القمامة (الحانات متقطع) عينة ( بناء على تقرير فلوروميتريك). عشريشار البريد طريقة استخراج الحمض النووي المستخدمة للحصول على هذه القيم على محور س. وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري بين 4 عينات تكرار. لكل نوع العينة (البراز أو الفضلات)، خطابات فوق أعمدة تمثل وسائل مختلفة إلى حد كبير على أساس في اتجاه واحد تحليل ANOVA باستخدام متعددة اختبار المقارنة توكي (ع = 0.05).
مقارنة microbiomic الشكل 2. على مستوى جنس من أساليب استخراج الحمض النووي. ويمثل كل عمود على متوسط مجموع المجتمع البكتيري (على أساس 16S الرنا الريباسي الجينات البورشيد MiSeq البيانات) من الأنواع تعافى لكل طريقة استخراج لالبراز (الأعمدة الثلاثة الأولى) والقمامة ( مشاركة ثلاثة أعمدة) العينات. يمثل كل عمود متوسط أربع عينات مختلفة من مناطق متميزة داخل المنزل اللاحم. الرسالة في قاعدة الأعمدة يشير إلى EXTRطريقة عمل (M = الميكانيكية، E = الأنزيمية، H = الهجين). ألوان مختلفة في كل عمود تمثل الوفرة النسبية للجنس داخل المجتمع العام، ولون لكل أجناس هي نفسها لجميع الأعمدة.
مقارنة الجدول 1. على مستوى الأسرة في اللغات microbiomic أساليب الاستخراج DNA. فرة النسبية (استرداد٪ من إجمالي تسلسل) لكل طريقة استخراج الحمض النووي من 2 إيجابية الجرام (الشعيات Actinomycetes وافيرميكوتس) و 3 سالبة الجرام (Bacteriodetes، متقلبات، Tenericutes) من الكائنات الحية تعافى من التحليل microbiomic من كل أنواع العينات.
الجدول 2. مقارنات البشرى من ص ichness، والتنوع، وتقديرات التوزيع المتساوي للأساليب الاستخراج ثلاثة DNA على أساس المجتمع البكتيري microbiomic على مستوى جنس التحليلات باستخدام QIIME. لكلا النوعين عينة، وأجريت مقارنات البشرى للتركيبات طريقة استخراج ثلاثة الممكنة. وتشمل مجموع المعلمات المجتمع البكتيرية تقييم ثراء (التنوع α استنادا إلى إحصائية chao1)، والتنوع (β-التنوع على أساس إحصائية ذو علاقة بالتطور النوعي البيولوجي)، والتوزيع المتساوي (استنادا إلى إحصائية الإنصاف). القيم تمثل المتوسط (الانحراف المعياري) من 4 عينات منطقة مميزة داخل المنزل اللاحم، وكانت تستخدم لα = 0.05 المستوى لتحديد أهمية المقارنات بين البشرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة استخراج الحمض النووي المستخدمة تنفذ إجمالي تقديرات المجتمع البكتيرية الكمية والنوعية لكل من عينات برازية والقمامة، ودعم تحاليل العينة طبيعة تعتمد أساليب الاستخراج DNA كما كان في السابق 1،3،6. لكل من عينات برازية والقمامة، وكان ترتيب أداء أساليب الاستخراج DNA مختلف لالكمي (الميكانيكية> الهجين> الأنزيمية) والنوعي (الأنزيمية> الهجين> الميكانيكية) إجمالي تقديرات المجتمع البكتيرية. في حين أن طريقة الهجين لم تسفر عن أعلى التقديرات الكمية أو النوعية، أنتج في كلتا الحالتين فإن الطريقة المختلطة النتائج التي كانت مشابهة إحصائيا إلى أعلى أداء طريقة استخراج (الشكل 1، الجدول 2)، وبالتالي إنتاج أفضل مزيج من مجموع نوعي وكمي تقديرات المجتمع البكتيرية من أساليب الاستخراج ثلاثة اختبارها. يجب NE أنها لاحظت أن البكتيريا ملف تعريف المجتمعوفاق يمكن أن تتم بشدة طريقة استخراج الحمض النووي، كما رأينا في نتائج هذه الدراسة (الشكل 2، الجدول 1) والدراسات السابقة أخرى باستخدام العينات البيئية 4،5،8،9،11،12، وربما هذه الآثار التفاضلية بقوة التأثير على تحليل وتفسير البيانات الدراسة. هذا مع العلم، يجب على الباحثين أن تنظر بقوة في طريقة استخراج المناسب لأنواع عينة وأهدافها التجريبية على أساس دراسة تلو الدراسة.
خطوة أساسية لفعالية أسلوب الرواية الهجين هي الخطوة التجانس قوية لتساعد إلى حد كبير ليس فقط في الإفراج عن الخلايا البكتيرية من البراز المصفوفات / التربة معقدة، ولكن أيضا لكسر جدران الخلايا أكثر صرامة من أفراد المجتمع إيجابية الجرام . التقديرات الكمية أعلى (الشكل 1)، ونسبة أعلى من إيجابية الجرام شعاويات وافيرميكوتس داخل microbiomes على حد سواء أساليب الاستخراج التي تستخدم هذه الخطوة التجانس (
هذه الطريقة، كما هو موضح، ويحتوي على بعض المتطلبات الخاصة للمستخدمين والتي سوف تحتاج إلى أن تكون على علم بها. الأول هو استخدام الخالط رفيع المستوى، فضلا عن بعض مكونات عدة استخراج المتاحة تجاريا. وأظهرت دراسات سابقة أن غيرها من الخطوات الميكانيكية حبة الضرب أو المجانسة عالية تعمل بالطاقة تحسين كفاءة استخراج الحمض النووي وتسفر 4،5،9. لذلك، يمكن دمج نوع مختلف من خطوة التجانس الميكانيكية في طريقة استخراج الهجين (على الرغم من أن استخدام معدات متخصصة مختلفة قد تكون مطلوبة). طريقة الهجين الموصوفة هنا أيضا يستخدم أنابيب الضرب حبة التي تم تصميمها خصيصا لالخالط ومحددة للعينات البيئية نظرا لنجاح هذه المصفوفة الناشر في الدراسات المجتمعية السابقة من عينات الدواجن 15، 31-33. وأخيرا، فإن "المعيار الذهبي" الأنزيمية طريقة استخراج الحمض النووي (DNA QIAamp البراز البسيطة كيت) مطلوب لتنقية الأنزيمية من الحمض النووي العينة في بروتوكول الهجين، منذ فقد تبين أن الأسلوب الأكثر فعالية استخراج الأنزيمية عند استخدام عينات البراز 3،18،19. في حين أن استخدام محطة العمل الروبوتية غير مطلوب (تعليمات مع عدة يمكن أن يقوم بها اليد)، واستخدام محطة العمل الروبوتية يزيد كثيرا الإنتاجية، ويقلل من خطأ معالجة، والنتائج في أعلى جودة DNA لمزيد من التحليل المصب 7. الأتمتة من هذا النوع، وذلك باستخدام مجموعات الميكانيكية القائمة غير متوفر حاليا، وهو ما يمثل ميزة أخرى من الأسلوب الهجين.
حاليا، محطة العمل الروبوتية الموصوفة في هذا البروتوكول يقتصر على معالجة بحد أقصى 12 عينة في 72 دقيقة، ولكن أظهرت الأعمال الأولية أن هذا الأسلوب يعمل بشكل جيد على قدم المساواة في الإنتاجية أعلى workstatiعلى هذا يمكن معالجة 96 العينات في غضون 40 دقيقة (لا تظهر البيانات). وإجراء مزيد من التجارب لهذا الخيار إنتاجية أعلى بكثير يعزز كثيرا من فعالية من الأسلوب الهجين منذ مزيد من العينات يمكن أن تتم معالجتها بطريقة مؤتمتة شبه غضون يوم نموذجي. أيضا، البيانات الأولية باستخدام هذا الأسلوب استخراج الحمض النووي أثبتت أن رواية أنها فعالة للعينات أخرى ذات الصلة الدواجن (على سبيل المثال، يشطف الجلد / ريشة، يشطف الذبيحة، الخليط المحتوى الأعور)، فضلا عن أنواع أخرى من العينات البيئية (على سبيل المثال، والتربة الزراعية والبراز الخنازير، البراز الحصان، الماعز البراز، البراز البقري). لذلك، سوف تحتاج الدراسات المستقبلية لتحديد مدى فعالية هذا الأسلوب الهجين لاستخراج الحمض النووي من عينات كثيرة الزراعية والبيئية. سوف مزيد من التحقق من صحة هذه الطريقة من قبل دراسات مستقبلية محتملة تسمح لتوسيع نطاق اعتماد هذه الطريقة لتقييم من إجمالي المجتمعات البكتيرية من مجموعة متنوعة من إعدادات الزراعية والبيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
- McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
- Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
- Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
- Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
- Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
- Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
- Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
- Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
- Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
- Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
- Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
- Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
- Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
- Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
- Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
- Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
- Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
