Abstract
De doeltreffendheid van DNA-extractie protocollen kunnen zeer afhankelijk zowel van het type monster dat wordt onderzocht en de soorten stroomafwaartse analyses uitgevoerd. Gezien het feit dat het gebruik van nieuwe bacteriële gemeenschap analysetechnieken (bv microbiomics, metagenomica) wordt steeds meer voor in de landbouw- en milieuwetenschappen en veel milieu-monsters binnen deze disciplines kan fysiochemisch en microbiologisch unieke (bijvoorbeeld fecale en strooisel / beddengoed monsters uit zijn de pluimveehouderij spectrum), moeten passende en effectieve DNA-extractie methoden zorgvuldig worden gekozen. Daarom werd een nieuwe semi-automatische hybride DNA extractiemethode speciaal ontwikkeld voor milieu pluimveehouderij monsters. Deze methode is een combinatie van de twee belangrijkste soorten DNA-extractie: mechanische en enzymatische. Een twee-staps intense mechanische homogenisatiestap (met kraal-beating speciaal ontwikkeld voor environmental monsters) werd toegevoegd aan het begin van de "gouden standaard" enzymatische DNA extractiemethode voor fecale monsters naar de verwijdering van bacteriën en DNA uit het monster matrix verhogen en de terugwinning van Gram-positieve bacteriën leden van de gemeenschap. Nadat de enzymatische extractie gedeelte van de hybride methode werd ingeleid, werd het resterende zuiveringswerkwijze geautomatiseerd met een robot werkstation monsterdoorvoer verhogen en monster verwerkingsfout verminderen. In vergelijking met de strenge mechanische en enzymatische DNA-extractie methoden, deze nieuwe hybride methode voorwaarde dat de beste totale gecombineerde prestaties bij het overwegen van kwantitatieve (met behulp van 16S rRNA qPCR) en kwalitatieve (met behulp van microbiomics) een raming van de totale bacteriële gemeenschappen bij het verwerken van gevogelte uitwerpselen en zwerfvuil monsters .
Protocol
1. Mechanische homogenisering van Milieu pluimveeproductie Monsters
- Vóór extractie, stellen een waterbad tot 95 ° C en laat het waterbad tijd om die temperatuur te bereiken.
- Weeg 0,33 g van de bodem of fecaal materiaal in een 2 ml Lysing Matrix E buis.
- Niet meer dan 0,33 g monster in de buis, aangezien de volgende oplossingen leiden tot de capaciteit van de buis overschrijden.
- Ontdooi bevroren monsters naar RT voorafgaand aan het wegen.
- Met het oog op een totaal van 1 g grond / uitwerpselen te analyseren, wegen uit 3 repliceren 0,33 g monsters voor elke individuele milieu monster.
- WINKEL monsters bij -20 ° C binnen de conische matrix buisjes voorafgaand aan extractie, indien noodzakelijk.
- Voeg 825 ul natriumfosfaatbuffer en 275 ul van PLS oplossing voor een monster buis. Meng met een vortex gedurende ~ 15 seconden en centrifugeer de monsters bij 14.000 xg gedurende 5 minuten.
- Schenk de Supernatant en voeg 700 ul van Buffer ASL. Meng met behulp van een vortex gedurende 5 sec.
- Zorg ervoor dat er headspace (~ 10% totale volume) beschikbaar in de conische buis op dit punt. Als er geen vrije ruimte wordt de buizen neiging te lekken gedurende de volgende homogenisatiestap die kunnen leiden tot kruisbesmetting en / of monster verlies hebben.
- Plaats de monsters in een FastPrep 24 Instrument, en homogeniseer de monsters met een snelheid van 6,0 m / sec tot 40 sec.
- Centrifugeer het gehomogeniseerde monster bij 14.000 xg gedurende 5 minuten. Breng de bovenstaande een steriele 2 ml microcentrifugebuis.
- Om het DNA herstel van het monster te maximaliseren, herhaalt u de stappen 1,4-1,6, het combineren van de bovenstaande vloeistoffen in dezelfde steriele, 2 ml microcentrifugebuis.
2. Enzymatische Remming van remmers van Monster Homogenaten
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de QIAamp DNA Stool Mini Kit.
- Incubeer desupernatans in een 95 ° C waterbad gedurende 5 min om DNA herstel van de resterende cellen in het supernatant maximaliseren.
- Incubeer bij 70 ° C voor monsters die voornamelijk Gram-negatieve organismen. Maar als Gram-positieve organismen aanwezig zijn (wat het geval is bij pluimvee fecale monsters) zijn, incubeer bij 95 ° C.
- Met plastic bevestigingen aan de reactievaatjes zodat de buizen niet "pop" open en potentieel monstervolume verliezen mogelijke opbouw van druk in deze gesloten reactievaatjes.
- Open elke microcentrifugebuis om de druk, re-cap de microcentrifugebuizen los en meng met behulp van een vortex gedurende 15 sec.
- Centrifugeer het monster bij 14.000 xg gedurende 1 min, verwijdert 1,2 ml van de bovenstaande vloeistof en breng deze in een nieuwe steriele 2 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 1 tab Inhibitex aan elk monster, en meng met behulp van een vortex tot de steekproef wordt een gelijkmatig wit / off-witte vloeistof.
- Vermijd touching het tabblad Inhibitex terwijl het plaatsen van het in de microcentrifugebuis met het monster. Om dit te bereiken, plaatst de blisterverpakking met de tab direct boven de open microcentrifugebuisje en duw het tabblad uit de blisterverpakking en in de microcentrifugebuisje.
- Incubeer het monster gedurende 1 min bij kamertemperatuur (~ 25 ° C) en gecentrifugeerd bij 14.000 xg gedurende 5 minuten.
- Breng alle vloeistof op een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 5 minuten.
- Vermijd resterende deeltjes die eventueel gepelleteerd onderaan de microcentrifugebuis aan het einde van stap 2.5 bij het overbrengen van de vloeistof.
3. Geautomatiseerde DNA Purification Met behulp van de QIAcube Robotic Workstation
OPMERKING: Het aantal plastic verbruiksgoederen, de opstelling van het monster rotor adapters in de centrifuge, en de benodigde volumes van de buffers / oplossingen zijn afhankelijk van de number van de monsters die worden geleid.
- Voeg elutiebuisjes en filter buizen naar de juiste sleuven in de rotor adapters. Voor elk monster, voeg 400 ul aan het middelste sleuf van de rotor adapter. Plaats de rotor adapters in het werkstation centrifuge in de juiste opstelling volgens het aantal monsters gezuiverd.
- Zorg ervoor dat alle van de microcentrifugebuisje deksels goed zijn vastgezet binnen de rotor adapter omdat een mislukking te doen kan resulteren in het scheren tijdens een van de centrifugeren stappen van de zuivering protocol.
- Voeg de vereiste aantal 1.000 III en 200 pi filter-tips om het werkstation, en vul de geleverde buffer flessen met het vereiste volume van buffers.
OPMERKING: De voor deze zuivering protocol (AL, AW1, AW2, en AE) buffers zijn allemaal opgenomen in de QIAamp DNA Stool Mini Kit. De gebruiker moet 100% ethanol die nodig is voor de AW BU leverenffers en als een oplossing in het zuiveringsproces. - Voeg de vereiste hoeveelheid van de geleverde proteinase K oplossing in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en plaats deze in een sleuf op het werkstation. Voeg ook het vereiste aantal (gelijk aan het aantal monsters gezuiverd) van 2 ml safe-lock microcentrifuge monsterbuizen RB het gedeelte shaker van het werkstation.
- Zorg ervoor dat de deksels van het monster buizen goed zijn geplaatst in de juiste sleuven op het werkstation, aangezien een niet te doen zal resulteren in een foutmelding wanneer de machine voor het eerst scant het werkstation om ervoor te zorgen dat alle benodigde kunststoffen en vloeistoffen zijn beschikbaar voor de gevraagde draaien.
- Met behulp van het touchscreen op het werkstation, selecteer het DNA Kruk - Human Kruk - detectie van pathogenen Protocol, en lezen via de volgende schermen om ervoor te zorgen dat het werkstation correct werd geladen. Zodra alle check-schermen worden doorgegeven, selecteert u Start om dit protocol uit te voeren.
- Als het extraheren van DNA van meer dan 12 monsters, beginnen de homogenisering proces (stap 1) voor de volgende reeks monsters, omdat een run van 12 monsters neemt ~ 72 min in te vullen op het werkstation.
- Verwijder de monsters van de rotor adapters, cap hen en plaats bij -20 ° C totdat het nodig is voor daaropvolgende stroomafwaartse analyses.
- Op dit punt, combineren de 3 herhaalde zuiveringen een individueel monster (totaal geanalyseerde hoeveelheid = 1 g) met een centrifugatie / verdamping systeem. Combineer de duplo en opnieuw uitstromen tot een eindvolume van 100 pl Tris-EDTA buffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor deze studie werden verse uitwerpselen uitwerpselen en zwerfvuil monsters hersteld van een commerciële vleeskuikens huis (~ 25.000 vogels) in het zuidoosten van de Verenigde Staten. De vleeskuikens (Gallus gallus) waren Cobb-500 kruist, en ze waren 59 dagen oud op het moment van de bemonstering. Verse uitwerpselen en zwerfvuil monsters werden hersteld van vier verschillende gebieden binnen het huis (in de buurt van cooling pad, in de buurt van de waterer / aanvoerlijnen, tussen de waterer / aanvoerlijnen, en in de buurt van afzuigventilatoren), en monsters van elk van deze gebieden bevatte vijf gepoolde monsters uit binnen dat gebied. Monsters van de vier gebieden van het huis werden geëxtraheerd en kwantitatief / kwalitatief apart geanalyseerd volgens monster type (fecale of nest). Onderstaande gegevens geven de gemiddelde waarden voor het hele huis voor zowel het milieu soorten monsters.
Totaal 16S rDNA abundanties, een schatting van de totale bacteriële gemeenschap binnen een steekproef, werden bepaald met behulp van een eerder publicerened qPCR protocol 20, en de waarden werden genormaliseerd met de hoeveelheid DNA werd uit elke extractiemethode (gebaseerd op fluorometrische analyse eerder beschreven 21. Van de drie extractiemethoden figuur 1 blijkt dat de mechanische methode consequent de hoogste totale bacteriële genormaliseerd gen overvloed ramingen voor zowel de fecale en zwerfvuil monsters (5,85 ± 0,16 en 5,56 ± 0,08 log 10 16S rDNA kopieën ng -1 DNA gewonnen, respectievelijk), en dat, de enzymatische methode consequent de laagste fecale en zwerfvuil schattingen (4,83 ± 0,54 en 4,61 ± 0,13 log10 16S rDNA kopieën ng -1 DNA geëxtraheerd, respectievelijk). De nieuwe hybride extractie methode leverde genormaliseerde 16S rDNA dichtheden die werden gevonden (p ≤ 0.05) lager dan de enzymatische methode, maar statistisch vergelijkbaar met de mechanische methode significant zowel de fecale en zwerfvuil monsters (5.50 ± 0.16 en5.23 ± 0.14 log 10 16S rDNA kopieën ng -1 DNA, respectievelijk onttrokken). Daarom is zowel de mechanische als hybride extractie methoden een grotere kwalitatieve schatting van de totale bacteriële gemeenschappen binnen deze monsters dan de enzymatische methode.
Om de totale bacteriële kwalitatieve evaluatie van elk monster en extractiemethode, de microbiomic workflow beoordeeld in Navas-Molina et al. (2013) 22 werd gebruikt. Kortom, de V4 gebied van het 16S rRNA gen werd door PCR geamplificeerd met primers die MiSeq sequencing adapters en Golay barcodes en de sequentie van de Illumina MiSeq platform 23,24. Ruwe sequencing gegevens werden vervolgens verwerkt in QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 met behulp van de standaard parameters. Sequence gegevensverwerking opgenomen: kwaliteit-filtering; OTU clustering (open-verwijzing op 97% -drempel) met behulp van UCLUST 27; OTU overvloed filtering niveau van <0,005% 2231; taxonomie opdracht met behulp van de RDP Classifier tegen de Greengenes 13_5 referentiedatabank 28; sequentiealignering met PyNAST 29 tegen de Greengenes kernset 28; fylogenetische boom constructie met FastTree 30. De core_diversity_analyses.py script werd gebruikt om alle alpha beta diversiteit metrics lopen en om alle percelen, grafieken en statistieken te genereren op een sequencing diepte van 7865 sequenties per monster.
De gekozen DNA-extractie methode vertoonden een duidelijke invloed op de herstelde fecale en zwerfvuil microbiomes. Vanaf het phylum-niveau (tabel 1), de totale gegevens (goed voor zowel fecale monsters en strooisel) onthulde dat werkwijzen bezitten de zeer verstorend homogenisatiestap (mechanisch, hybride) typisch leverde gemeenschappen met hogere dichtheden van Gram-positieve phyla (98,0 en 97,49%, respectievelijk) ten opzichte van de enzymatische methode (81,74%). Omgekeerd, Gram-negatieve phylavertegenwoordigde een veel groter deel van de totale bacteriële gemeenschappen gewonnen uit de enzymatische methode (17.49%) vergeleken met hetzij de mechanische (1.89%) of hybride (2.38%) methoden. Dit verschil extractie effect op de totale microbiomic profielen en de prevalentie van Gram-positieve en Gram-negatieve organismen is effectief gebleken bij het genus niveau (Figuur 2) .De mechanische en hybride werkwijzen relatively soortgelijke microbiomic profielen, terwijl de enzymatische methode microbiome toonde een andere verdeling van de relatieve rijkdom van de teruggewonnen taxa. Bijvoorbeeld, Gram-negatieve Alistipes spp.in de feces monsters (het rode blok met A, 7,71% van de totale gemeenschap) geëxtraheerd met behulp van de enzymatische methode ernstig in de vingerafdrukken van de andere twee extractiemethoden verlaagd (rode pijlen; 0,47 -0,81%), maar de Gram-positieve Lactobacillus spp. (Grote paarse blok met de L) was veel vaker wordt verlaagd bij gebruik van de Enzymatic methode (42,71%) in vergelijking met de mechanische of hybride methoden (57,22% en 61,85%, respectievelijk). Niettemin, terwijl de relatieve abundanties van de taxa vertoonden een aantal verschillen tussen de drie winningsmethoden, het totale aantal taxa ontdekt waren vergelijkbaar voor alle drie methoden voor zowel de fecale (92 112 taxa) en strooisel (96 van 112 taxa).
De enzymatische methode consequent bacteriële gemeenschappen met de grootste rijkdom, diversiteit en gelijkheid (met behulp van de chao1, fylogenetische diversiteit en billijkheid metrics, respectievelijk) voor zowel de fecale en zwerfvuil monsters, met de mechanische methode consistent met de laagste schattingen voor deze ecologische opgeleverd parameters (Tabel 2). De hybride methode consistent aangetoond ecologische metrics tussenpersoon de andere twee methoden. Statistisch, de ecologische schattingen van alle monsters, ongeacht extractiewerkwijze, bleken vergelijkbaar, hoewel enzymatische methoderesulteerde in een significant rijkere (p = 0.045) microbiome opzichte mechanische methode bij de analyse van het strooisel monsters. Terwijl geen andere significante verschillen gevonden tussen winningsmethoden, werden de grootste verschillen tussen de ecologische parameters die typisch tussen de enzymatische en mechanische methoden, met de hybride methode presteren evengoed voor de andere twee methoden; vergelijkbaar met de kwantitatieve beoordeling van deze extractiemethoden (figuur 1).
Figuur 1. Kwalitatieve bacteriële gemeenschap vergelijking op basis van DNA-extractie methoden. Kolommen vertegenwoordigen de gemiddelde log 10 -transformmed 16S rRNA-gen kopieën zoals bepaald door qPCR genormaliseerd ten opzichte van de hoeveelheid DNA hersteld van fecale (massieve balken) en strooisel (gestippelde staven) monster ( gebaseerd op fluorometrische bepaling). The DNA extractie methode gebruikt om deze waarden te verkrijgen is aangegeven op de x-as. De fout balken geven de standaardafwijking tussen de 4 identieke monsters. Voor elk monster type (Feces en strooisel), de letters boven de kolommen stellen significant verschillende middelen op basis van één-weg ANOVA analyse met behulp van Tukey's meervoudige vergelijkingstest (p = 0,05).
Figuur 2. Genus-niveau microbiomic vergelijking van de DNA-extractie methoden. Elke kolom is het gemiddelde van de totale bacteriële gemeenschap (gebaseerd op 16S rRNA-gen Illumina MiSeq gegevens) van teruggewonnen taxa voor elke extractie methode voor de ontlasting (eerste drie kolommen) en zwerfvuil ( laatste drie kolommen) monsters. Elke kolom is het gemiddelde van vier verschillende monsters uit verschillende gebieden binnen de grill huis. De brief aan de voet van de kolommen geeft de extractie methode (M = Mechanical, E = Enzymatische, H = Hybrid). De verschillende kleuren in elke kolom geven de relatieve abundantie van een geslacht binnen de algehele gemeenschap en kleur voor elk genera is hetzelfde voor alle kolommen.
Tabel 1. Phylum-niveau microbiomic vergelijking van DNA-extractie methoden. Relatieve dichtheden (% totaal hersteld sequenties) voor elke DNA-extractie methode van de 2 Gram-positieve (Actinomycetes en Firmicutes) en 3 Gram-negatieve (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) phyla hersteld van de microbiomic analyse van beide monsters types.
Tabel 2. paarsgewijze vergelijkingen van r ichness, Diversiteit, en gelijkmatigheid ramingen voor de drie DNA-extractie methoden op basis van genus-niveau microbiomic bacteriële gemeenschap analyses met behulp van QIIME. Voor beide soorten monsters, paarsgewijze vergelijkingen werden uitgevoerd voor de drie mogelijke extractiemethode combinaties. De totale bacteriële gemeenschappen parameters geëvalueerd omvatten rijkheid (α-diversiteit gebaseerd op de chao1 statistiek), diversiteit (β-diversiteit gebaseerd op fylogenetische diversiteit statistiek) en gelijkmatigheid (gebaseerd op billijkheid statistiek). Waarden vertegenwoordigen het gemiddelde (standaarddeviatie) van 4 verschillende area monsters binnen de grill huis, en een α = 0.05 niveau werd gebruikt om significantie tussen paarsgewijze vergelijkingen te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De DNA-extractie methode geschiedt de kwantitatieve en kwalitatieve totale bacteriële gemeenschap schattingen voor zowel de fecale en zwerfvuil monsters, het ondersteunen van de analyses van monsters afhankelijke karakter van de DNA-extractie methoden eerder 1,3,6 gezien. Voor zowel de fecale en zwerfvuil monsters, de volgorde van uitvoering van de DNA-extractie methoden was anders voor de kwantitatieve (Mechanische> Hybrid> Enzymatic) en de kwalitatieve (Enzymatic> Hybrid> Mechanical) totale bacteriële gemeenschap schattingen. Hoewel de hybride methode niet de hoogste kwantitatieve of kwalitatieve schattingen opleverden, in beide gevallen de hybride methode geproduceerde resultaten die statistisch vergelijkbaar met de best presterende extractiemethode (Figuur 1, Tabel 2) waren, om daardoor de beste combinatie van kwalitatieve en kwantitatieve totale bacteriële gemeenschap schattingen van de drie extractie methoden getest. Het moet ne opgemerkt dat de bacteriële gemeenschap profiles sterk kan worden bewerkstelligd door DNA extractiemethode, gezien in de resultaten van deze studie (Figuur 2, Tabel 1) en andere eerdere studies met milieumonsters 4,5,8,9,11,12 en deze differentiële effecten kunnen sterk invloed op de analyse en interpretatie van de onderzoeksgegevens. Dit wetende, moeten onderzoekers sterk overwegen de geschikte extractiemethode voor hun steekproef types en experimentele doelen op een studie-by-studie basis.
Een belangrijke stap om de doeltreffendheid van de nieuwe hybride methode krachtige homogenisatiestap sterk helpen bij niet alleen de afgifte van bacteriële cellen van het complex fecale / bodem matrices, maar ook breken de hardere celwanden van Grampositieve gemeenschapsleden . De hogere kwantitatieve ramingen (figuur 1) en het grotere aandeel van Gram-positieve Actinobacteria en Firmicutes binnen de microbiomes beide methods dat deze homogenisatiestap gebruikt (
Deze methode, zoals beschreven, bevat een aantal specifieke eisen van die gebruikers zullen zich bewust moeten zijn. De eerste is het gebruik van een krachtige homogenisator evenals enkele bestanddelen van een commercieel verkrijgbare extractie kit. Eerdere studies toonden aan dat andere mechanische kraal-beating stappen of high-powered homogeniseerders verbeteren DNA-extractie-efficiëntie en de opbrengst 4,5,9; Daarom kan een ander type mechanische homogenisatiestap worden geïntegreerd in de hybride extractiemethode (hoewel het gebruik van verschillende gespecialiseerde apparatuur kan nodig zijn). De hybride werkwijze hier ook beschreven gebruikt de kraal verslaan buizen die speciaal zijn ontworpen voor de homogenisator en specifiek voor milieumonsters dankzij het succes van deze lyseren matrix voorgaande community based studies van pluimvee monsters 15, 31-33. Tenslotte wordt de "gouden standaard" enzymatische DNA extractiemethode (QIAamp DNA Mini Kit Kruk) vereist voor de enzymatische zuivering van het DNA-monster in de hybride protocol, omdat is aangetoond dat de meest effectieve enzymatische extractiemethode bij gebruik van fecale monsters 3,18,19. Hoewel het gebruik van de robot werkstation niet vereist (bij de set kan worden uitgevoerd met de hand), het gebruik van de robot werkstation verhoogt doorvoer, minimaliseert verwerkingsfout, en resulteert in hogere kwaliteit DNA voor stroomafwaarts analyse 7. Automatisering van dit type, met de bestaande mechanische kits is niet beschikbaar, hetgeen een ander voordeel van de hybride methode vertegenwoordigt.
Momenteel wordt de robot werkstation beschreven in dit protocol beperkt tot verwerking maximaal 12 monsters in 72 min, maar voorbereidende werk heeft aangetoond dat deze methode werkt even goed in de hogere doorvoer Workstatiop dat 96 monsters kunnen verwerken binnen 40 minuten (gegevens niet getoond). Nader onderzoek van deze aanzienlijk hoger debiet zal sterk verbeteren van de effectiviteit van de hybride methode, omdat meer monsters in een semi-automatische wijze in een typische dag kan worden verwerkt. Ook voorlopige gegevens met behulp van deze nieuwe DNA-extractie methode heeft aangetoond dat het effectief is voor andere gevogelte gerelateerde monsters (bijv huid / veren spoelingen, karkas spoelingen, cecal inhoud homogenaten), evenals andere vormen van milieu-monsters (bijv landbouwbodems , varkens uitwerpselen, paard uitwerpselen, geit uitwerpselen, runder ontlasting). Daarom zullen toekomstige studies moeten de werkzaamheid van dit hybride werkwijze voor de extractie van DNA bepalen van veel agrarische en milieumonsters. Verdere validatie van deze methode door toekomstige studies zou mogelijk zorgen voor een bredere toepassing van deze methode voor de beoordeling van de totale bacteriële gemeenschappen uit een verscheidenheid van landbouw- en milieu-instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
- McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
- Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
- Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
- Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
- Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
- Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
- Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
- Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
- Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
- Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
- Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
- Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
- Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
- Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
- Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
- Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
- Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
