Abstract
Effekten av DNA extraktion protokoll kan vara mycket beroende av både vilken typ av prov som har undersökts och vilka typer av analyser nedströms utförda. Med tanke på att användningen av nya bakteriesamhället analystekniker (t.ex. Microbiomics, metagenomik) blir allt vanligare inom jordbruks- och miljövetenskap och många miljöprover inom dessa discipliner kan vara physiochemically och mikrobiologiskt unik (t.ex. fekal och strö / sängkläder prover från fjäderfäproduktion spektrum), lämpliga och effektiva DNA utvinningsmetoder måste noga utvalda. Därför var en roman halvautomatisk hybrid DNA-extraktion metod som utvecklats speciellt för användning med fjäderfä miljöproduktionsprover. Denna metod är en kombination av de två vanligaste typerna av DNA-extraktion: mekanisk och enzymatisk. En två-steg intensiv mekanisk homogeniseringssteg (med kula-stryk specifikt utformade för environmental prover) sattes till början av den "gyllene standarden" enzymatisk DNA-extraktionsmetod för fekala prover för att förbättra avlägsnandet av bakterier och DNA från provmatrisen och förbättra återvinningen av grampositiva bakteriella samhällsmedlemmar. När den enzymatiska extraheringsdel av hybridmetoden inleddes, var den återstående reningsprocessen automatiseras med hjälp av en robot arbetsstation för att öka provgenomströmning och minska prov bearbetningsfel. I jämförelse med de strikta mekaniska och enzymatiska DNA extraktionsmetoder, denna nya hybridmetod som den bästa totala kombinerade prestanda när man överväger kvantitativ (med 16S rRNA qPCR) och kvalitativ (med Microbiomics) uppskattningar av de totala bakteriesamhällen vid bearbetning hönsgödsel och strö prover .
Protocol
1. Mekanisk Homogenisering av miljöfjäderfäproduktionen Prover
- Före extraktion, ställa ett vattenbad till 95 ° C och låta vattenbadet tid att nå den temperaturen.
- Väg upp 0,33 g jord eller fekalt material till en 2 ml lyserings Matrix E röret.
- Inte överstiga 0,33 g av provet i röret, eftersom detta kommer att orsaka följande lösningar för att överskrida kapaciteten hos röret.
- Tina frysta prover till RT före vägning.
- För att kunna analysera totalt 1 g jord / avföring, väg upp 3 replikera 0,33 g prover för varje enskild miljöprov.
- Förvara proverna vid -20 ° C inom de koniska matrisrören före extraktion, om det behövs.
- Lägg 825 l Natrium fosfatbuffert och 275 pl PLS-lösning till ett provrör. Blanda med hjälp av en virvel för ~ 15 sek och centrifugera sedan proverna vid 14.000 xg under 5 minuter.
- Häll av supernatant och tillsätt 700 ìl av buffert ASL. Blanda genom att använda en vortex för 5 sek.
- Se till att det finns headspace (~ 10% total volym) tillgängliga i den koniska röret vid denna punkt. Om det inte finns något gasutrymme, kommer rören har en tendens att läcka under nästa homogeniseringssteget som kan leda till korskontaminering och / eller provförlust.
- Placera prov till en FastPrep 24 Instrument, och homogenisera proverna vid en hastighet av 6,0 m / sek i 40 sek.
- Centrifugera den homogeniserade provet vid 14.000 xg under 5 minuter. Överför supernatanten till ett sterilt 2 ml mikrocentrifugrör.
- För att maximera DNA återhämtning från provet, upprepa steg 1,4-1,6, kombinerar supernatanterna i samma sterila, 2 ml mikrocentrifugrör.
2. Enzymatisk Hämning av inhibitorer från Sample Homogen
OBS: Detta protokoll använder QIAamp DNA Pall Mini Kit.
- Inkuberasupernatanten i en 95 ° C vattenbad i 5 min för att maximera DNA återhämtning från eventuella kvarvarande celler i supernatanten.
- Inkubera vid 70 ° C för prover som innehåller mestadels gramnegativa organismer. Men om grampositiva organismer är närvarande (vilket är fallet med fjäderfä fekalprover), inkubera vid 95 ° C.
- Använd plast låsning klipp på mikrocentrifugrör för att säkerställa att rören inte kommer att "poppa" öppen och potentiellt förlora provvolym som trycket kan byggas upp i dessa slutna mikrocentrifugrör.
- Öppna varje mikrocentrifugrör att släppa trycket, åter cap de mikrocentrifugrör och blanda med hjälp av en virvel i 15 sek.
- Centrifugera provet vid 14.000 xg i 1 min, avlägsna 1,2 ml av supernatanten och placera den i en ny steril 2 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg en flik InhibitEx till varje prov, och blanda med hjälp av en virvel tills provet blir en likformigt vit / benvit vätska.
- Undvik touching fliken InhibitEx medan placera den i mikrocentrifugrör innehåller provet. För att åstadkomma detta, placera blisterförpackning innehållande fliken direkt över öppen mikrocentrifugrör och tryck försiktigt fliken ur blisterförpackningen och in i mikrocentrifugrör.
- Inkubera provet under 1 min vid RT (~ 25 ° C) och centrifugera vid 14.000 xg under 5 minuter.
- Överför all vätska till en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera vid 14000 xg under 5 minuter.
- Undvik eventuella återstående partiklar som kan ha pelleterade på botten av mikrocentrifugrör vid slutet av steg 2,5 vid överföring av vätska.
3. Automatiserad DNA Purification Använda QIAcube Robotic Workstation
OBS: Antalet plast förbrukningsvaror, arrangemanget av provrotor adaptrar inom centrifugen, och de nödvändiga volymerna av buffertar / lösningar är beroende av numlet prover som håller på att springa.
- Lägg elueringstider rör och filterrören till lämpliga slots inom rotor adaptrar. För varje prov, tillsätt 400 | il till mellanskåran adapterns rotorn. Placera rotoradaptrarna i centrifugen arbetsstation i korrekt arrangemang enligt antalet sampel att renas.
- Se till att alla mikrocentrifugrör lock sitter ordentligt fast i adapter rotor eftersom en underlåtenhet att göra detta kan resultera i klippning under en av centrifuge stegen i reningsprotokollet.
- Lägg önskat antal 1.000 il och 200 pl filterspetsar till arbetsstationen, och fylla de medföljande buffertflaskor med erforderlig volym buffertar.
OBS: De buffertar som krävs för denna reningsprotokoll (AL, AW1, AW2 och AE) är alla som finns i QIAamp DNA Pall Mini Kit. Användaren måste kunna leverera 100% etanol som behövs för AW buffers och som en lösning som används i reningsprocessen. - Lägg erforderlig volym medföljande proteinas K-lösning i en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör och placera den i skåran A på arbetsstationen. Lägg också till det nödvändiga antalet (lika med det antal prov som renas) av 2 ml säkra lås mikro provrör RB till shaker delen av arbetsstationen.
- Se till att locken på provrören är ordentligt placerad i rätt hål på arbetsstationen, eftersom en underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i ett fel när maskinen initialt skannar arbetsstationen för att se till att alla nödvändiga plast och vätskor är tillgängliga för den begärda köra.
- Använda pekskärmen på arbetsstationen, välj DNA Pall - Mänsklig Pall - Pathogen Detection Protokollet, och läsa igenom de efterföljande skärmarna för att se till att arbetsstationen laddades korrekt. När alla kryss skärmar passerat, välj Start för att köra det här protokollet.
- Om utvinna DNA från mer än 12 prover, påbörja homogeniseringsprocessen (steg 1) för nästa uppsättning av prover, eftersom en körning av 12 prover tar ~ 72 minuter för att slutföra på arbetsstationen.
- Ta proverna från rotor adaptrar, mössa dem, och plats vid -20 ° C tills det behövs för efterföljande analyser nedströms.
- Vid denna punkt, kombinera de tre likadana reningar för ett enskilt prov (totalt analysebelopp = 1 g) med användning av en centrifugering / förångning baserat system. Kombinera de replikat samt åter eluera tills en slutlig volym av 100 | il Tris-ETDA buffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För denna studie var färska avförings spillning och strö prover återhämtat sig från en kommersiell broiler hus (~ 25.000 fåglar) i sydöstra USA. De slaktkycklingar (Gallus gallus) var Cobb-500 korsar, och de var 59 dagar gammal vid tiden för provtagningen. Färska fekal och strö prover återhämtat sig från fyra olika områden inom huset (nära kylning pad, nära waterer / matarledningar, i mellan waterer / matarlinjer, och nära frånluftsfläktar), och prover från var och en av dessa områden innehöll fem poolade prover från inom det området. Prover från de fyra delar av huset extraherades och kvantitativt / kvalitativt analyseras separat enligt provtyp (fekal eller strö). De data som presenteras nedan representerar medelvärden för hela huset för både miljömässiga provtyper.
Totalt 16S rDNA abundances, en uppskattning av den totala bakteriesamhället som finns i ett prov, bestämdes med hjälp av en tidigare publiceraed qPCR protokoll 20, och värdena normaliserades med hjälp av mängden DNA som utvunnits från varje extraktionsmetod (baserat på fluorometrisk analys beskrivits tidigare 21. Av de tre extraktionsmetoder, Figur 1 visar att den mekaniska metoden konsekvent gett högsta totala bakteriella normaliserad gen överflöd uppskattningar för både avförings och strö prover (5,85 ± 0,16 och 5,56 ± 0,08 log 10 16S rDNA kopior ng -1 DNA extraherat, respektive), medan den enzymatiska metoden konsekvent gett de lägsta fekal och strö uppskattningar (4,83 ± 0,54 och 4,61 ± 0,13 log 10 16S rDNA kopior ng -1 DNA extraherat, respektive). Romanen hybrid extraktionsmetod gav normaliserade 16S rDNA abundances som befanns vara signifikant (p ≤ 0,05) högre än den enzymatiska metoden, men statistiskt liknar den mekaniska metod för både avförings och strö prover (5,50 ± 0,16 och5,23 ± 0,14 log 10 16S rDNA kopior ng -1 DNA extraherat, respektive). Därför är både de mekaniska och hybrid extraktionsmetoder gav en större kvalitativ uppskattning av den totala bakteriesamhällen inom dessa prover än den enzymatiska metoden.
För att kvalitetsbedömningen av den totala bakteriesamhällen från varje provtyp och utvinningsmetod, den microbiomic arbetsflöde som granskas i Navas-Molina et al. (2013) 22 användes. Kort sagt, V4-regionen av 16S rRNA-genen PCR-amplifierades med primrar innehållande MiSeq sekvense adaptrar och Golay streckkoder och sekvenserades på Illumina MiSeq plattformen 23,24. Raw sekvense uppgifter bearbetades sedan i QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 med standardparametrar. Sekvens databehandling ingår: kvalitet-filtrering; OTU klustring (open-referens vid tröskeln 97%) med hjälp UCLUST 27; OTU överflöd filtreringsnivån <0,005% 22, 31; taxonomi uppdrag med hjälp av RDP Klassificerare mot Greengenes 13_5 referensdatabasen 28; sekvensinpass med PyNAST 29 mot Greengenes kärnsats 28; fylogenetiskt träd konstruktion med hjälp FastTree 30. Den core_diversity_analyses.py manus användes för att köra alla alfa beta mångfaldsmått och generera alla tomter, diagram och statistik på en sekvense djup av 7865 sekvenser per prov.
Den valda DNA-extraktion metod uppvisade en tydlig påverkan på de återvunna fekal och strö microbiomes. Börjar på stammen-nivå (tabell 1), de övergripande data (som står för både fekal och strö prover) visade att metoderna som har den mycket störande homogenisering steg (mekanisk, hybrid) typiskt gav samhällen med högre bestånd av grampositiva phyla (98,0 och 97,49%, respektive) i förhållande till den enzymatiska metoden (81,74%). Omvänt, Gram-negativa phylarepresenterade en mycket större del av den totala bakterie samfundet återhämtat sig från den enzymatiska metoden (17.49%) jämfört med antingen de mekaniska (1,89%) eller hybrid (2,38%) metoder. Denna differential utvinning effekt på de övergripande microbiomic profilerna och prevalensen av grampositiva och gramnegativa organismer var effektivt visat på släktet nivå (Figur 2) .De mekaniska och hybridmetoder som produceras relativt likartade microbiomic profiler, medan den enzymatiska metoden microbiome visade en annan fördelning av den relativa abundansen av det återvunna taxa. Till exempel, gramnegativa Alistipes spp.in avföring prover (det röda blocket med A, 7,71% av det totala samhället) extraherats med enzymatiska metoden kraftigt nedsatt i fingeravtryck för de andra två extraktionsmetoder (röda pilar; 0,47 -0,81%), men den Grampositiva Lactobacillus spp. (Stor lila blocket med L) var mycket vanligare reduceras vid användning av enzymatic metod (42,71%) jämfört med de mekaniska eller hybridmetoder (57,22% och 61,85%, respektive). Ändå, medan relativa förekomsten av taxa uppvisade vissa skillnader mellan de tre extraktionsmetoder, det totala antalet taxa upptäckte var liknande för alla tre metoder för både fekal (92 av 112 taxa) och strö (96 av 112 taxa).
Den enzymatiska metoden konsekvent gav bakteriesamhällen med största rikedom, mångfald och jämnhet (med hjälp av chao1, Phylogenetic Mångfald och equitability mätetal, respektive) för både avförings och strö prover, med den mekaniska metoden konsekvent visar de lägsta uppskattningarna för dessa ekologiska parametrar (tabell 2). Hybrid metoden konsekvent visat ekologiska mått mellanhand för att de två andra metoder. Statistiskt de ekologiska skattningar från alla prover, oavsett extraktionsmetod, befanns vara desamma, även enzymatisk metodledde till en betydligt rikare (p = 0,045) microbiome jämfört med den mekaniska metoden vid analys av kullen proverna. Även om inga andra signifikanta skillnader hittades mellan utvinningsmetoder, var de största skillnaderna mellan de ekologiska parametrarna normalt återfinns mellan den enzymatiska och mekaniska metoder, med hybridmetod som utför lika väl till de två andra metoder; liknar den kvantitativa bedömningen av dessa metoder för extraktion (fig 1).
Figur 1. Kvalitativ bakteriell gemenskap jämförelse baserad på DNA-extraktionsmetoder. Kolumner representerar medelvärdet log 10 -transformmed 16S rRNA genkopior bestämt med qPCR normaliserade mot mängden DNA återhämtat sig från fekal (fyllda staplar) eller strö (streckade staplar) prov ( baserat på fluorometrisk bestämning). The DNA-extraktion metod som används för att erhålla dessa värden anges på x-axeln. Felstaplarna representerar standardavvikelsen mellan 4 replikatprover. För varje provtyp (Avföring eller Kull), bokstäverna ovanför kolumnerna representerar betydligt olika medel baserat på envägs ANOVA-analys med hjälp av Tukey multipla jämförelsetest (p = 0,05).
Microbiomic jämförelse Figur 2. Genus-nivå av de DNA-extraktionsmetoder. Varje kolumn representerar den genomsnittliga totala bakteriesamhället (baserat på 16S rRNA genen Illumina MiSeq uppgifter) av återvunna taxa för varje extraktionsmetod för avföring (första tre kolumner) och strö ( senaste tre kolumner) prover. Varje kolonn representerar medelvärdet av fyra olika prover från olika områden inom broiler huset. Bokstaven vid basen av kolumnerna indikerar extråtgärdsmetod (M = Mekanik, E = enzymatisk, H = Hybrid). De olika färgerna i varje kolumn representerar den relativa förekomsten av ett släkte inom det totala samhället, och färg för varje släkten är densamma för alla kolumner.
Microbiomic jämförelse Tabell 1. Stam-nivå av DNA extraktionsmetoder. Relativa förekomsten (% totalt återvinnas sekvenser) för varje DNA extraktionsmetod av 2 grampositiva (Actinomycetes och Firmicutes) och 3 gramnegativa (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) phyla återhämtat sig från den microbiomic analysen från båda prover typerna.
Tabell 2. Parvisa jämförelser av r ichness, Mångfald och jämnhet uppskattningar för de tre DNA extraktionsmetoder baserade på genus-nivå microbiomic bakteriell gemenskap analyser använder QIIME. För båda provtyper, parvisa jämförelser utfördes för de tre möjliga extraktionsmetod kombinationer. De totala bakteriella gemenskap parametrar bedömts omfattar rikedom (α-mångfald baserad på chao1 statistik), mångfald (β-mångfald baserad på Phylogenetic mångfald statistik), och jämnhet (baserat på som kan följa statistik). Värden representerar medelvärdet (standardavvikelse) på fyra distinkta området prover inom broiler huset, och en α = 0,05 nivån användes för att bestämma signifikans mellan parvisa jämförelser. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den DNA-extraktion metod verk de kvantitativa och kvalitativa totala bakteriesamhälls uppskattningar för både avförings och strö prover, stödja provanalyser beroende karaktären av DNA extraktionsmetoder sett tidigare 1,3,6. För både avförings och strö prover, ordningen på utförandet av DNA extraktionsmetoder var annorlunda för kvantitativ (Mekanisk> Hybrid> Enzymatisk) och kvalitativa (Enzymatisk> Hybrid> Mekaniska) totala bakteriesamhälls uppskattningar. Medan hybridmetoden inte gav de högsta kvantitativa eller kvalitativa bedömningar, i båda fallen hybridmetoden gav resultat som var statistiskt lik den högsta utför extraktionsmetod (Figur 1, Tabell 2), varigenom den bästa kombinationen av kvalitativ och kvantitativ total bakteriella gemenskap uppskattningar av de tre extraktionsmetoder testade. Det bör ne noteras att bakteriesamhället profiles kan starkt påverkas av DNA-extraktion metod, vilket kan ses i resultaten från denna studie (figur 2, tabell 1) och andra tidigare studier med miljöprover 4,5,8,9,11,12 och dessa differentiella effekter kan starkt påverka analys och tolkning av studieuppgifter. Att veta detta, måste forskarna starkt överväga lämplig extraktionsmetod för sina provtyper och experimentella mål på en studie-för-studien basis.
Ett viktigt steg för att effektiviteten i romanen hybridmetod är den kraftfulla homogenisering steget till stor hjälp i att inte bara frisättningen av bakterieceller från de komplexa fekal / jord matriser, men också för att bryta ner de tuffare cellväggarna hos grampositiva samhällsmedlemmar . De högre kvantitativa uppskattningar (figur 1) och den högre andelen grampositiva Aktinobakterier och Firmicutes inom microbiomes för både extraktionsmetoder som används här homogeniseringssteg (
Denna metod, som beskrivs, innehåller några särskilda krav på vilka användare kommer att behöva vara medveten. Först är användningen av en kraftfull homogenisator samt några komponenter i ett kommersiellt tillgängligt extraktion kit. Tidigare studier har visat att andra mekaniska pärla-beating steg eller motorstarka homogenisatorer förbättrar DNA-extraktion effektiviteten och ge 4,5,9; Därför, kan en annan typ av mekanisk homogeniseringssteg integreras i hybrid extraktionsmetoden (även kan krävas användning av annan specialutrustning). Hybrid metod som beskrivs här också använder pärla ledande rör som är särskilt utformade för homogeniseringsanordningen och specifikt för miljöprover på grund av framgången med detta lyse matris i tidigare samhällsbaserade studier från fjäderfäprover 15, 31-33. Slutligen krävs den "gyllene standarden" enzymatisk DNA-extraktionsmetod (QIAamp DNA Pall Mini Kit) för enzymatisk rening av prov-DNA i hybrid-protokollet, eftersom det har visat sig vara den mest effektiva enzymatiska extraktionsmetod vid användning fekalprover 3,18,19. Medan krävs inte användningen av robotarbetsstationen (instruktioner med satsen kan utföras för hand), ökar användningen av robot arbetsstation kraftigt genomströmning, minimerar bearbetning fel, och resulterar i högre kvalitet DNA för längre nedströms analys 7. Automatisering av denna typ, är för närvarande inte tillgänglig med befintliga mekaniska kit, som representerar en annan fördel med hybridmetoden.
För närvarande är den robotarbetsstationen beskrivs i detta protokoll begränsad till bearbetning maximalt 12 prover i 72 min, men preliminärt arbete har visat att denna metod fungerar lika bra i den högre genomströmning workstatipå som kan bearbeta 96 prover inom 40 min (data visas ej). Ytterligare testning av denna mycket högre genomströmning alternativet kommer att betydligt öka effektiviteten av hybridmetod eftersom fler prover kunde behandlas på ett halvautomatiskt sätt inom en typisk dag. Också, preliminära data med hjälp av denna nya DNA-extraktion metod har visat att det är effektivt för andra fjäderfärelaterade prover (t.ex. hud / fjäder sköljningar, slaktsköljningar, cekala innehåll homogen) samt andra typer av miljöprover (t.ex. jordbruksmark , svin avföring, häst avföring, get avföring, avföring nötkreatur). Därför kommer framtida studier behöva bestämma effekten av denna hybrid metod för utvinning av DNA från många jordbruks- och miljöprover. Ytterligare validering av denna metod genom framtida studier skulle potentiellt möjliggöra en mer omfattande användning av denna metod för bedömningen av den totala bakteriesamhällen från en mängd olika inställningar jordbruks- och miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
- McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
- Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
- Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
- Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
- Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
- Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
- Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
- Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
- Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
- Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
- Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
- Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
- Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
- Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
- Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
- Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
- Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
