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Biology

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

doi: 10.3791/52161 Published: December 10, 2014

Abstract

Die Wirksamkeit von DNA-Extraktionsprotokollen kann stark abhängig sowohl von der Art der Probe untersucht, und die Arten von Downstream-Analysen durchgeführt werden. In Anbetracht, dass der Einsatz neuer Bakteriengemeinschaft Analysetechniken (zB microbiomics, Metagenomik) wird immer häufiger in den Agrar- und Umweltwissenschaften, und viele Umweltproben in diesen Disziplinen können physikalisch-chemisch und mikrobiologisch einzigartige (zB Fäkalien und Abfall / Bettwäsche Proben aus sein die Geflügelproduktion Spektrum), müssen geeignete und wirksame DNA-Extraktionsmethoden sorgfältig ausgewählt werden. Daher wurde eine neue halbautomatische Hybrid-DNA-Extraktionsverfahren, die speziell für die Verwendung mit Umweltgeflügelproduktion Proben entwickelt. Diese Methode ist eine Kombination der beiden wichtigsten Arten von DNA-Extraktion: mechanische und enzymatische. Ein zweistufiges intensiven mechanischen Homogenisierungsschritt (mit Wulst schlag speziell für environmen formuliertental Proben) wurde Anfang der "Goldstandard" enzymatische DNA-Extraktions-Verfahren hinzugefügt für Stuhlproben, um die Entfernung von Bakterien und DNA aus der Probenmatrix und zur Verbesserung der Rückgewinnung von Gram-positiven bakteriellen Mitgliedern der Gemeinschaft. Sobald die enzymatische Extraktion Abschnitt des Hybridverfahren eingeleitet wurde, wurde die restliche Reinigungsverfahren unter Verwendung eines Roboter-Arbeitsstation, um den Probendurchsatz zu erhöhen und Probenbearbeitungsfehler automatisiert. Im Vergleich zu den strengen mechanischen und enzymatischen DNA-Extraktionsmethoden, dieses neue Hybridverfahren vorgesehen die beste Gesamtleistung in Kombination, wenn man quantitativ (mit 16S-rRNA-qPCR) und qualitativen (mit microbiomics) Schätzungen der Gesamtbakteriengemeinschaften bei der Verarbeitung von Geflügel Kot und Einstreu Proben .

Protocol

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1. Mechanische Homogenisierung von Umweltzucht Proben

  1. Vor der Extraktion, setzen Sie ein Wasserbad auf 95 ° C und das Wasser Badezeit, um diese Temperatur zu erreichen.
  2. Abwiegen 0,33 g Boden oder Fäkalien in eine 2 ml Lysismatrix E Rohr.
    1. Sie 0,33 g der Probe in der Röhre nicht überschreiten, da dies die folgenden Lösungen führen, um die Kapazität des Rohres übertrifft.
    2. Eingefrorene Proben auf Raumtemperatur vor dem Wiegen.
    3. Um insgesamt 1 g Boden / Kot zu analysieren, aus 3 wiegen replizieren 0,33 g Proben für jedes einzelne Umweltprobe.
    4. Proben bei -20 ° C innerhalb der konischen Matrixröhren vor der Extraktion, wenn nötig.
  3. Fügen Sie 825 ul Natriumphosphat-Puffer und 275 ul des PLS-Lösung zu einem Probenröhrchen. Mischen auf dem Vortex ~ 15 Sekunden und dann Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 xg für 5 min.
  4. Dekantiert man die supernatant und fügen Sie 700 ul Puffer ASL. Mischen mit einem Vortex für 5 Sekunden.
    1. Sorgen Sie für eine Headspace (~ 10% Volumen) im konischen Rohr an dieser Stelle. Wenn kein Kopfraum, werden die Rohre eine Tendenz, bei der nächsten Stufe der Homogenisierung, die um eine Kreuzkontamination und / oder Probenverlust führen könnte auslaufen müssen.
  5. Die Proben werden in einen FastPrep 24 Instrument und Homogenisierung der Proben mit einer Geschwindigkeit von 6,0 m / s für 40 sec.
  6. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Probe bei 14.000 xg für 5 min. Den Überstand in ein steriles 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. Um die DNA-Gewinnung aus der Probe zu maximieren, wiederholen Sie die Schritte 1.4 bis 1.6, die Kombination der Überstände in den gleichen sterilen 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

2. Die enzymatische Hemmung der Inhibitoren von Proben Homogenate

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die QIAamp DNA Stool Mini Kit.

  1. Inkubieren Sie dieÜberstand in einem 95 ° C Wasserbad für 5 min zur DNA-Gewinnung aus verbleibenden Zellen in dem Überstand zu maximieren.
    1. Inkubiere bei 70 ° C für Proben, die hauptsächlich aus Gram-negative Organismen. Jedoch, wenn Gram-positive Organismen vorhanden ist (was der Fall mit Geflügel Kotproben ist) sind, Inkubation bei 95 ° C.
    2. Verwenden Sie Kunststoff-Befestigungsklammern auf den Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass die Rohre nicht "Pop" offen und möglicherweise verlieren Probenvolumen als Druck kann in diesen verschlossenen Reaktionsgefäße zu bauen.
  2. Öffnen Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen, um die Druck, re-cap die Reaktionsgefäße zu lösen und mischen mit einem Vortex für 15 Sekunden.
  3. Zentrifugieren Sie die Probe bei 14.000 · g für 1 min, entfernen Sie 1,2 ml des Überstandes und legen Sie sie in eine neue sterile 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. 1 Inhibitex Registerkarte zu jeder Probe und mischen mit einem Vortex, bis die Probe wird eine gleichmäßig weiße / Aus-weiße Flüssigkeit.
    1. Vermeiden touching die Registerkarte Inhibitex während des Einsetzens in das Reaktionsgefäß mit der Probe. Um dies zu erreichen, setzen Sie die Blisterpackung auf die Registerkarte, die direkt über dem offenen Mikrozentrifugenröhrchen und drücken Sie auf die Registerkarte vorsichtig aus dem Blister und in das Reaktionsgefäß.
  5. Inkubieren der Probe für 1 min bei RT (ca. 25 ° C) und Zentrifugation bei 14.000 × g für 5 min.
  6. Übertragen Sie die gesamte Flüssigkeit in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 14.000 xg für 5 min.
    1. Vermeiden jegliche verbleibenden Partikel, die am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens am Ende von Schritt 2.5 beim Übertragen der Flüssigkeit sedimentiert haben kann.

3. Automatisierte DNA-Reinigung mit dem QIAcube Robotic Workstation

HINWEIS: Die Anzahl von Kunststoffzusätze, die Anordnung der Probenrotor Adapter innerhalb der Zentrifuge, und die erforderlichen Mengen der Puffer / Lösungen abhängig numzahl der Proben, die ausgeführt wird sind.

  1. Fügen Elutionsgefässe und Filterrohre in die entsprechenden Steckplätze innerhalb der Rotoradaptern. Für jede Probe wird mit 400 & mgr; l zu dem mittleren Schlitz der Rotorteil. Zeigen die Rotoradaptern in der Workstation Zentrifuge in der richtigen Anordnung gemäß der Anzahl von Proben gereinigt wird.
    1. Stellen Sie sicher, dass alle der Mikrogefäßdeckel ordnungsgemäß innerhalb der Rotorteil gesichert, da ein Ausfall kann es zu in Scheren während einer der Zentrifugationsschritte des Reinigungsprotokoll führen.
  2. Fügen Sie die erforderliche Anzahl von 1.000 & mgr; l und 200 & mgr; Filter-Spitzen auf der Arbeitsstation, und füllen Sie die mitgelieferten Pufferflaschen mit dem erforderlichen Volumen von Puffer.
    HINWEIS: Die für dieses Reinigungsprotokoll (AL, AW1, AW2 und AE) benötigten Puffer sind alle innerhalb des QIAamp DNA Stool Mini Kit enthalten. Der Benutzer braucht, um die 100% Ethanol, die für die AW bu benötigt wird liefernob bietet und als Lösung in dem Reinigungsverfahren verwendet wird.
  3. Fügen Sie das erforderliche Volumen der zugeführten Proteinase K-Lösung in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie in Schlitz A auf der Arbeitsstation. Außerdem fügen die erforderliche Anzahl (gleich der Anzahl von Proben gereinigt wird) mit dem Rüttler Abschnitt der Arbeitsstelle 2 ml Safe-Lock-Mikroprobenröhrchen RB.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Deckel der Probenröhrchen fest in die entsprechenden Schlitze auf der Arbeitsstation platziert, da ein Versagen zu tun, wird zu einem Fehler, wenn die Maschine zunächst scannt die Arbeitsstation, um sicherzustellen, dass alle benötigten Kunststoffe und Flüssigkeiten sind für den angeforderten verfügbar laufen.
  4. Verwendung des Touchscreens auf der Arbeitsstation, wählen Sie die DNA Stool - Human Hocker - Nachweis von Krankheitserregern auf Protokoll, und lesen Sie sich die folgenden Parameter, um sicherzustellen, dass die Arbeitsstation richtig eingelegt wurde. Sobald Sie alle Kontrollbildschirme übergeben, wählen Sie Start, um dieses Protokoll ausführen.
    1. Wenn Extrahieren von DNA aus mehr als 12 Proben, beginnen die Homogenisierung (Stufe 1) für den nächsten Satz von Proben, da ein Durchlauf von 12 Proben nimmt ~ 72 min auf der Workstation zu beenden.
  5. Entfernen Sie die Proben aus den Rotor-Adapter, diese abschließen, und statt bei -20 ° C bis zur anschließenden Downstream-Analysen benötigt.
    1. Zu diesem Zeitpunkt verbinden die 3 replicate Reinigungen für eine individuelle Probe (insgesamt analysierten Betrag = 1 g) unter Verwendung eines Zentrifugations / Verdampfungs-basierten System. Vereinige die Replikate und Wieder Eluats auf ein Endvolumen von 100 & mgr; l Tris-EDTA-Puffer.

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Representative Results

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Für diese Studie wurden frisch fäkal Kot und Einstreu Proben von einem kommerziellen Broilerstall (~ 25.000 Vögel) im Südosten der USA gewonnen. Die Masthühner (Gallus gallus) waren Cobb-500 durchquert, und sie waren 59 Tage alt zum Zeitpunkt der Probenahme. Frische Fäkalien und Abfall-Proben wurden von vier verschiedenen Bereiche innerhalb des Hauses gewonnen (in der Nähe von Kühlkissen, in der Nähe der waterer / Zubringerlinien, zwischen den waterer / Speiseleitungen und in der Nähe von Abluftventilatoren) und Proben aus jedem dieser Bereiche enthielt fünf gepoolten Proben aus diesem Bereich. Die Proben aus den vier Bereichen des Hauses wurden extrahiert und quantitativ / qualitativ getrennt nach Probentyp (fäkale oder Streu) analysiert. Die unten aufgeführten Daten stellen die Mittelwerte für das gesamte Haus für beide Umweltprobentypen.

Insgesamt 16S rDNA Häufigkeiten, eine Schätzung der Gesamtbakteriengemeinschaft in einer Probe enthalten ist, wurden mit einer zuvor veröffentlichen bestimmted qPCR-Protokoll 20, und die Werte wurden mit der Menge an DNA von jeder Extraktionsverfahren gewonnen normalisiert (basierend auf fluorometrische Analyse zuvor 21 beschrieben. Von den drei Extraktionsverfahren zeigt 1, dass das mechanische Verfahren die höchste Gesamtbakterien normalisierten Gen Fluss konsistent bereitgestellt Schätzungen sowohl für die Fäkalien und Abfall Proben (5,85 ± 0,16 und 5,56 ± 0,08 log 10 Kopien 16S rDNA ng -1 DNA extrahiert, respectively), während die enzymatische Methode durchweg die niedrigsten Fäkalien und Abfall Schätzungen (4,83 ± 0,54 und 4,61 ± bereitgestellt 0,13 log 10 16S rDNA Kopien ng -1 DNA extrahiert, beziehungsweise). Die neuen Hybridextraktionsmethode ergab normalisierten 16S rDNA Häufigkeiten, die gefunden wurden (p ≤ 0,05) höher als das enzymatische Verfahren, aber statistisch ähnlich zu dem mechanischen Verfahren zum signifikant sein sowohl die Fäkalien und Abfall Proben (5,50 ± 0,16 und5,23 ± 0,14 log 10 16S rDNA Kopien ng -1 DNA extrahiert, beziehungsweise). Daher vorgesehen sowohl die mechanischen und Hybrid- Extraktionsverfahren eine größere qualitative Schätzung der Gesamtbakteriengemeinschaften in diesen Proben als die enzymatische Methode.

Um qualitativ bewerten die Gesamtbakteriengemeinschaften aus jedem Probentyp und Extraktionsverfahren, die microbiomic Workflow wie in Navas-Molina et al. Überprüft (2013) 22 wurde verwendet. Kurz gesagt, die V4-Region des 16S-rRNA-Gens wurde mit PCR-Primern, enthaltend MiSeq Sequenzierung Adapter und Golay Barcodes verstärkt und auf dem Illumina MiSeq Plattform 23,24 sequenziert. Raw Sequenzierungsdaten wurde dann in QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 mit den Standardparametern verarbeitet. Sequenzdatenverarbeitung enthalten: Qualitäts-Filterung; OTU Clustering (open-Referenz bei 97% Schwelle) mit UCLUST 27; OTU Fülle Filterung von <0,005% 22, 31; Verwendung des RDP Classifier gegen den Greengenes 13_5 Referenzdatenbank 28 Taxonomie Zuordnung; Sequenzvergleich mit PyNAST 29 gegen die Greengenes Kernsatz 28; Stammbaum Konstruktion mit FastTree 30. Die core_diversity_analyses.py Skript wurde verwendet, um alle alpha beta Vielfalt Metriken ausführen und alle Grundstücke, Diagramme und Statistiken auf einen Sequenzierungstiefe 7865 Sequenzen pro Probe zu erzeugen.

Die gewählte DNA-Extraktionsverfahren zeigte einen deutlichen Einfluss auf den wiederhergestellten fäkale und Wurf microbiomes. Ausgehend von der Stamm-Ebene (Tabelle 1), die Gesamtdaten (auf die beiden Stuhlproben und Einstreu) ergab, dass Methoden, die über die sehr störend Homogenisierungsschritt (mechanisch, Hybrid) in der Regel ergab Gemeinden mit höheren Häufigkeiten von Gram-positive Stämme (98,0 und 97,49%, jeweils) bezogen auf das enzymatische Verfahren (81,74%). Umgekehrt, Gram-negative Stämmerepräsentiert einen viel größeren Teil der Gesamtbakteriengemeinschaften aus der enzymatischen Methode (17,49%) im Vergleich zu entweder der mechanischen (1,89%) oder hybrid (2,38%) Verfahren gewonnen. Dieser Differenzextraktionswirkung auf die Gesamt microbiomic Profile und die Prävalenz von grampositiven und gramnegativen Organismen wurde effektiv an der Gattungsebene demonstriert (Abbildung 2) .Die produziert relativ ähnlich microbiomic Profile, während die enzymatische Methode microbiome zeigte mechanische und Hybridverfahren eine andere Verteilung der relativen Häufigkeit der gewonnenen Taxa. Zum Beispiel, Gram-negative Alistipes spp.in den Stuhlproben (die rote Block mit dem A, 7,71% der gesamten Gemeinschaft) extrahiert mit der enzymatischen Methode ist stark in den Fingerabdrücken für die beiden anderen Extraktionsmethoden reduziert (rote Pfeile; 0,47 -0.81%), aber die Gram-positive Lactobacillus spp. (Große lila Block mit dem L) viel häufiger reduziert war, wenn Sie die enzymatic Methode (42,71%) im Vergleich zu den mechanischen oder Hybridverfahren (57,22% und 61,85%, jeweils). Dennoch, während die relativen Häufigkeiten der Taxa wiesen einige Unterschiede zwischen den drei Extraktionsmethoden, die Gesamtzahl der Taxa entdeckt waren ähnlich für alle drei Methoden sowohl für die fäkal (92 von 112 Taxa) und Abfall (96 von 112 Taxa).

Die enzymatische Methode konsequent Bakteriengemeinschaften mit dem größten Reichtum, Vielfalt und Ebenheit (mit dem CHAO1, phylogenetische Vielfalt und Gerechtigkeit Metriken, beziehungsweise) sowohl für die Fäkalien und Abfall Proben, mit dem mechanischen Verfahren konsequent, die die niedrigsten Schätzungen für diese ökologische ergab Parametern (Tabelle 2). Die Hybrid-Verfahren konsequent auf die beiden anderen Methoden demonstriert ökologischen Kennzahlen Vermittler. Statistisch die ökologischen Schätzungen von allen Proben, unabhängig von Extraktionsverfahren gefunden ähnlich sein, obwohl enzymatische Methodehat zu einer deutlich reicher (p = 0,045) microbiome gegenüber dem mechanischen Verfahren bei der Analyse der Wurf Proben führen. Obwohl keine anderen signifikanten Unterschiede zwischen Extraktionsverfahren gefunden wurden die größten Unterschiede zwischen ökologische Parameter typischerweise zwischen dem enzymatischen und mechanischen Verfahren gefunden, mit dem Hybridverfahren-Durch ebenso gut auf die beiden anderen Methoden; ähnlich wie die quantitative Beurteilung dieser Extraktionsverfahren (Abbildung 1).

Figur 1
Abbildung 1. Qualitative Bakteriengemeinschaft Vergleich auf Basis von DNA-Extraktionsverfahren. Die Säulen stellen die mittlere log 10 -transformmed 16S-rRNA-Gen-Kopien wie qPCR bestimmt normalisiert gegen die Menge an DNA gewonnen aus fäkalen (ausgefüllte Balken) oder Wurf (gestrichelte Balken) Probe ( basierend auf fluorometrische Bestimmung). The verwendet, um diese Werte zu erhalten DNA-Extraktionsverfahren ist auf der x-Achse angegeben. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung zwischen 4 Parallelproben. Für jeden Probentyp (Stuhl oder Wurf), die Briefe über den Säulen stellen deutlich andere Mittel auf Basis von Einweg-ANOVA-Analyse unter Verwendung des Tukey-Mehrfachvergleichstest (p = 0,05).

Abbildung 2
Abbildung 2. Gattung Ebene microbiomic Vergleich der DNA-Extraktionsmethoden. Jede Säule stellt den durchschnittlichen Gesamtbakteriengemeinschaft (basierend auf 16S-rRNA-Gen Illumina MiSeq Daten) wieder Taxa für jede Extraktionsmethode für den Kot (ersten drei Spalten) und Abfall ( letzten drei Spalten) Proben. Jede Säule stellt den Mittelwert von vier verschiedenen Proben aus unterschiedlichen Bereichen innerhalb der Broilerhaus. Der Buchstabe an der Basis der Spalten zeigt die extrAktionsmethode (M = Mechanische, E = enzymatische, H = Hybrid). Die unterschiedlichen Farben in jeder Spalte stellen die relative Häufigkeit einer Gattung innerhalb der gesamten Gemeinschaft und Farbe für jeden Gattungen ist das gleiche für alle Spalten.

Tabelle 1
Tabelle 1 Stamm-Ebene microbiomic Abgleich von DNA-Extraktionsverfahren. Relativen Häufigkeiten (% insgesamt erholt Sequenzen) für jede DNA-Extraktionsverfahren des 2 Gram-positive (Actinomyceten und Firmicutes) und 3 Gram-negative (Bacteriodetes, Proteobakterien, Tenericutes) Stämme vom microbiomic Analyse von beiden Proben Arten erholt.

Tabelle 2
Tabelle 2. Paarweise Vergleiche der r ichness, Vielfalt und Gleichmäßigkeit Schätzungen für die drei DNA-Extraktionsmethoden, die auf Gattungsebene microbiomic Bakteriengemeinschaft Analysen mit QIIME. Für beide Probenarten, paarweisen Vergleiche wurden für die drei möglichen Kombinationen Extraktionsverfahren durchgeführt. Die Gesamtbakteriengemeinschaft Parameter bewertet sind Reichtum (α-Vielfalt auf der Grundlage der CHAO1 Statistik), Vielfalt (β-Vielfalt auf der Grundlage der phylogenetischen Vielfalt Statistik) und Ebenheit (auf Basis des Gerechtigkeit Statistik). Die Werte stellen den Mittelwert (Standardabweichung) von 4 verschiedenen Bereich Proben im Broilerstall und ein α = 0,05 Niveau wurde verwendet, um Signifikanz zwischen paarweisen Vergleiche zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Discussion

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Die verwendeten DNA-Extraktionsverfahren erfolgen die quantitativen und qualitativen Gesamtkeim Schätzungen Gemeinschaft sowohl für die fäkale und Wurf-Proben, die Unterstützung der Probenanalysen Abhängigkeit der DNA-Extraktionsverfahren zuvor 1,3,6 gesehen. Sowohl für die fäkale und Wurf Proben war die Reihenfolge der Durchführung der DNA-Extraktionsmethoden verschiedene für die quantitative (Mechanisch> Trekking> enzymatische) und qualitativen (enzymatische> Trekking> Mechanische) Gesamtkeim Schätzungen Gemeinschaft. Während das Hybridverfahren nicht die höchsten quantitative oder qualitative Abschätzungen zu erzeugen, in beiden Fällen ist die Hybrid-Verfahren hergestellt Ergebnisse statistisch ähnlich zu der höchsten Leistung Extraktionsverfahren (Figur 1, Tabelle 2) wurden, um dadurch die beste Kombination von qualitativen und quantitativen Gesamt Bakteriengemeinschaft Schätzungen der drei Extraktionsmethoden getestet. Es sei darauf hingewiesen, dass bakterielle Gemeinschaft profil nees können stark von DNA-Extraktions-Verfahren durchgeführt werden, wie in den Ergebnissen aus dieser Studie (Abbildung 2, Tabelle 1) und anderen früheren Studien mit Umweltproben 4,5,8,9,11,12 gesehen, und diese unterschiedlichen Wirkungen können stark Einfluss auf die Analyse und Interpretation der Studiendaten. Wenn man das weiß, müssen die Forscher in Erwägung ziehen, die entsprechende Extraktionsverfahren für die Probentypen und experimentelle Ziele auf eine Studie-by-Studie Basis.

Ein wichtiger Schritt, um die Wirksamkeit des neuartigen Hybridverfahren ist die leistungsstarke Homogenisierungsschritt zu stark, nicht nur aus den komplexen fäkalen / Erdreich Matrizen unterstützen die Freigabe von Bakterienzellen, sondern auch die härtere Zellwänden von Gram-positive Community-Mitglieder brechen . Die höheren quantitative Schätzungen (Abbildung 1) und der höhere Anteil an Gram-positiven und Actinobacteria Firmicutes innerhalb der microbiomes beiden Extraktionsverfahren, das diesen Homogenisierungsschritt verwendet ( 1,2,4-6,9. Sobald die Zellen und / oder DNA sind distanzierte / von diesen Matrizen veröffentlicht, die Verwendung der "Goldstandard" enzymatische Methode in der hybriden Methode effizient reinigt die DNA aus diesen Proben. Die Aufnahme der Inhibitor-Bindungsschritt der enzymatischen Methode innerhalb des Hybridextraktionsprotokoll erlaubt eine effiziente Entfernung der in den komplexen Umweltproben in dieser Studie verwendet vorliegenden Inhibitoren. Dieser Schritt, der fehlt in der mechanischen Extraktionsprotokoll ist. Daher ist die Hybrid-Extraktionsverfahren, mit dem Zusatz eines mechanischen Homogenisierungsschritt in Verbindung mit der enzymatischen purificatIonen von dem freigesetzten DNA, ist eine effektive Methode für die Beurteilung der Gesamtbakteriengemeinschaften aus Umweltgeflügelproduktion Proben.

Dieses Verfahren, wie beschrieben, enthält einige spezifische Anforderungen, welche Benutzer benötigen, um sich bewusst sein. Erstens ist die Verwendung eines Hochleistungs-Homogenisator als auch einige Komponenten eines handelsüblichen Extraktionskit. Frühere Studien zeigten, dass andere mechanische perlen Schlagen Schritte oder High-Power-Homogenisatoren Verbesserung der DNA-Extraktion Effizienz und Ausbeute 4,5,9; Daher könnte eine andere Art von mechanischen Homogenisierungsschritt in das Hybrid-Extraktions-Verfahren integriert werden (obwohl die Verwendung von verschiedenen Spezialgeräte erforderlich). Die hier beschriebene Hybridverfahren verwendet die perlen schlagen Rohre, die speziell für den Homogenisator ausgelegt sind und speziell für Umweltproben durch den Erfolg dieser Lysismatrix in früheren Community-basierte Studien aus Geflügelproben 15, 31-33. Schließlich wird der "Goldstandard" der enzymatischen DNA-Extraktionsverfahrens (QIAamp DNA Mini Kit Hocker) für die enzymatische Reinigung der Proben-DNA im Hybrid-Protokoll erforderlich, da es sich gezeigt hat, um die effektivste enzymatischen Extraktionsverfahren bei der Verwendung von Fäkalproben 3,18,19. Während die Verwendung des Roboter-Arbeitsstation ist nicht erforderlich (Anweisungen des Kits kann von Hand durchgeführt werden), die Verwendung des Roboter-Arbeitsstation wesentlich erhöht den Durchsatz, Verarbeitungsfehler minimiert, und führt zu einer höheren Qualität DNA für Downstream-Analyse 7. Automatisierung dieser Art, mit den vorhandenen mechanischen Kits ist derzeit nicht verfügbar, was einen weiteren Vorteil des Hybrid-Methode darstellt.

Derzeit ist das in diesem Protokoll beschrieben Roboter-Arbeitsstation, um die Verarbeitung eines maximal 12 Proben in 72 min beschränkt, sondern Vorarbeiten haben gezeigt, daß dieses Verfahren gleichermaßen gut in der höheren Durchsatz WorkstatiOn, das 96 Proben innerhalb von 40 min zu verarbeiten (Daten nicht gezeigt). Weitere Tests dieser viel höheren Durchsatz Option wird die Wirksamkeit des Hybridverfahren erheblich verbessern, da mehr Proben können zu einer halbautomatischen Weise in einem typischen Tag verarbeitet werden. Auch vorläufige Daten mit dieser neuen DNA-Extraktions-Verfahren hat gezeigt, dass es wirksam für andere Geflügelbezogenen Proben (zB Haut / Feder Spülungen Karkasse Spülungen, Blinddarminhalt Homogenate) sowie andere Arten von Umweltproben (zB landwirtschaftliche Böden , Schwein Kot, Kot Pferd, Ziege Kot, Rinder Kot). Daher werden zukünftige Studien müssen die Wirksamkeit dieser hybriden Verfahren zur Extraktion von DNA aus vielen landwirtschaftlichen und Umweltproben zu bestimmen. Eine weitere Validierung der Methode durch zukünftige Studien wäre potenziell ermöglichen eine breitere Anwendung dieser Methode für die Bewertung der Gesamtbakteriengemeinschaften aus einer Vielzahl von landwirtschaftlichen und ökologischen Einstellungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix E tube MPBio 6914-050 Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate Solution MPBio 6570-205 Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS Buffer MPBio 6570-201
Buffer ASL (560 ml) Qiagen 19082
FastPrep 24 homogenizer MPBio 116004500 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen 51504
QIAcube24 (110V) Qiagen 9001292 Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024) Qiagen 990352
Filter-Tips, 200 ml (1024) Qiagen 990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) Qiagen 990394 For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml) Qiagen 990381 Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

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References

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Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben
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Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).More

Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).

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