Abstract
Effekten av DNA-ekstraksjon protokoller kan være svært avhengig av både type prøve som undersøkes og hvilke typer nedstrømsgjennomførte analyser. Tatt i betraktning at bruk av nye bakteriesamfunnet analyseteknikker (f.eks microbiomics, metagenomikk) blir stadig mer utbredt i landbruket og miljøfag og mange miljøprøver innenfor disse fagområdene kan være physiochemically og mikrobiologisk unik (f.eks avføring og søppel / sengetøy prøver fra fjærfe produksjon spektrum), hensiktsmessige og effektive DNA utvinning metoder må nøye utvalgt. Derfor ble en ny semi-automatisert hybrid DNA-ekstraksjon metode utviklet spesielt for bruk med miljøfjørfeproduksjonsprøver. Denne metoden er en kombinasjon av de to hovedtyper av DNA-ekstraksjon: mekanisk og enzymatisk. En to-trinns intens mekanisk homogenisering trinn (ved hjelp av perle-juling spesielt formulert for miljøvenntal prøver) ble tilsatt til begynnelsen av "gullstandard" enzymatisk DNA-ekstraksjon fremgangsmåte for fekale prøver for å forbedre fjerning av bakterier og DNA fra prøvemassen og forbedre utvinningen av Gram-positive bakterielle fellesskapsmedlemmer. Når den enzymatiske ekstraksjon del av hybrid-metoden ble igangsatt, ble det gjenværende renseprosessen automatisk ved hjelp av en robot arbeidsstasjon for å øke prøvekapasitet og senke prøvebehandlingsfeil. I forhold til de strenge mekaniske og enzymatiske DNA utvinning metoder, denne romanen hybrid metode gitt den beste samlede kombinerte ytelsen når de vurderer kvantitativ (ved hjelp av 16S rRNA qPCR) og kvalitative (ved hjelp microbiomics) anslag over de totale bakteriesamfunn ved behandling av fjørfe avføring og søppel prøver .
Protocol
1. Mekanisk Homogenisering av Miljø Fjærkre Produksjons Samples
- Før ekstraksjon, sett et vannbad til 95 ° C og lar vannbad tid for å nå denne temperatur.
- Vei opp 0,33 g av jord eller avføring inn i en 2 ml lyserings Matrix E røret.
- Må ikke overstige 0,33 g av prøven i røret, da dette vil føre til følgende løsninger for å overstige kapasiteten av røret.
- Tine frosne prøvene til RT før veiing.
- For å analysere et totalt 1 g av jord / feces, veie ut tre replikere 0,33 g prøver for hvert enkelt miljøprøve.
- Oppbevar prøver ved -20 ° C i løpet av de koniske matrise rør før ekstraksjon, om nødvendig.
- Legg 825 pl natriumfosfatbuffer, og 275 ul av PLS-løsning til et prøverør. Bland ved hjelp av en vortex for ~ 15 sek og deretter sentrifugere prøvene ved 14 000 xg i 5 min.
- Dekanter supernatant og legge 700 mL buffer ASL. Bland ved hjelp av en vortex i 5 sek.
- Sørg for at det er headspace (~ 10% totalt volum) tilgjengelig i konisk rør på dette punktet. Hvis det ikke er noe topprommet, vil rørene ha en tendens til å lekke i løpet av det neste trinnet homogenisering som kan føre til kryss-kontaminering og / eller prøve tap.
- Plassere prøvene i et FastPrep 24 instrument, og homogenisere prøven i en hastighet på 6,0 m / sek til 40 sek.
- Sentrifuger homogenisert prøve ved 14.000 xg i 5 min. Overfør supernatanten til et sterilt 2 ml mikrosentrifugerør.
- Å maksimere DNA utvinning fra prøven, gjenta trinn 01.04 til 01.06, og kombinerer supernatantene inn i samme sterile, 2 ml mikro tube.
2. Enzymatisk Hemming av hemmere fra Sample Homogenater
MERK: Denne protokollen bruker QIAamp DNA Krakk Mini Kit.
- InkuberSupernatanten i et 95 ° C vannbad i 5 min for å maksimere DNA-utvinning fra eventuelle gjenværende celler i supernatanten.
- Inkuber ved 70 ° C for prøvene inneholdende det meste Gram-negative organismer. Men hvis Gram-positive organismer er tilstede (som er tilfellet med fjærfe fekale prøver), inkuberes ved 95 ° C.
- Bruke plast låseklips på mikrosentrifugerør å sikre at rørene ikke vil "pop" åpen og potensielt miste prøvevolum som trykket kan bygge opp i disse lukkede mikrosentrifugerør.
- Åpne hver mikrosentrifugerør å slippe ut trykket, re-cap de mikrosentrifugerør og bland ved hjelp av en vortex i 15 sek.
- Sentrifugere prøven ved 14 000 xg i 1 min, fjerne 1,2 ml av supernatanten og plassere den i en ny steril 2 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 1 InhibitEx fanen til hver prøve, og bland ved hjelp av en virvel før prøven blir en ensartet hvit / off-white væske.
- Unngå touching kategorien InhibitEx mens plassere det inn i mikro røret som inneholder prøven. For å oppnå dette, plasserer blisterpakning som inneholder kategorien direkte over åpen mikrosentrifugerør og skyver du forsiktig ut av blisterpakningen og inn i mikrosentrifugerør.
- Inkuber prøven i 1 min ved romtemperatur (~ 25 ° C) og sentrifuger ved 14 000 xg i 5 min.
- Overfør all væske til et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 14 000 xg i 5 min.
- Unngå eventuelle gjenværende partikler som kan ha pelletert ved bunnen av mikrosentrifugerør ved slutten av trinn 2.5 ved å overføre væsken.
3. Automatisert DNA Purification Bruke Qiacube Robotic Workstation
MERK: Antallet plast forbruksvarer, ordningen av utvalgets rotor adaptere i sentrifugen, og de nødvendige volumer av buffere / løsninger er avhengig av numBER prøver som blir kjørt.
- Legg elusjonstester rør og filterrørene til de aktuelle sporene innenfor rotor adaptere. For hver prøve, tilsett 400 ul til det midtre sporet i rotoren adapter. Plasser rotor adaptere i arbeidsstasjonen sentrifuge i riktig innretning i henhold til antall prøver som blir renset.
- Sørg for at alle de mikro tube lokk er korrekt sikret i rotoren adapter siden en unnlatelse av å gjøre dette kan resultere i klipping under en av sentrifugeringstrinn av renseprotokoll.
- Legg det nødvendige antall 1000 mL og 200 mL filter tips til arbeidsstasjonen, og fylle de medfølgende bufferflasker med det nødvendige volumet av buffere.
MERK: buffere som kreves for denne rensing protokollen (AL, AW1, AW2, og AE) er alle inneholdt innenfor QIAamp DNA Krakk Mini Kit. Brukeren må levere 100% etanol som er nødvendig for AW buffers og som en løsning som brukes i renseprosessen. - Legg det nødvendige volumet av den medfølgende proteinase K-løsning i en steril 1,5 ml mikro tube og plassere den i spor A på arbeidsstasjonen. Også legge det nødvendige antall (lik det antall prøver som blir renset) i 2 ml sikker låsemikrosentrifuge prøverør RB til riste delen av arbeidsstasjonen.
- Pass på at lokkene av prøverørene er trygt plassert i de riktige sporene på arbeidsstasjon, ettersom en unnlatelse av å gjøre dette vil resultere i en feilmelding når maskinen utgangspunktet skanner arbeidsstasjon for å sørge for at alle nødvendige plast og væsker er tilgjengelig for den valgte kjøre.
- Ved hjelp av berøringsskjermen på arbeidsstasjonen, velger DNA Krakk - Menneskelig Krakk - Patogen Detection Protocol, og lese gjennom de neste skjermbildene for å sikre at arbeidsstasjonen er lagt i riktig. Når alle sjekk skjermer er passert, velger du Start for å kjøre denne protokollen.
- Hvis utvinne DNA fra mer enn 12 prøver, begynner homogenisering prosessen (trinn 1) for det neste settet med prøvene, siden et løp av 12 prøver tar ~ 72 minutter å fullføre på arbeidsstasjonen.
- Fjern prøvene fra rotor adaptere, cap dem, og plass ved -20 ° C inntil nødvendig for påfølgende nedstrøms analyser.
- På dette punktet, kombinere de tre replikate rensinger for en individuell prøve (totalt analysert mengde = 1 g) ved hjelp av en sentrifugering / fordamping-basert system. Kombiner de replikater og re-elute til et sluttvolum på 100 ul Tris-buffer ETDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For denne studien ble frisk fecal avføring og søppel prøver utvinnes fra en kommersiell broiler hus (~ 25.000 fugler) i det sørøstlige USA. De slaktekylling (Gallus gallus) var Cobb-500 kors, og de var 59 dager gammel på tidspunktet for prøvetaking. Ferske fekal og søppel prøvene ble utvunnet fra fire forskjellige områder i huset (nær kjøling pad, nær drikkekopp / mater linjer, mellom drikkekopp / mater linjer, og i nærheten av avtrekksvifter), og prøver fra hvert av disse områdene inneholdt fem pooled prøver fra innenfor dette området. Prøver fra de fire områdene av huset ble hentet ut og kvantitativt / kvalitativt analysert separat i henhold til prøvetype (fekal eller kull). Dataene som presenteres nedenfor representerer gjennomsnittsverdier for hele huset for både miljøprøvetyper.
Totalt 16S rDNA abundances, et estimat av den totale bakteriesamfunnet som finnes i en prøve, ble bestemt ved hjelp av en tidligere publisereed qPCR protokoll 20, og verdiene ble normalisert ved hjelp av mengden av DNA gjenvunnet fra hver ekstraksjon fremgangsmåte (basert på fluorometrisk analyse beskrevet tidligere 21. Av de tre ekstraksjonsmetoder, Figur 1 viser at den mekaniske metode konsekvent gitt den høyeste totale bakterie normalisert gen overflod estimater for både fekale og søppel prøver (5,85 ± 0,16 og 5,56 ± 0,08 log 10 16S rDNA kopier ng -1 DNA ekstrahert, henholdsvis), mens, den enzymatisk metode konsekvent gitt de laveste fekal og søppel estimater (4,83 ± 0,54 og 4,61 ± 0,13 log 10 16S rDNA-kopier ng -1 DNA ekstrahert, henholdsvis). Den nye hybrid utvinning metoden gitt normalisert 16S rDNA abundances som ble funnet å være signifikant (p ≤ 0,05) høyere enn den enzymatiske metoden, men statistisk lik den mekaniske metode for både fekale og søppel prøver (5,50 ± 0,16 og5,23 ± 0,14 log 10 16S rDNA-kopier ng -1 DNA ekstrahert, henholdsvis). Derfor er både mekanisk og hybrid ekstraksjonsmetoder gitt en større kvalitativ estimat av den totale bakterielle samfunn innenfor disse prøvene enn den enzymatiske metode.
For å kvalitativt vurdere de totale bakterie samfunn fra hver prøvetype og ekstraksjon metoden, microbiomic arbeidsflyt som gjennomgått i Navas-Molina et al. (2013) 22 ble anvendt. Kort sagt, det V4 region av 16S rRNA-genet ble PCR forsterket med primere som inneholder MiSeq sekvense adaptere og Golay strekkoder og sekvensert på Illumina MiSeq plattformen 23,24. Raw sekvense data ble deretter behandlet i QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 med standardparameterne. Sekvens databehandling inkludert: kvalitets-filtrering; Otu clustering (open-referansen på 97% grensen) med UCLUST 27; Otu overflod filtreringsnivå på <0,005% 22, 31; taksonomi oppdrag ved bruk av RDP Klassifiserings mot Greengenes 13_5 referansedatabase 28; sekvens innretting med PyNAST 29 mot Greengenes kjerne satt 28; fylogenetisk tre konstruksjon med FastTree 30. Den core_diversity_analyses.py manuset ble brukt til å kjøre alle alfa beta mangfold beregninger og til å generere alle plott, diagrammer og statistikk på en sekvense dybde på 7865 sekvenser per prøve.
Den valgte DNA utvinning metoden viste en klar innvirkning på de gjen fekal og søppel microbiomes. Starter på phylum-nivå (tabell 1), den samlede data (regnskap for både fekal og søppel prøver) viste at metoder som innehar den svært forstyrrende homogenisering trinn (mekanisk, hybrid) typisk overgitt samfunn med høyere Forekomsten av Gram-positive phyla (98,0 og 97,49%, henholdsvis) i forhold til den enzymatiske metode (81,74%). Omvendt, gram-negativ phylarepresenterte en meget større del av den samlede bakterie fellesskap utvinnes fra den enzymatiske metoden (17,49%) sammenlignet med enten den mekaniske (1,89%) eller hybrid (2,38%) metoder. Denne forskjellen utvinning effekt på de samlede microbiomic profiler og utbredelsen av Gram-positive og Gram-negative organismer ble effektivt demonstrert på slekten nivå (figur 2) .De mekaniske og hybride metoder produsert relativt like microbiomic profiler, mens enzymatisk metode mikrobiomer viste en annen fordeling av de relative overflod av det gjenvunne taksa. For eksempel, Gram-negative Alistipes spp.in avføringen prøver (den røde blokken med A; 7,71% av det totale samfunnet) hentet hjelp av enzymatisk metode er sterkt redusert i fingeravtrykkene til de andre to utvinningsmetoder (røde piler; 0,47 -0,81%), men den Gram-positive Lactobacillus spp. (Stor lilla blokken med L) var mye mer utbredt reduseres når du bruker Enzymatic metode (42,71%) sammenlignet med den mekaniske eller hybride metoder (57,22% og 61,85%, henholdsvis). Likevel, mens de relative Forekomsten av taksa oppviste noen forskjeller mellom de tre ekstraksjonsmetoder, var det totale antall taksa oppdaget lik for alle tre metoder for både fecal (92 av 112 taksa) og kull (96 av 112 taksa).
Den enzymatisk metode konsekvent ga bakteriesamfunn med størst rikdom, mangfold, og jevnhet (ved hjelp av chao1, phylogenetic mangfold, og equitability beregninger, henholdsvis) for både fekale og søppel prøver, med mekanisk metode konsekvent viser de laveste anslagene for disse økologiske parametere (tabell 2). Hybridmetoden konsekvent vist økologiske beregninger mellommann til de to andre metoder. Statistisk sett, de økologiske anslag fra alle prøver, uansett ekstraksjon metode, ble funnet å være like, selv om enzymatisk metoderesultere i en betydelig rikere (p = 0,045) mikrobiomer sammenlignet med mekanisk metode når analysere søppel prøvene. Selv om ingen andre betydelige forskjeller ble funnet mellom ekstraksjonsmetoder, ble de største forskjellene mellom de økologiske parametere som typisk finnes mellom den enzymatiske og mekaniske metoder, med hybrid metode utfører like godt for de andre to fremgangsmåter; lik den kvantitative vurderingen av disse ekstraksjonsmetoder (figur 1).
Figur 1. Kvalitativ bakteriell fellesskap sammenligning basert på DNA-ekstraksjonsmetoder. Søyler representerer gjennomsnitt log 10 -transformmed 16S rRNA-genkopier som bestemt ved qPCR normalisert mot mengden av DNA utvunnet fra fekale (fylte søyler) eller kull (stiplede søyler) prøve ( basert på fluorometrisk besluttsomhet). The DNA-ekstraksjon metode som brukes for å oppnå disse verdier er angitt på x-aksen. De feilfelt representerer standardavviket mellom 4 replikere prøver. For hver prøvetype (avføring eller kull), bokstaver over søylene representerer signifikant forskjellige midler basert på enveis ANOVA-analyse ved bruk av Tukey multiple sammenligningstest (p = 0,05).
Figur 2. Genus-nivå microbiomic sammenligning av DNA utvinning metoder. Hver kolonne representerer den gjennomsnittlige totale bakteriesamfunnet (basert på 16S rRNA-genet Illumina MiSeq data) av gjenvunnet taxa for hver utvinningsmetoden for avføringen (første tre søyler) og søppel ( siste tre kolonner) prøver. Hver kolonne representerer gjennomsnittet av fire forskjellige prøver fra forskjellige områder i broiler huset. Bokstaven i bunnen av kolonnene angir gassutvinninghandlingsmetode (M = mekanisk, E = Enzymatisk, H = hybrid). De forskjellige farger på hver kolonne representerer den relative overflod av en slekt innenfor den samlede fellesskap, og farge for hver slekter er den samme for alle kolonner.
Tabell 1. Phylum-nivå microbiomic sammenligning av DNA utvinning metoder. Relative abundances (% totalt gjenvunnet sekvenser) for hver DNA-ekstraksjon metoden i to Gram-positive (Actinomycetes og Firmicutes) og 3 Gram-negative (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) phyla utvinnes fra microbiomic analyse fra begge prøver typer.
Tabell 2. Parvise sammenligninger av r ichness, Mangfold og jevnhet estimater for de tre DNA utvinning metoder basert på genus-nivå microbiomic bakteriesamfunnet analyser QIIME. For begge prøvetyper, parvise sammenligninger ble utført for de tre mulige utvinning metodekombinasjoner. De totale bakteriesamfunnsparametre vurderes inkluderer rikdom (α-mangfold basert på chao1 statistikk), mangfold (β-mangfold basert på det fylogenetiske Diversity statistikk), og jevnhet (basert på equitability statistikk). Verdier representerer gjennomsnittet (standardavvik) på 4 forskjellige prøver området innenfor broiler huset, og en α = 0,05 nivået ble brukt til å bestemme betydning mellom parvise sammenligninger. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-ekstraksjon metode som brukes tegnet de kvantitative og kvalitative totale bakterie samfunnet estimater for både fekale og søppel prøver, støtter utvalget analyserer avhengige natur DNA utvinning metoder sett tidligere 1,3,6. For både fekale og søppel prøver, rekkefølgen på resultatene av DNA utvinning metoder var annerledes for den kvantitative (Mekanisk> Hybrid> Enzymatisk) og kvalitative (Enzymatisk> Hybrid> Mekanisk) totale bakterie samfunnet estimater. Selv om hybrid-metoden ikke ga de høyeste kvantitative eller kvalitative beregninger, i begge tilfeller hybrid metode ga resultater som var statistisk lik den høyeste utføre ekstraksjon metode (figur 1, tabell 2), for derved å gi den beste kombinasjon av kvalitativ og kvantitativ total bakterielle samfunnet estimater av de tre uttrekksmetoder testes. Det bør ne bemerkes at bakteriesamfunnet profiles kan være sterkt påvirket av DNA utvinning metoden, som sett i resultatene fra denne studien (figur 2, tabell 1) og andre tidligere studier ved hjelp av miljøprøver 4,5,8,9,11,12, og disse forskjellige effekter kan på det sterkeste påvirke analyse og tolkning av studiedata. Å vite dette, må forskerne sterkt vurdere den aktuelle utvinningsmetoden for sine prøvetyper og eksperimentelle mål på en studie-by-studie basis.
Et viktig skritt for effektiviteten av romanen hybrid metode er den kraftige homogenisering skritt til stor hjelp i ikke bare utgivelsen av bakterieceller fra de komplekse fecal / jord matriser, men også for å bryte ned de tøffere celleveggene i Gram-positive medlemmer . De høyere kvantitative estimater (figur 1) og høyere andel av Gram-positive Aktinobakterier og Firmicutes innenfor microbiomes for både utvinning metoder som brukes dette homogenisering trinn (
Denne metoden, som beskrevet, inneholder noen spesifikke krav til hvilke brukere som trenger å være klar. Først er bruken av en høyeffekts homogenisator samt noen komponenter av et kommersielt tilgjengelig kit ekstraksjon. Tidligere studier har vist at andre mekaniske perle-juling trinn eller kraftige homogenizers forbedre DNA utvinning effektivitet og gi 4,5,9; Derfor, kunne en annen type mekanisk homogenisering trinn integreres inn i hybrid utvinning metode (selv om bruken av forskjellige spesialutstyr kan være nødvendig). Hybridmetoden beskrevet her også bruker perle-juling rør som er laget spesielt for homogenisatoren og spesifikk for miljøprøver på grunn av suksessen av denne lyse matrise i tidligere community-baserte studier fra fjærfe prøver 15, 31-33. Til slutt blir den "gullstandard" enzymatisk DNA-ekstraksjon metode (QIAamp DNA Krakk Mini Kit) som er nødvendig for den enzymatiske rensing av prøve-DNA i hybrid-protokoll, siden det har vist seg å være den mest effektive ekstraksjon enzymatisk metode ved bruk av fekale prøver 3,18,19. Mens bruken av robotarbeidsstasjonen ikke er nødvendig (instruksjoner med settet kan utføres for hånd), ved bruk av robot arbeidsstasjon øker gjennomstrømningen, reduserer behandlingsfeil, og resulterer i høyere kvalitet DNA for ytterligere genetisk analyse 7. Automatisering av denne type, ved hjelp av de eksisterende mekaniske kits for tiden ikke er tilgjengelige, noe som representerer en annen fordel med den hybride metoden.
Foreløpig er robot arbeidsstasjon beskrevet i denne protokollen begrenset til behandling av maksimalt 12 prøver i 72 min, men foreløpig arbeid har vist at denne metoden fungerer like godt i høyere gjennomstrømning workstatiden som kan behandle 96 prøver i løpet av 40 min (data ikke vist). Ytterligere testing av dette mye høyere gjennomstrømning alternativet vil i stor grad forbedre effektiviteten av hybrid metoden siden flere prøver kan behandles på en semi-automatisk måte i løpet av en typisk dag. Også foreløpige data ved hjelp av denne romanen DNA utvinning metoden har vist at det er effektivt for andre fjørfe-relaterte prøver (f.eks hud / fjær skyllinger, slaktekyllinger, coecale innhold homogenates) samt andre typer miljøprøver (f.eks landbruksjord , svine avføring, hest avføring, geit avføring, storfe avføring). Derfor vil fremtidige studier trenger å bestemme effekten av dette hybrid metode for ekstraksjon av DNA fra mange landbruksprodukter og miljøprøver. Ytterligere validering av denne metoden ved fremtidige studier vil potensielt gi rom for en bredere vedtakelsen av denne metoden for vurdering av totale bakteriesamfunn fra en rekke landbruksvarer og miljø innstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
- McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
- Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
- Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
- Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
- Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
- Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
- Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
- Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
- Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
- Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
- Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
- Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
- Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
- Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
- Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
- Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
- Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
