Abstract
L'efficacia di protocolli di estrazione di DNA può essere altamente dipende sia dal tipo di campione indagati ei tipi di analisi effettuate a valle. Considerando che l'uso di nuove tecniche di analisi della comunità batterica (ad esempio, microbiomics, metagenoma) sta diventando sempre più prevalente nelle scienze agrarie e ambientali e molti campioni ambientali all'interno di queste discipline può essere physiochemically e microbiologicamente unico (ad esempio, fecale e campioni lettiera / biancheria da lo spettro della produzione di pollame), metodi di estrazione del DNA appropriati ed efficaci devono essere scelti con cura. Pertanto, un metodo di estrazione del DNA ibrido romanzo semi-automatico è stato sviluppato specificatamente per l'uso con i campioni di produzione di pollame ambientale. Questo metodo è una combinazione dei due tipi principali di estrazione del DNA: meccanica ed enzimatica. A due fasi intense passo omogeneizzazione meccanica (con bead-battendo specificamente formulato per environmencampioni TAL) inserito all'inizio del metodo di estrazione del DNA "standard" enzimatica per campioni fecali per migliorare la rimozione di batteri e DNA dalla matrice del campione e migliorare il recupero di batteri Gram-positivi membri della comunità batteriche. Una volta che è stata avviata la parte di estrazione enzimatica del metodo ibrido, il processo di purificazione rimanente è stato automatizzato utilizzando una stazione di lavoro robotizzata per aumentare il throughput del campione e diminuire errore di elaborazione del campione. Rispetto ai metodi di estrazione del DNA severe meccaniche ed enzimatiche, questo nuovo metodo ibrido fornito le migliori prestazioni complessive combinato quando si considera quantitativa (con 16S rRNA qPCR) e qualitativo (utilizzando microbiomics) le stime del totale comunità batteriche durante l'elaborazione di feci di pollame e campioni di lettiera .
Protocol
1. omogeneizzazione meccanica di pollame ambientale campioni di produzione
- Prima di estrazione, impostare un bagno d'acqua a 95 ° C e lasciare il tempo bagnomaria per raggiungere tale temperatura.
- Pesare 0,33 g di terra o di materiale fecale in una provetta 2 ml di Lisi Matrix E.
- Non superare 0,33 g di campione nel tubo, perché altrimenti le seguenti soluzioni per superare la capacità del tubo.
- Scongelare i campioni congelati a RT prima della pesata.
- Per analizzare un totale di 1 g di suolo / feci, pesare 3 replicare 0,33 g campioni per ogni campione ambientale individuo.
- Conservare i campioni a -20 ° C all'interno dei tubi conici matrice prima dell'estrazione, se necessario.
- Aggiungere 825 microlitri Sodium Phosphate Buffer e 275 ml di soluzione PLS per una provetta. Miscelare utilizzando un vortex per ~ 15 sec e poi centrifugare i campioni a 14000 xg per 5 min.
- Versare il Supernatant e aggiungere 700 ml di tampone ASL. Mescolare con un vortice per 5 sec.
- Assicurarsi che vi sia spazio di testa (~ 10% del volume totale) disponibili nel tubo conico a questo punto. Se non c'è spazio di testa, i tubi si hanno la tendenza a perdere durante l'omogeneizzazione successivo passo che potrebbe portare a contaminazione incrociata e / o perdita di campione.
- Porre i campioni in un FastPrep 24 Instrument, e omogeneizzare i campioni ad una velocità di 6,0 m / sec per 40 sec.
- Centrifugare il campione omogeneizzato a 14000 g per 5 min. Trasferire il surnatante in una sterile 2 ml provetta.
- Per massimizzare il recupero di DNA dal campione, ripetere i punti da 1.4 a 1.6, che combina il surnatante nella stessa provetta sterile, 2 ml.
2. enzimatica Inibizione di inibitori di omogenati campione
NOTA: Questo protocollo utilizza il kit QIAamp DNA Sgabello Mini.
- Incubare lasupernatante in un bagno d'acqua a 95 ° per 5 minuti per massimizzare il recupero del DNA da eventuali cellule rimanenti nel surnatante.
- Incubare a 70 ° C per i campioni contenenti organismi prevalentemente Gram-negativi. Tuttavia, se sono presenti (che è il caso con pollame campioni fecali) organismi Gram-positivi, incubare a 95 ° C.
- Utilizzare clip di plastica bloccaggio sui tubi microcentrifuga per assicurare che i tubi non "pop" aperto e potenzialmente perdere volume del campione come pressione può accumularsi in questi tubi microcentrifuga sigillati.
- Aprire ogni provetta per scaricare la pressione, ri-cap tubi microcentrifuga e miscelare con un vortice per 15 sec.
- Centrifugare il campione a 14000 g per 1 minuto, rimuovere 1,2 ml del surnatante e inserirlo in un nuovo sterile 2 ml provetta.
- Aggiungere 1 scheda Inhibitex per ogni campione, e mescolare con un vortice fino a quando il campione ha un / liquido bianco sporco uniformemente bianco.
- Evitare touching scheda Inhibitex mentre metterlo nella provetta contenente il campione. Per fare questo, inserire il blister contenente la scheda direttamente sopra la provetta aperta e spingere delicatamente la scheda dal blister e in provetta.
- Incubare il campione per 1 min a RT (~ 25 ° C) e centrifugare a 14.000 xg per 5 min.
- Trasferire tutto il liquido sterile 1,5 ml provetta e centrifugare a 14.000 xg per 5 min.
- Evitare eventuali particelle residue che possono essere pellet sul fondo della provetta al termine della fase 2.5 durante il trasferimento del liquido.
3. Automated Purificazione DNA Utilizzando il QIAcube Robotic Workstation
NOTA: Il numero di materiali di consumo di plastica, la disposizione degli adattatori rotore campione all'interno della centrifuga, ed i volumi richiesti dei buffer / soluzioni dipendono numBER di campioni che sono in esecuzione.
- Aggiungi provette di eluizione e tubi di filtro per gli slot all'interno delle schede del rotore. Per ciascun campione, aggiungere 400 microlitri al slot centrale dell'adattatore rotore. Posizionare gli adattatori del rotore nella centrifuga workstation nella disposizione corretta in base al numero di campioni purificato.
- Assicurarsi che tutti i coperchi provetta siano fissati correttamente all'interno dell'adattatore del rotore dal momento che un fallimento di farlo potrebbe comportare taglio durante una delle fasi di centrifugazione del protocollo di purificazione.
- Aggiungere il numero di 1.000 microlitri e 200 microlitri puntali con filtro alla workstation, e riempire le bottiglie tampone in dotazione con il volume di buffer.
NOTA: I buffer necessari per questo protocollo di purificazione (AL, AW1, AW2, e AE) sono tutti contenuti all'interno del Kit DNA QIAamp Sgabello Mini. L'utente deve fornire l'etanolo 100% che è necessario per il bu AWffers e come soluzione utilizzata nel processo di purificazione. - Aggiungere il volume richiesto di soluzione K proteasi fornito in una sterile 1,5 ml provetta e metterlo nella fessura A nella workstation. Inoltre, aggiungere il numero (pari al numero di campioni purificazione) di 2 ml sicuro bloccaggio provettoni microcentrifuga RB alla sezione shaker della workstation.
- Assicurarsi che i coperchi dei tubi di esempio sono inseriti saldamente nelle apposite fessure sulla workstation, dal momento che un fallimento di farlo si tradurrà in un errore quando la macchina esegue la scansione inizialmente la workstation per assicurarsi che tutte le materie plastiche ei liquidi necessari sono disponibili per la richiesta correre.
- Utilizzando il touch screen sulla workstation, selezionare la Stool DNA - Sgabello Umano - patogeni Rilevazione Protocollo, e leggere le schermate successive per assicurare che la workstation è stata caricata correttamente. Una volta che tutti gli schermi di controllo vengono passati, selezionare Avvia per eseguire questo protocollo.
- Se l'estrazione di DNA da più di 12 campioni, iniziare il processo di omogeneizzazione (Fase 1) per la prossima serie di campioni, dal momento che una corsa di 12 campioni richiede ~ 72 minuti per completare sulla workstation.
- Rimuovere i campioni dagli adattatori rotore, li cap, e posto a -20 ° C fino al momento per le successive analisi a valle.
- A questo punto, combinare le purificazioni 3 replicati per un singolo campione (totale analizzato quantità = 1 g) utilizzando un sistema di centrifugazione / basato evaporazione-. Unire le repliche e le ri-eluire ad un volume finale di 100 ml di tampone Tris-ETDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per questo studio, escrementi fecali freschi e campioni di lettiera sono stati recuperati da una casa commerciale broiler (~ 25.000 uccelli) nel sud-est degli Stati Uniti. I polli da carne (Gallus gallus) erano Cobb-500 attraversa, ed erano 59 giorni di età al momento del campionamento. Freschi campioni di feci e lettiere sono stati recuperati da quattro aree distinte all'interno della casa (vicino a pad di raffreddamento, vicino alle linee waterer / alimentazione, tra le righe waterer / alimentazione, e nei pressi di aspiratori), e campioni provenienti da ciascuno di questi settori contenevano cinque pool campioni all'interno di tale zona. I campioni delle quattro zone della casa sono stati estratti e quantitativamente / qualitativamente analizzati separatamente in base al tipo di campione (fecale o lettiera). I dati presentati di seguito rappresentano i valori medi per tutta la casa per entrambi i tipi di campioni ambientali.
Totale abbondanze 16S rDNA, una stima della comunità batterica totale contenuta all'interno di un campione, sono stati determinati utilizzando un precedente pubblicazioneprotocollo ed qPCR 20, ei valori sono stati normalizzati utilizzando la quantità di DNA recuperato da ciascun metodo di estrazione (basati su analisi fluorimetrica descritto precedentemente 21. Dei tre metodi di estrazione, la Figura 1 mostra che il metodo meccanico costantemente disponibile la massima totale batterica abbondanza gene normalizzata stime per entrambi i campioni fecali e degli scarti (5,85 ± 0,16 e 5,56 ± 0,08 log 10 copie 16S rDNA ng -1 DNA estratto, rispettivamente) e che, il metodo enzimatico costantemente fornito le stime più basse fecali e degli scarti (4,83 ± 0,54 e 4,61 ± 0,13 log 10 copie 16S rDNA ng -1 DNA estratto, rispettivamente). Il metodo di estrazione ibrido romanzo prodotto normalizzati abbondanze 16S rDNA che sono stati trovati ad essere significativamente (p ≤ 0,05) superiore al metodo enzimatico, ma statisticamente simile al metodo meccanico per sia i campioni di feci e lettiera (5,50 ± 0,16 e5.23 ± 0.14 log10 copie 16S rDNA ng -1 DNA estratto, rispettivamente). Pertanto, sia i metodi di estrazione meccanici e ibridi fornito una maggiore stima qualitativa totali comunità batteriche all'interno di questi campioni rispetto al metodo enzimatico.
Al fine di valutare qualitativamente totali comunità batteriche da ogni tipo di campione e metodo di estrazione, il flusso di lavoro microbiomic come rivisto in Navas-Molina et al. (2013) 22 è stato utilizzato. In breve, la regione V4 del gene 16S rRNA PCR è stato amplificato con primer contenenti adattatori sequenziamento MiSeq e codici a barre Golay e sequenziato sulla piattaforma Illumina MiSeq 23,24. Dati grezzi sequenziamento è stato poi trasformato in QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 utilizzando i parametri di default. Elaborazione dei dati di sequenza incluso: qualità-filtraggio; OTU di clustering (aperto riferimento al soglia del 97%) con UCLUST 27; OTU livello di filtraggio abbondanza di <0,005% 22, 31; Assegnazione tassonomia utilizzando la RDP Classificatore nel database di riferimento Greengenes 13_5 28; allineamento di sequenze con PyNAST 29 contro il nucleo Greengenes set 28; costruzione albero filogenetico con FastTree 30. Lo script core_diversity_analyses.py è stato utilizzato per eseguire tutte le metriche diversità alpha beta e di generare tutti i grafici, grafici e statistiche a una profondità di 7.865 sequenze sequenziamento per campione.
Il metodo di estrazione del DNA scelto mostrato una chiara influenza sulle microbiomes fecali e lettiera recuperati. Partendo dal livello di phylum (tabella 1), i dati complessivi (pari al entrambi i campioni fecali e lettiera) ha rivelato che i metodi di possedere il passo altamente dirompente omogeneizzazione (meccanica, ibrido) comunità tipicamente fruttato con abbondanze elevate di Gram-positivi phyla (98.0 e 97.49%, rispettivamente) rispetto al metodo enzimatico (81.74%). Al contrario, phyla Gram-negativirappresentata una parte molto maggiore della comunità batterica complessiva recuperato dal metodo enzimatico (17.49%) rispetto sia sulle (1,89%) o ibrida (2,38%) metodi meccanici. Questo effetto di estrazione differenziale sui profili microbiomic complessivi e la prevalenza di organismi Gram-positivi e Gram-negativi è stata dimostrata efficace a livello di genere (Figura 2) .I metodi meccanici e ibride prodotte profili microbiomic relativamente simili, mentre il metodo enzimatico microbiome mostrato una diversa distribuzione della relativa abbondanza dei taxa recuperato. Ad esempio, Alistipes Gram-negativi spp.in campioni feci (il blocco rosso con la A, 7,71% della comunità totale) estratti con il metodo enzimatico è notevolmente ridotta nelle impronte digitali per gli altri due metodi di estrazione (frecce rosse; 0.47 -0.81%), ma la Gram-positivi Lactobacillus spp. (Grande blocco viola con la L) era molto più diffuso sia ridotta, nell'uso del enzMetodo ymatic (42.71%) rispetto ai metodi meccanici o ibridi (57,22% e 61,85%, rispettivamente). Tuttavia, mentre l'abbondanza relativa della taxa esposte alcune differenze tra i tre metodi di estrazione, il numero totale di taxa scoperto erano simili per tutti e tre i metodi sia per la fecale (92 di 112 taxa) e rifiuti (96 112 taxa).
Il metodo enzimatico costantemente prodotto comunità batteriche con la più grande ricchezza, la diversità, e uniformità (utilizzando il chao1, filogenetica Diversità, e metriche equità, rispettivamente) per entrambi i campioni di feci e di lettiera, con il metodo meccanico costantemente mostrano le stime più basse per questi ecologica parametri (Tabella 2). Il metodo ibrido costantemente dimostrato metriche ecologici intermediario per gli altri due metodi. Statisticamente, le stime ecologici da tutti i campioni, indipendentemente dal metodo di estrazione, sono risultati simili, anche se il metodo enzimaticoha comportato un significativamente più ricco (p = 0,045) microbiome rispetto al metodo meccanico quando si analizzano i campioni lettiera. Mentre altre differenze significative sono state trovate tra i metodi di estrazione, le maggiori differenze tra i parametri ecologici sono stati trovati tipicamente tra il enzimatica e metodi meccanici, con il metodo ibrido esegue altrettanto bene agli altri due metodi; simile alla valutazione quantitativa di questi metodi di estrazione (figura 1).
Figura 1. qualitativa confronto comunità batterica basano su metodi di estrazione del DNA. Le colonne rappresentano la media log 10 -transformmed 16S rRNA copie del gene, come determinato dal qPCR normalizzato contro la quantità di DNA recuperato da fecali (barre piene) o lettiera (barre tratteggiate) campione ( sulla base di determinazione fluorimetrica). The metodo di estrazione del DNA utilizzato per ottenere questi valori è indicato l'asse x. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard tra i 4 campioni replicati. Per ogni tipo di campione (feci o Litter), le lettere di cui sopra le colonne rappresentano mezzi molto diversi sulla base di una via di analisi ANOVA con test di confronto multiplo del Tukey (p = 0.05).
Figura 2. livello Genus confronto microbiomic dei metodi di estrazione del DNA. Ogni colonna rappresenta la comunità media totale batterica (sulla base di gene 16S rRNA dati Illumina MiSeq) di taxa recuperato per ogni metodo di estrazione per le feci (prime tre colonne) e rifiuti ( ultime tre colonne) campioni. Ciascuna colonna rappresenta la media di quattro campioni diversi da zone distinte all'interno della casa broiler. La lettera alla base delle colonne indica la Extrmetodo di azione (M = meccanico, E = enzimatico, H = Hybrid). I colori diversi in ogni colonna rappresentano l'abbondanza relativa di un genere all'interno della comunità complessiva, e il colore per ciascun generi è la stessa per tutte le colonne.
Tabella 1. a livello di Phylum confronto microbiomic dei metodi di estrazione del DNA. Abbondanze relative (% totale recuperato sequenze) per ogni metodo di estrazione del DNA del 2 Gram-positivi (Attinomiceti e Firmicutes) e 3 Gram-negativi (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) phyla recuperato dall'analisi microbiomic da entrambi i tipi di campioni.
Tabella 2. I confronti a coppie di r ichness, Diversità, e le stime uniformità dei metodi di estrazione del DNA a base di tre-livello di genere comunità batterica microbiomic analisi utilizzando QIIME. Per entrambi i tipi di campioni, confronti a coppie sono stati eseguiti per i tre possibili combinazioni di metodi di estrazione. Il totale parametri valutati comunità batteriche includono ricchezza (α-diversità basata sulla statistica chao1), diversità (β-diversità basata sulla statistica filogenetica Diversity), e uniformità (basata sulla statistica equità). I valori rappresentano la media (deviazione standard) di 4 campioni dell'area distinte all'interno della casa griglia, e un α = 0,05 livello è stato utilizzato per determinare significato tra i confronti a coppie. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo di estrazione del DNA usato effettuata totali stime comunità batteriche quantitativi e qualitativi sia per i campioni di feci e di lettiera, sostenendo l'analisi dei campioni natura dipendente di metodi di estrazione del DNA visto in precedenza 1,3,6. Per entrambi i campioni di feci e del disordine, l'ordine di esecuzione dei metodi di estrazione del DNA era diverso per il quantitativo (meccanica> Hybrid> enzimatica) e qualitativa (enzimatica> Hybrid> Meccanica) totali stime della comunità batteriche. Mentre il metodo ibrido non produceva più alte stime quantitative o qualitative, in entrambi i casi il metodo ibrido ha prodotto risultati statisticamente simile al metodo di esecuzione più alta di estrazione (figura 1, tabella 2), producendo in tal modo la migliore combinazione di totale qualitativa e quantitativa stime batteriche comunità dei tre metodi di estrazione testati. Va notato che ne batterica profil comunitàes possono essere fortemente effettuate con il metodo di estrazione del DNA, come si è visto nei risultati di questo studio (Figura 2, tabella 1) e altri studi precedenti utilizzando campioni ambientali 4,5,8,9,11,12, e questi effetti differenziali possono fortemente influenzare l'analisi e l'interpretazione dei dati dello studio. Sapendo questo, i ricercatori devono prendere in seria considerazione il metodo di estrazione appropriato per i loro tipi di campione e gli obiettivi sperimentali su una base di studio-by-studio.
Un passo chiave per l'efficacia del nuovo metodo ibrido è il potente passo omogeneizzazione per facilitare notevolmente non solo il rilascio di cellule batteriche dalle matrici / suolo fecali complesse, ma anche per abbattere le pareti cellulari severe dei membri della comunità Gram-positivi . Le stime quantitative superiori (Figura 1) e la percentuale elevata di Gram-positivi e Actinobacteria Firmicutes nei microbiomes per entrambi i metodi di estrazione che usano questo passo omogeneizzazione (
Questo metodo, come descritto, contiene alcuni requisiti specifici degli utenti che hanno bisogno di essere a conoscenza. Il primo è l'uso di un omogeneizzatore ad alta potenza, nonché alcuni componenti di un kit di estrazione disponibile in commercio. Studi precedenti hanno dimostrato che altri passi meccanica bead-battitura o omogeneizzatori ad alta potenza migliorano l'efficienza di estrazione del DNA e producono 4,5,9; Pertanto, un diverso tipo di passo omogeneizzazione meccanica potrebbe essere integrato nel metodo di estrazione ibrida (anche se può essere richiesto l'uso di attrezzature specializzate differente). Il metodo ibrido descritto qui utilizza anche i tubi-tallone battere che sono specificamente progettati per l'omogeneizzatore e specifico per i campioni ambientali grazie al successo di questa matrice lisi in studi di comunità hanno da campioni di pollame 15, 31-33. Infine, è necessaria la "standard" metodo di estrazione del DNA enzimatica (QIAamp DNA sgabello Mini Kit) per la purificazione enzimatica del DNA campione nel protocollo ibrido, poiché è stato dimostrato che il metodo di estrazione enzimatica più efficace quando si usano campioni fecali 3,18,19. Mentre non è richiesto l'uso del workstation robotica (istruzioni con il kit possono essere eseguite a mano), l'uso della workstation robotica aumenta notevolmente il throughput, minimizza errore di elaborazione, e si traduce in DNA qualità superiore per ulteriori analisi valle 7. Automation di questo tipo, utilizzando i kit meccanici esistenti non è attualmente disponibile, che rappresenta un altro vantaggio del metodo ibrido.
Attualmente, la workstation robotica descritto in questo protocollo è limitato al trattamento di un massimo di 12 campioni in 72 min, ma il lavoro preliminare ha dimostrato che questo metodo funziona altrettanto bene in maggiore produttività Postazioni di lavoroin grado di elaborare 96 campioni entro 40 min (dati non mostrati). Ulteriori test di questa opzione rendimento molto più elevato permetterà di migliorare notevolmente l'efficacia del metodo ibrido in quanto più campioni possono essere trattati in modo semi-automatico all'interno di una giornata tipo. Inoltre, dati preliminari che utilizzano questo metodo di estrazione del DNA romanzo ha dimostrato che è efficace per altri campioni di pollame connessi (ad esempio, risciacqui pelle / piuma, risciacqui carcassa, cecale omogenati di contenuti), nonché altri tipi di campioni ambientali (ad esempio, i terreni agricoli , feci suina, feci cavallo, capra, feci feci bovine). Pertanto, studi futuri dovranno determinare l'efficacia di questo metodo ibrido per l'estrazione del DNA da molti campioni agricole e ambientali. Ulteriore validazione di questo metodo da studi futuri potrebbe potenzialmente consentire una più ampia adozione di questo metodo per la valutazione del totale delle comunità batteriche da una varietà di impostazioni agricole e ambientali.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
- McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
- Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
- Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
- Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
- Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
- Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
- Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
- Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
- Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
- Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
- Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
- Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
- Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
- Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
- Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
- Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
- Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
