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Biology

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

Published: December 10, 2014 doi: 10.3791/52161

Abstract

DNA抽出プロトコールの有効性が検討されて試料の種類とを行う下流の分析の両方のタイプに大きく依存することができる。新しい細菌群集解析技術( 例えば、microbiomics、メタゲノミクス)の使用は、農業と環境科学に普及してきており、これらの分野内の多くの環境試料は、物理化学的に及び微生物学的に一意であることができることを考えると( 例えば、糞便およびリットル/寝具サンプルから家禽生産スペクトル)、適切かつ効果的なDNA抽出法を慎重に選択する必要がある。したがって、新規な半自動ハイブリッドDNAの抽出方法は、環境家禽生産サンプルで使用するために開発された。機械的および酵素:この方法は、DNA抽出の2つの主要なタイプの組み合わせである。特に環境に関する用に製剤化ビーズビーティングを用いた2段階の強い機械的均質化工程(タルサンプル)、「ゴールドスタンダード」糞便サンプルは、サンプルマトリックスからの細菌およびDNAの除去を促進し、グラム陽性細菌のコミュニティのメンバーの回収率を向上させるための酵素DNA抽出方法の初めに添加した。ハイブリッド方式の酵素抽出部が開始された後、残りの精製プロセスは、サンプルのスループットを増大させ、試料処理エラーを減少させるために、ロボットワークステーションを使用して自動化した。定量的な(16S rRNAを定量PCRを用いて)および定性的を考慮した場合、厳格な機械的および酵素的DNA抽出法と比較して、この新規なハイブリッド方法は、(microbiomicsを使用して)最高の全体的な組み合わせの性能を提供し、総細菌群集の推定家禽の糞及びリターサンプルを処理する際に。

Protocol

環境家禽生産試料の1。機械的均質化

  1. 抽出前に、95℃の水浴を設定し、水浴時間がその温度に到達させる。
  2. 2ミリリットルライジングマトリックスEチューブに土壌や糞便材料の0.33グラムを秤量。
    1. これは、チューブの容量を超えるには、次の解決策の原因となりますので、チューブ内の試料の0.33グラムを超えないようにしてください。
    2. 計量前のRTに凍結サンプルを解凍する。
    3. 土壌/糞便1gの合計を分析するために、各個々の環境サンプルのための3レプリケート0.33グラムのサンプルを秤量。
    4. 抽出前に円錐形の行列チューブ内の-20℃で保存サンプルは、必要に応じて。
  3. サンプルチューブに825μlのリン酸ナトリウム緩衝液およびPLS溶液を275μLを加える。 〜15秒間ボルテックスを用いて混合した後、5分間14000×gでサンプルを遠心する。
  4. supernaをデカントTANTおよびバッファASLの700μlを添加する。 5秒間ボルテックスを用いて混ぜる。
    1. ヘッドスペースは、この時点で円錐管で利用可能(〜10%の総量)があることを確認してください。ヘッドスペースがない場合には、チューブは、交差汚染および/または試料の損失につながる可能性があり、次の均質化工程中に漏れる傾向を有する。
  5. ファストプレップ24インストゥルメントにサンプルを置き、40秒間6.0メートル/秒の速度でサンプルを均質化する。
  6. 5分間14000×gで均質化されたサンプルを遠心。無菌の2ミリリットルの微量遠心チューブに上清を移し。
  7. サンプルからのDNAの回収を最大にするために、繰り返し同じ滅菌2mlのマイクロ遠心チューブに上清を組み合わせ、1.4~1.6ステップ。

サンプルホモジネートからの阻害剤の2酵素阻害

注:このプロトコルはのQIAamp DNAスツールミニキットを使用しています。

  1. インキュベート上清中に残った細胞からのDNAの回収を最大にするため5分間95℃の水浴中で上清。
    1. ほとんどのグラム陰性菌を含む試料を、70℃でインキュベートする。グラム陽性生物(家禽糞便試料の場合である)が存在する場合は、95℃でインキュベートする。
    2. チューブがオープン「ポップ」と、潜在的に圧力などのサンプル量がこれらの密封されたマイクロチューブに構築することができ失わないことを保証するためにマイクロチューブ上のクリップをロックするプラスチックを使用してください。
  2. 圧力、再キャップマイクロチューブを解除し、15秒間ボルテックスを用いて混合する各マイクロ遠心チューブを開きます。
  3. 、1分間14000×gでサンプルを遠心上清の1.2ミリリットルを削除し、新たな無菌の2ミリリットルマイクロ遠心チューブに入れてください。
  4. 各サンプルに1 InhibitExタブを追加し、サンプルが均一に白/オフホワイト液体になるまでボルテックスを用いて混ぜる。
    1. トンを避けるサンプルを含むマイクロ遠心チューブにそれを配置しながらInhibitExタブをouching。これを実現するために、オープンなマイクロ遠心チューブの上に直接タブを含むブリスターパックを置き、静かにブリスターパックから出て、マイクロ遠心チューブにタブを押してください。
  5. 5分間14000×gでRT(〜25℃)で1分間のサンプルと遠心をインキュベートします。
  6. 5分間14000×gでの滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブと遠心分離機にすべての液体を転送します。
    1. 液体を転送する際にステップ2.5の終了時にマイクロ遠心管の底にペレット化した可能性が残っている粒子状物質を避けてください。

QIAcubeロボットワークステーションを使用して3.自動DNA精製

注:プラスチック消耗品の数、遠心分離機内のサンプルローター·アダプターの配置、およびバッファ/ソリューションの必要なボリュームがNUMに依存している実行されているサンプルのBER。

  1. ローター·アダプター内の適切なスロットに溶出チューブとフィルタチューブを追加します。各サンプルについて、ローターアダプタの中央のスロットに400μlを添加する。精製されるサンプルの数に応じて適切な配置で、ワークステーションの遠心分離機ロータアダプタを置きます。
    1. そうしないと、障害が精製プロトコルの遠心分離工程のうちの1つの間にせん断につながる可能性があるので、マイクロ遠心チューブの蓋のすべてが適切にローターアダプタ内に固定されていることを確認します。
  2. ワークステーションに千μLと200μlのフィルターチップの必要数を追加し、バッファの必要量と供給バッファーボトルを埋める。
    注:この精製プロトコル(AL、AW1、AW2、及びAE)に必要なバッファがすべてのQIAamp DNAスツールミニキット内に含まれています。ユーザはAW府のために必要とされる100%エタノールを供給する必要がffers及び精製工程に用いられる溶液として。
  3. 無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内に供給さプロテイナーゼK溶液の必要量を追加して、ワークステーション上のスロットAにそれを置く。また、ワークステーションのシェーカーセクションに2ミリリットル安全ロック微量サンプルチューブRBの(精製されたサンプルの数に等しい)に必要な数を加える。
    1. マシンが最初に必要なすべてのプラスチックと液体が要求されたために利用可能であることを確認するためにワークステーションをスキャンするときにこれを行うには失敗がエラーになりますので、サンプル管の蓋がしっかりと、ワークステーション上の適切なスロットに配置されていることを確認してください実行。
  4. ワークステーション上でタッチスクリーンを使用して、DNAスツールを選択 - 人間スツール - 病原体検出プロトコル、およびワークステーションが正しくロー​​ドされたことを確実にするために、後続の画面をお読みください。いったんすべてのチェック画面が渡され、このプロトコルを実行するために、開始を選択します。
    1. 12以上のサンプルからDNAを抽出した場合は12個のサンプルの実行がワークステーション上で完了するために〜72分かかるため、サンプルの次のセットのための均質化処理(ステップ1)を開始します。
  5. その後の下流の分析に必要とされるまで-20℃で、ローター·アダプターからサンプルを削除し、それらをキャップ、と場所。
    1. この時点で、遠心分離/蒸発ベースのシステムを使用して個々のサンプル(合計で分析量= 1グラム)のための3の反復精製を兼ね備えています。トリスETDAバッファー100μlの最終容量に複製し、再溶出を組み合わせる。

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Representative Results

この研究では、新鮮な糞便糞とゴミサンプルは、米国南東部の商業ブロイラーハウス(〜25000羽)から回収した。ブロイラーは( セキショクヤケイ )コブ-500が交差した、と彼らはサンプリング時に59日齢であった。新鮮糞便及びリターサンプルは(冷却パッドの近くに、給水器/給電線の近くに、給水器/給電線との間に、排気ファンの近く)ハウス内の4つの領域から回収し、そしてこれらの領域の各々からのサンプルは、5つのプールされたが含まれていその領域内からのサンプル。家の4分野からのサンプルを抽出し、定量的/定性的サンプルタイプ(糞便またはリットル)に応じて別々に分析した。以下に示すデータは、両方の環境試料の種類の家全体の平均値を表す。

総16S rDNAの存在量、サンプル中に含まれる全細菌コミュニティの推定値は、以前に公開し使用して決定した以前に21を説明した。3の抽出方法の蛍光分析に基づいて、各抽出法(から回収された定量PCRプロトコル20エド 、そして値はDNAの量を使用して標準化した、 図1は 、機械的な方法は、一貫して最高の全細菌正規化された遺伝子の豊かさを提供したことを示している両方の糞とゴミのサンプルの推定(5.85±0.16および5.56±0.08 log 10の16S rDNAのコピーngの-1 DNAはそれぞれ、抽出された)、酵素法が一貫して最低の糞やゴミの見積もり(4.83±0.54と4.61±を提供し、一方、 0.13ログngの-1それぞれ、抽出したDNAを10の16S rDNAのコピー)。新規なハイブリッド抽出方法は、酵素的方法よりも高いが、ための機械的方法と統計的に類似して有意であることが見出された正規化された16S rDNAの存在量(0.05≤p)を得た両方の糞とゴミの試料(5.50±0.16とngの-1それぞれ、抽出したDNAを5.23±0.14 log 10の16S rDNAのコピー)。したがって、両方の機械およびハイブリッド抽出方法は、酵素的方法よりもこれらのサンプル内の総細菌群集のより定性的な推定値を提供した。

ナバスモリーナに概説として定性的に各サンプルタイプ及び抽出方法、microbiomicワークフローからの全細菌群集を評価するために、(2013)22を使用した。要するに、16S rRNA遺伝子のV4領域をPCRはMiSeqシークエンシングアダプタを含むプライマーとゴレイバーコードを用いて増幅したとイルミナMiSeqプラットフォーム23,24に配列決定した。生のシーケンシングデータは、デフォルトパラメーターを用いてQIIME 1.7.0-devの25,26,27で処理した。含まれるシーケンスデータ処理:品質·フィルタリング。 OTUクラスタリング(97%閾値におけるオープン参照)UCLUST 27を用いて、 <0.005%22のOTU存在フィルタリングレベル、31、 Greengenes 13_5参照データベース28に対してRDP分類器を使用して、分類の割り当て。 Greengenesコアに対してPyNAST 29との配列アラインメントは28を設定します。 FastTree 30を用いて系統樹の構築。 core_diversity_analyses.pyスクリプトは、すべてのアルファベータ多様性メトリックを実行し、サンプルあたり7865シーケンスのシーケンシング深さですべてのプロット、グラフ、統計を生成するために使用された。

選ばれたDNA抽出法が回復し、糞便やごみmicrobiomes上の明確な影響力を示した。門レベル( 表1)で開始し、(糞便とごみ両方のサンプルを占める)全体のデータは非常に破壊的な均質化工程(機械、ハイブリッド)を有する方法は、一般的に、グラム陽性門の高い存在量とのコミュニティをもたらしたことを明らかにした(98.0と酵素法(81.74パーセント)に対して、それぞれ97.49パーセント)。逆に、グラム陰性菌門どちらかの機械(1.89パーセント)またはハイブリッド(2.38%)の方法に比べて酵素法(17.49パーセント)から回収された全体的な細菌群集のはるかに大きな部分を占めた。全体的なmicrobiomicプロファイルこの差分抽出効果とグラム陽性およびグラム陰性菌の蔓延を効果属レベルで実証された( 図2)酵素法のmicrobiomeを示したが、比較的類似microbiomicプロファイルを生産.theの機械およびハイブリッド方 ​​法回収された分類群の相対的存在の異なる分布。酵素法が厳しく他の2つの抽出方法(赤い矢印用指紋低減されるを用いて抽出し、例えば、グラム陰性Alistipesは、糞便サンプル(全コミュニティの7.71パーセントA赤いブロック); 0.47 spp.in -0.81%)が、グラム陽性ラクトバチルス属。 (Lを持つ大規模な紫のブロック)はるか普及ENZを使用するときに低減されました機械的またはハイブリッド方式(それぞれ57.22パーセントと61.85パーセント)と比較してymatic方法(42.71パーセント)。分類群の相対的存在量は、3の抽出方法の間にいくつかの違いを示しながら、それにもかかわらず、発見された分類群の総数は、糞便(112分類群の92)とごみ(112分類群の96)の両方のための3つの方法すべてについて同様であった。

酵素法は、一貫して一貫してこれらの生態系の最安の見積もりを示す機械的な方法で、糞便やごみサンプルの両方のために(chao1、系統発生多様性、公平性メトリック、それぞれを使用して)最大の豊かさ、多様性、および均一性を持つ細菌のコミュニティをもたらしたパラメータ( 表2)。ハイブリッド法は、一貫して他の2つの方法に生態メトリクス仲介を実証した。統計的に、すべてのサンプルからの生態学的推定値は、関係なく抽出法、酵素法が、同様のことが判明したごみのサンプルを分析する際に機械的な方法と比較して有意に豊かなた(p = 0.045)microbiomeになりました。他の有意な差は抽出方法の間で見られなかったが、生態学的なパラメータの間の最大の違いは、一般的に他の2つの方法にも同様に実施するハイブリッド方式で、酵素的および機械的方法との間で発見された。これらの抽出方法の定量的評価に類似した( 図1)。

図1
DNA抽出法に基づいて、図1定性細菌群集の比較。列は、正規化された定量PCRによって決定されたわ ​​けでDNA量に対して10 -transformmed 16S rRNA遺伝子のコピーをログに記録を表す糞便(固体棒)またはごみ(破線バー)サンプル(から回収蛍光測定に基づく)。目これらの値を取得するために使用される電子DNA抽出法は、x軸上に示されている。エラーバーは、4反復サンプル間の標準偏差を表す。各サンプルタイプ(糞便またはごみ)については、上記の文字列は、Tukeyの多重比較検定(p = 0.05)を使用して、一方向ANOVA分析に基づいて有意に異なる平均を表す。

図2
DNA抽出法の図2.属レベルmicrobiomic比較。各列は、(各抽出糞(最初の3列)のための方法及びごみのために回収する分類群の(16S rRNA遺伝子イルミナMiSeqデータに基づく)の平均総細菌群集を表し最後の3列)のサンプル。各列は、ブロイラーハウス内の異なる地域からの4の異なるサンプルの平均を表す。列のベースでの文字はEXTRを示し、アクションメソッド(M =機械、E =酵素、H =ハイブリッド)。各列の異なる色は、全体的なコミュニティの中で属の相対量を表しており、それぞれの属の色は、すべての列に対して同じである。

表1
DNA抽出法の表1門レベルmicrobiomic比較。相対存在度(%合計がシーケンスを回復し)、各2グラム陽性(放線菌及びファーミキューテス)のDNA抽出法と3グラム陰性用(Bacteriodetes、プロテオバクテリア、Tenericutes)門両方のサンプルタイプからmicrobiomic分析から回収。

表2
Rのichnessの表2.対比較、QIIMEを使用した分析属レベルmicrobiomic細菌のコミュニティに基づいて3つのDNA抽出法のための多様性、および均一性の推定値は。両方のサンプルタイプでは、ペアごとの比較が可能な3つの抽出方法の組み合わせについて実施した。査定全細菌コミュニティパラメータは(公平性統計に基づく)豊かさ(chao1統計に基づいて、α-多様性)、多様性(系統発生多様性の統計値に基づいて、β-多様性)、および均一性が含まれる。値は、ブロイラーハウス内を4明確なエリアサンプルの平均(標準偏差)を表し、α= 0.05レベルが対比較間の有意性を決定するために使用された。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

使用したDNA抽出法の両方糞便やごみの試料について定量的および定性的全細菌コミュニティの見積もりを行うこと、試料を支持することは、以前に1,3,6見られるDNA抽出法の依存性を分析します。糞とゴミサンプルの両方のために、DNA抽出方法の性能の順序は、定量的(機械>ハイブリッド>酵素)と定性的な(酵素>ハイブリッド>機械)全細菌コミュニティの見積もりの​​ために異なっていた。ハイブリッド法は、最も高い定量的または定性的な推定値を生成しなかったが、両方の場合において、ハイブリッド法は、それによって定性的および定量的な全体の最適な組み合わせを生成する、最高性能の抽出方法( 図1、表2)と統計的に類似した結果が得られた試験した3つの抽出方法の細菌群集の見積もり。これは、細菌のコミュニティプロフィールを留意すべきNE環境試料4,5,8,9,11,12、およびこれらの差動効果を使用してエスこの研究の結果に見られるように強く( 図2、表1)、DNA抽出法により行うことができ、他の以前の研究は、強くてもよい試験データの分析および解釈に影響を与える。これを知って、研究者は強く、それらのサンプルタイプおよび研究·バイ·研究に基づき、実験的な目標のための適切な抽出方法を検討する必要があります。

新規なハイブリッド方式の有効性への重要なステップが大幅に複雑な糞便/土壌マトリックスからの細菌細胞のリリースだけでなく支援するために、だけでなく、グラム陽性コミュニティのメンバーの厳しい細胞壁を破壊する強力な均質化工程である。高い定量的推定値( 図1)、この均質化ステップを使用した両方の抽出方法のためmicrobiomes内グラム陽性放線菌及びファーミキューテスの高い割合( 1,2,4-6,9が含まれていたときに分析する。細胞および/またはDNAたら/解離されているこれらのマトリックスから放出される、ハイブリッド法の「ゴールドスタンダード」の酵素的方法の使用を効率的にこれらのサンプルからDNAを精製する。ハイブリッド抽出プロトコル内の酵素法の阻害剤結合工程を含めることは、本研究で用いた複雑な環境サンプル中に存在する阻害剤のより効率的な除去を可能にする。機械的な抽出プロトコルに存在しない。このステップ。したがって、酵素purificatと併せて、機械的均質化工程を追加したハイブリッド抽出法、放出されたDNAのイオンは、環境的家禽生産サンプルから全細菌群集の評価のための有効な方法である。

この方法は、説明されているように、ユーザーは注意する必要があります。そのうちのいくつかの具体的な要件が含まれています。最初のハイパワーホモジナイザーの使用だけでなく、市販の抽出キットの一部のコンポーネントです。以前の研究は、他の機械的ビーズビーティングステップまたはハイパワーホモジナイザーは、DNAの抽出効率を向上させ、4,5,9をもたらすことを実証した。 (別の特殊な装置の使用が必要になるかもしれないが)、したがって、機械的な均質化ステップの異なるタイプのハイブリッド抽出方法に組み込むことができる。ここで説明するハイブリッド法はまた、特にホモジナイザー用に設計されており、家禽サンプルから前のコミュニティベースの研究では、この溶解行列の成功15による環境試料に特異的なビーズ鼓動のチューブを使用しています、31-33。糞便試料を使用するときに最も効果的な酵素的抽出方法であることが示されているので、最終的に、 "ゴールドスタンダード"酵素DNA抽出法(のQIAamp DNAスツールミニキット)は、ハイブリッドプロトコルでサンプルDNAの酵素の精製のために必要とされる3,18,19。ロボットのワークステーションの使用は(キットの指示を手で行うことができる)が必要とされていないが、ロボットのワークステーションの使用が大幅にスループットを増加させる処理エラーを最小化し、さらに下流の分析7より高品質のDNAをもたらす。既存の機械的なキットを使用して、このタイプの自動化は、ハイブリッド方式の別の利点を表す、現在利用可能ではない。

現在、このプロトコルに記載のロボットワークステーションは72分で12サンプルの最大の処理に限定されますが、準備作業は、この方法は、より高いスループットworkstatiでも同様に動作することを示しているそれは40分以内に96個のサンプルを処理することができる上に(データは示さず)。多くのサンプルは典型的な一日の中の半自動化された方法で処理することができるので、これより高いスループットオプションの更なる試験が大幅にハイブリッド法の有効性を高める。また、この新規なDNA抽出法を用いて予備的データは、他の家禽に関連するサンプルのために有効であることが示されている( 例えば、皮膚/羽リンス、カーカスリンス、盲腸内容ホモジネート)ならびに環境サンプル( 例えば、農地の他のタイプ、豚糞、馬の糞、ヤギの糞、牛の糞)。そのため、今後の研究では、多くの農業と環境試料からDNAを抽出するため、このハイブリッド法の有効性を決定する必要があります。今後の研究によって、この方法のさらなる検証が潜在的に農業と環境のさまざまな設定から全細菌コミュニティの評価のためのこの方法の採用拡大を可能にするであろう。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysing Matrix E tube MPBio 6914-050 Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate Solution MPBio 6570-205 Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS Buffer MPBio 6570-201
Buffer ASL (560 ml) Qiagen 19082
FastPrep 24 homogenizer MPBio 116004500 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen 51504
QIAcube24 (110V) Qiagen 9001292 Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024) Qiagen 990352
Filter-Tips, 200 ml (1024) Qiagen 990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) Qiagen 990394 For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml) Qiagen 990381 Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

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References

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Tags

分子生物学、問題94、DNA抽出、家禽、環境、糞、ゴミ、半自動、microbiomics、定量PCR
家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法
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Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L.,More

Rothrock Jr., M. J., Hiett, K. L., Gamble, J., Caudill, A. C., Cicconi-Hogan, K. M., Caporaso, J. G. A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples. J. Vis. Exp. (94), e52161, doi:10.3791/52161 (2014).

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