Abstract
Atomic force microscopie (AFM) gebruik piramidevormige tip aan een cantilever om de kracht respons van een oppervlak sonde. De doorbuiging van de tip kan worden gemeten met ~ 10 pN door een laser en in sectoren detector, die kan worden omgezet in beeld topografie. Amplitudemodulatie of "tapping mode" AFM gaat de sonde maakt niet voortdurend contact met het oppervlak, terwijl oscillerende op zijn resonantiefrequentie om een beeld te produceren. In combinatie met een vloeistof cel, tikken-mode AFM kan de beeldvorming van biologische macromoleculen zoals eiwitten in fysiologisch relevante omstandigheden. Tikken-modus AFM vereist handmatig afstemmen van de sonde en frequente aanpassingen van een veelheid van scanning parameters die kunnen worden uitdagend voor onervaren gebruikers. Om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen, deze aanpassingen zijn het meest tijdrovend.
PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produceert een beeld door het meten van een kracht verantse curve voor elk punt van contact met het monster. Met ScanAsyst software, kan PF-QNM worden geautomatiseerd. Deze software past de set-point, aandrijving frequentie, scansnelheid, winsten, en andere belangrijke parameters scannen automatisch voor een bepaald monster. Niet alleen heeft deze taak beschermt fragiele probes en monsters, het vermindert de tijd die nodig hoge resolutie beelden te verkrijgen. PF-QNM is geschikt voor AFM beeldvorming in vloeistof; dus het heeft uitgebreide toepassing voor beeldvorming van biologisch relevante materialen.
De methode in dit document beschrijft de toepassing van PF-QNM om beelden van een bacteriële rosse photoreceptor, RpBphP3 (P3) te verkrijgen, uit fotosynthetische R. palustris in het licht aangepaste toestand. Met deze methode zijn individuele eiwit dimeren van P3 en aggregaten van dimeren waargenomen op een mica oppervlak in de aanwezigheid van een grafisch buffer. Met de nodige aanpassingen aan de oppervlakte en / of de concentratie van de oplossing, deze methodekunnen in het algemeen worden toegepast op andere biologisch relevante macromoleculen en zachte materialen.
Introduction
Atomaire kracht microscopie (AFM) is uitgegroeid tot een zeer belangrijk instrument voor het onderzoeken van de structurele en mechanische eigenschappen van oppervlakken, dunne films en enkele moleculen sinds de uitvinding in 1986 (figuur 1). 1-3 Met behulp van een vloeistof-cel, de methode heeft worden bijzonder bruikbaar in studies van biologische macromoleculen en zelfs levende cellen in een fysiologisch relevante omgeving. 4-10 Tapping mode AFM is van oudsher gebruikt voor beeldvorming van zachte materialen of zwak gebonden moleculen aan het oppervlak, via contact-mode AFM doorgaans ongeschikt wijten om de schade veroorzaakt door de zijdelingse krachten op het monster door de cantilever. 11 Tapping-modus AFM aanzienlijk vermindert deze krachten door het hebben van de tip met tussenpozen raak het oppervlak in plaats van constant in contact. In deze modus wordt de cantilever geoscilleerd of nabij zijn resonantiefrequentie loodrecht op het oppervlak. Net als bij contact-modus AFM, topografie is analeyzed getrokken waarbij de beweging van de z-piëzo als functie van xy (afstand).
De cantilever dynamiek kan heel instabiel zijn op of in de buurt van resonantie; daarom zijn ze zeer uitdagend om buiten een "steady-state" situatie automatiseren. Specifiek deze dynamiek afhankelijk zowel het monster eigenschappen en scanomgeving. Voor een zachte molecuul geadsorbeerd aan een vaste (re) oppervlak kan een goed afgestelde terugkoppellus voor het molecuul leiden tot feedback oscillatie van het oppervlak. Operatie in vloeistof verder compliceert de tuning van de cantilever. Veranderingen in temperatuur of vocht niveaus vereisen constante aanpassing van setpunt, winsten, en andere imaging parameters. Deze aanpassingen hebben de neiging om zeer tijdrovend en uitdagend voor de gebruikers zijn.
Peak Force Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM), zoals mode AFM tikken, voorkomt laterale interacties door intermitterend contact van het monster (figuur 2). 12-15 </ Sup> Echter, PF-QNM actief in niet-resonante mode en frequenties veel lager dan tikken-modus AFM. Dit elimineert de stemming uitdagingen tappen-mode AFM, met name verergerd door de aanwezigheid van vocht. Met PF-QNM, worden de beelden verzameld door het nemen van een kracht responscurve op elk punt van contact. Met de toevoeging van ScanAsyst software, kan 15 aanpassing van de scan parameters worden geautomatiseerd en de afbeelding met een hoge resolutie in een kwestie van minuten, verkregen door zelfs onervaren gebruikers. Zodra de gebruiker wordt meer vertrouwd met de AFM, kan elke of alle geautomatiseerde parameters geactiveerd op elk tijdstip waarop de experimentator de beeldkwaliteit handmatig maakt fijnafstelling. Sinds haar ontstaan heeft de PF-QNM toegepast op bacteriorhodopsin, een membraaneiwit, en andere inheemse eiwitten in kaart op het submoleculaire niveau. 16-18 Voor bacteriorhodopsin, is er een direct verband tussen eiwit flexibiliteit en röntgenkristallografische structuren. 12 PF -QNM is gebruikt om levende cellen met hoge resolutie onderzocht. 19,20 Verder is PF-QNM data toegelicht belangrijke verbanden tussen structuur en mechanica binnen de erytrocyt membraan die essentieel zijn voor cel integriteit en functie. 21
We hebben scanning probe microscopie (SPM) methoden, 22 waaronder AFM, 23 de structuur van rood licht fotoreceptoren genoemd bacteriophytochromes (BphPs) bestuderen. 24,25 Ze bestaan uit een lichtgevoelige module covalent gebonden aan een signaal-effector module dergelijke histidine kinase (HK). 26 Het licht-sensing module bevat typisch een bilin chromofoor welke structurele verandering ondergaat bij absorptie van een foton met een reeks structurele veranderingen bereiken van de signalering effector-module en leidt tot een algemene verandering van het gehele eiwit . 24,27-29 basis van deze transformatie, zijn er twee verschillende lichtabsorberende sTates van BphPs, een rood en ver-rood licht absorberen staat, aangeduid als Pr en Pfr. Pr thermisch stabiel, donker aangepaste toestand voor de meeste BphPs. 28 De moleculaire basis van Pr / Pfr photoconversion niet volledig begrepen vanwege de beperkte kennis van deze structurele eiwitten. Met uitzondering van een structuur van D. radiodurans, 30 alle gepubliceerde röntgenkristallografische structuren van deze eiwitten zijn in het donker aangepaste toestand en missen effector domein. Het intacte BphPs zijn te groot om effectief bestudeerd door Nuclear Magnetic Resonance (NMR) en zijn notoir moeilijk te kristalliseren in de intacte vorm (met name in het licht aangepaste state) voor röntgenkristallografie. BphPs zijn onlangs ontworpen als infrarood fluorescerend eiwit markers (IFP). 31 Structurele karakterisering van deze eiwitten kan helpen bij het effectief IFP ontwerp verder. 32-36
De focus van dit artikel is om een procedure in te dienen voorbeeldvorming van BphPs gebruik van vloeibare-cel AFM via PF-QNM. De methode wordt aangetoond door studies van het licht aangepaste toestand van de bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) van de fotosynthetische bacterie R. palustris. De AFM procedure hier gepresenteerde gemakkelijk en ongecompliceerd benadering voor beeldvorming van eiwitten en andere biologische macromoleculen. Met deze methode kan structurele details van afzonderlijke moleculen te halen in een korte periode van tijd, vergelijkbaar met een hoger niveau science cursus laboratoriumsessie. Door het meten van doorsneden en het invullen van verdere dimensionale analyses, kunnen experimentele gegevens worden vergeleken met bruikbare rekenmodellen. 37-42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Computer en Microscoop Set Up
- Open het ventiel van de cilinder N2 en knoppen aangepast om de lucht tabel zweeft en niveau.
- Zet de computer, controller en glasvezel licht in deze volgorde.
- Zet de scanner aan AFM / LFM modus en centreren de camera over de AFM hoofd.
- Open software. Selecteer experiment categorie "Nanomechanical Eigenschappen", "Kwantitatieve Nanomechanical Mapping" onder experiment-groep, en "PeakForce QNM in Fluid" onder experiment. Klik op Laden Experiment en vervolgens Setup.
- Richt de camera met behulp van de Z-doelstelling om het oppervlak van het podium te zien. De grove omhoog / omlaag bewegen piëzo het stadium ongeveer 1 mm onder het oppervlak van de AFM hoofd diafragma.
2 Voorbereiding van Mica Surface
- Druk op een sticker op het oppervlak van een schone monster steunschijf (15 mm diameter, 0,8 mm dik). Duw een mica V-4leerjaar schijf (25 x 25 x 26 mm) op de lijm tot stevig bevestigd.
- Wrijf een stukje doorzichtige tape op de mica zodanige wijze moet worden volledig verkleefd zonder luchtbellen. Trek het plakband van de mica van de ene kant naar gelijkmatig klieven het. Herhaal dit indien nodig verzekeren het mica vlak.
- Pak de steunschijf, clean mica naar boven met een paar cirkelvormige pincetten (disk grijpers) en plaats op de scanner. De mica dient onder het niveau van de AFM hoofd diafragma.
3 Fluid Cell Vergadering en beeldvorming van Mica Surface
- Spoel de vloeistof cel, O-ring, spuit-adapter, slang-adapter, en het uitwerpen van de slang in 100% ethanol. Spoel de vloeistof cel in DI water. Laat alle delen volledig drogen.
- Duw de slang aan op de poort aan de schone vloeistof cel. Druk zachtjes op de O-ring in het midden insprong van de vloeistof cel met behulp van platte geleid pincet.
- Druk op de veer lichtjes op de sonde houder clip en zet het weg van de groove voor de tip.
- Pak de sonde op het lange eind uit de buurt van de tip met platte hoofd pincet. Plaats de sonde in de groef met de punt naar het midden van de cel. Duw de veer in en stel de houder clip over de sonde naar het (Figuur 1B) veilig te stellen.
- Controleer de klem op de AFM om ervoor te zorgen dat deze volledig is ingeschoven (figuur 1C).
- Plaats het fluïdum cel, O-ring en sonde naar beneden gericht bovenop het mica monster. Laat de vloeistof cel om te rusten op de bevestigingen van de AFM. Laat de klem om de vloeistof cel op het podium stabiliseren. Druk op de schakelaar van de microscoop tot een visuele inspectie toont de O-ring stevig samengedrukt tussen de steun schijf en de vloeistof cel.
- Tijdens het kijken naar de monitor, concentreren de grove instelknop naar de top van de vloeistof cel op het scherm te visualiseren.
- Beweeg de microscoop totdat er een duidelijk beeld van de spuitkop en de X / Y instelknoppen en Z doelstelling. De tip zal appoor als een metaal, gouden driehoek. Beweeg de punt dichter bij het monster oppervlak met behulp van de piëzo-hendel op de microscoop. Focus op de reflectie van de tip. Blijf op de hoogte van de werkelijke cantilever in relatie met haar reflectie. In dit stadium moeten zij nauw aansluiten, maar niet volledig overlappen.
- Bevestig de spuit aan op een steriele 1 ml spuit. Bevestig een uiteinde van de slang uitwerpen de injectiespuit adapter en plaats het andere uiteinde van de slang in de houder bufferoplossing. Strek de zuiger van de spuit.
- Sluit de slang aan op de slang-adapter op de vloeistof cel. Druk zachtjes op de zuiger totdat de vloeistof de middelste kamer volledig vult. Controleer de cel om te verzekeren dat er geen luchtbellen. Controleer om te zien is er geen vloeistof morsen uit de vloeistof cel op de microscoop. Plaats de spuit op een verhoogd vaste drager.
- Gebruik de camera-feed en de X / Y-vertaling knoppen om de laser op het scherm (een diffuse rode stip) te lokaliseren. De laser movement bedieningsknoppen, verplaatst u de laser op de punt.
- Fijn de laser en spiegel controles aan te passen totdat de som signaal weergegeven op de microscoop wordt gemaximaliseerd (waarde = 4 - 6).
- Pas de hoek van het kwadrant diode met behulp van de knoppen aan de linker achterzijde en de linker bovenkant van de scan hoofd naar de verticale en horizontale vervormingen weergegeven op de microscoop zo dicht mogelijk bij nul (± 0.1) te verlagen.
- In de software, selecteert overname opties. Op een minimum, kies hoogte (trace en terugslag), piek kracht fout, en vervorming. De overige opties zijn afhankelijk van de gebruiker en kan worden afgestemd op basis van de specifieke informatie gewenst door de experimentator.
- Selecteer "lijn" voor RT Plane Fit in elke overname venster. Selecteer "geen" voor de OT Plane Fit in de hoogte met Windows. Stel de X-en Y-offset en scanhoek tot nul, indien dit niet reeds gedaan.
- Stel de scansnelheid tot 1 Hz, het monster per lijn 256, de ScanAsyst autocontroleindividuele en de ScanAsyst auto Z limiet af. Wijzig de Z grens tot 500 nm. Ingesteld scanformaat tot 1 micrometer.
- Klik betrekken. Op dit punt, de punt nadert het oppervlak. Terwijl de punt nadert, observeren Z piëzo spanning verandering in de linker bovenhoek van het scherm. Als het puntje gaat buiten het bereik, trekt de tip en de nieuwe benadering. Als dit mislukt, moet de punt om een succesvolle benadering moeten worden veranderd. Zodra de punt is geactiveerd, wordt de lijnen beginnen te verschijnen op elk van de overname ramen die een beeld zal componeren.
- Tijdelijk afbeeldingen mica 1 x 1 urn en opnieuw langzaam zodat de mica oppervlak schoon en vlak. Klik continu foto om beelden op te slaan als ze lijken. Zoom in en bewegen rond de oppervlakte zoals gewenst.
4 Eiwit Afzetting en Voorbereiding van de Steekproef voor Imaging
- Verkrijgen gezuiverde eiwit monster 38 en blijf op ijs. Indien opgeslagen in een vriezer, ontdooien monster opijs gedurende 5 minuten.
- Verdun het eiwit tot 0,0010 mg / ml met koelwagens imaging bufferoplossing. De imaging buffer hier gebruikt is 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl en 15 mM MgCl2.
- Vul een 4 kamer (100 x 15 mm) petrischaal met gekoelde beeldvorming bufferoplossing. Vul elke kamer met ten minste 5 ml oplossing. Meng de verdunde eiwit-oplossing met de punt bevestigd aan micropipettor.
- Breng 200 pi van de verdunde proteïneoplossing bij het oppervlak van mica al voorbereid. Na 30 sec is, pak je de eiwit / mica oppervlak met de cirkelvormige pincet (schijf grijpers). Houd het monster evenwijdig aan de laboratoriumtafel.
- Houd het monster, onmiddellijk het monster in de buffer oplossing in het eerste kwadrant van de petrischaal (stap 4.2) onder te dompelen, terwijl ervoor te zorgen dat het monster parallel aan het stroomgebied van de petrischaal is. Na 1 sec, verwijder het monster.
- Doorgaan met het monster parallel te houden aan het bekkenvan de petrischaal, herhaal stap 4.5 voor de overige drie kwadranten.
- Plaats de schijf op een droge stofvrije doek om te genieten van overtollig vocht en breng de schijf op het podium van de microscoop. Laat het werkelijke oppervlak niet aan met de doek. Sta niet toe dat het monster te drogen.
- Herhaal de stappen 3,6-3,16.
5 Imaging Eiwitten op Mica
- Klik op de check parameters vak aan de linkerkant van het scherm. Spring shape and topradius worden vastgesteld gebaseerd op de punt wordt gebruikt.
- Klik betrekken. Net als bij de mica imaging proces (stap 3.17), acht de z-piëzo-venster als het topje benaderingen.
- Laat de scanner op de foto hetzelfde gebied gedurende ten minste twee opeenvolgende passes. Klik continu foto om elk beeld verzameld redden.
- Verplaats de scanner naar een nieuwe regio en / of wijzigen van het beeldformaat naar wens.
- Nadat de automatische software klaar aanpassing van descannen parameters voor een bepaald beeldformaat, zet de software af.
- Handmatig aanpassen scansnelheid, z limiet, het aantal lijnen, en de spanning om te fine-tunen van de focus van het beeld. Als het beeld te ver uit de focus, zet de software terug naar de oorspronkelijke uitgangspositie terugkeren. Om de resolutie van een afbeelding tijdens het zoomen in op een eiwit te verhogen, verlagen de scansnelheid en verhoging van het aantal lijnen proportioneel.
- Na het experiment reinigen vloeistof-cel met 100% ethanol en spoelen met DI H2O Laat de vloeistof cel volledig droog.
- Open de data software om ruwe data beelden te verwerken. Eerst, plat de afbeelding door te klikken op het pictogram flatten. Selecteer Zero ste bestelling en klik op uitvoeren. Afhankelijk van de afbeelding kan een vlak fit nodig een passende platte beeld te verkrijgen. In dit geval selecteert u het vliegtuig fit pictogram en een vlak te tekenen van een vlak gedeelte van het beeld met behulp van de cursor. Klik op uitvoeren. Herhaal dit zo nodig
- Select de tab doorsnede aan de afmetingen van het eiwit te meten. Teken een lijn met de cursor het over het molecuul of gebied te analyseren. Herhaal dit voor meerdere gebieden en de software zal een overlay te genereren. Het beeld of de gegevens die worden gebruikt om foto in een formaat dat compatibel is met andere software en tekenprogramma's genereren exporteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve AFM afbeeldingen van een fotoreceptor eiwitten, P3, in het licht aangepaste toestand zijn weergegeven in figuren 3 en 4. Een vers-gekloofd mica substraat (Figuur 3A) is een geschikte, vlakke ondergrond voor eiwitadsorptie. Verzamelen een afbeelding van schone mica als negatieve controle is belangrijk om verschillende redenen. Ten eerste, het verzekert de vloeistof cel is schoon en geen restmateriaal uit eerdere experimenten zal het oppervlak verontreinigen. Ten tweede test de kwaliteit van de probe. Als de sonde is vuil of vervormd, zal deze verschijnen in het beeld als strepen of zich te presenteren als ruis. Tenslotte beeld een schone mica bevestigt de probe op geschikte wijze worden afgesteld op toekomstige experimenten.
Single fotoreceptor eiwitten dimeren kunnen worden waargenomen met behulp PeakForce QNM als de oppervlaktebedekking geschikt (figuur 3B, C). Pijlen signaleren individuele dimeren; het sterretje staat voor een proteïneaggregaat. Hetconcentratie van het eiwit monster depositietijd en de ionsterkte van het beeldvormende buffer beïnvloeden de oppervlaktebedekking. 23 Voor een grotere verdeling van afzonderlijke moleculen, zeer verdunde oplossingen met korte depositie tijd nodig. Bijvoorbeeld, een verdubbeling van de afzettingstijd levert een hoge verdeling van nog grotere aggregaten. Als de eiwitconcentratie wordt verhoogd tot 0,100 mg / ml, een dunne film van fotoreceptoren waargenomen zonder dat de afzettingstijd of buffer ionsterkte.
Met beeldanalyse software, kan de dwarsdoorsneden van de eiwitten worden gemeten nadat het beeld is afgeplat (figuur 4). De cross-secties bieden xy-gegevens met bijbehorende hoogtemetingen. Deze metingen kunnen worden gebruikt om structurele details, eiwit / oppervlak-interacties, mechanische sterkte, etc. De xy-gegevens worden geconvolueerd door de AFM probe verschaffen; echter, kan dit effect worden geminimaliseerd door een scherpere sonde. In feite, de choijs probe bestaat een balans tussen een acceptabele hoeveelheid van convolutie en de weerstand van de afgebeelde om schade door een scherpe sonde. Tip convolutie kan worden afgetrokken van het beeld, eventueel met geschikte software.
Deze foto's kunnen direct worden vergeleken met eerder gepubliceerde foto's verzameld worden middels tikken-modus AFM. 20 De gemeten afmetingen van P3 op mica met PeakForce QNM zijn binnen 5% van de waarden verkregen met tikken-modus AFM.
Figuur 1 Liquid-Cell Atomic Force Microscopy. (A) Laser, cantilever, sonde en oppervlak uitlijning. De sonde en de cantilever worden aan de binnenkant van de vloeistof cel. (B) Vloeibare cel. De sonde, cantilever, en monster worden volledig ondergedompeld in de vloeistof. (C) Complete montage. De vloeistof cel wordt een micrometer bevestigd. De foto toont de optische kop en scanner in relatie tot de vloeistof cel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. PeakForce Kwantitatieve Nanomechanical Property Mapping Dit is een illustratie van een kleine piek kracht (A) Approach (B) Ga naar contact (C) Peak Force (D) Hechting (E) in te trekken.. De figuur is overgenomen en aangepast met toestemming. 15
Figuur 3 Atomic Force Microscopy van P3 op Mica. (A) Afbeelding van schone mica (1 x 1 micrometer). (B) Afbeelding (1 micrometer x 1 micrometer) van P3 toegepast op mica. De pijlen geven voorbeelden van enkel eiwit dimeren. De asterisk geeft een totaal eiwit dimeren. (C) beeld (170 x 170 nm) van twee eiwitten dimeren met een driedimensionale bijvoegsel van een dimeer. Het dakje duidt welk eiwit dimeer aanwezig is in de inzet is. Alle foto's zijn genomen in het bijzijn van de beeldvorming buffer (eiwitconcentratie = 0,0010 mg / ml voor depositie). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Cross-sectie analyse van P3 op Mica. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM is een scanning probe microscopie methode volledig in staat de beeldvorming van eiwitten en andere biologische macromoleculen in fysiologisch relevante omstandigheden. In vergelijking met röntgenkristallografie en NMR, een beperking van AFM is het onvermogen om dezelfde resolutie, met name laterale resolutie. Bij gebruik van AFM een molecuul op elk oppervlak analyseren moet de invloed van het oppervlak en de sonde op het beeld van het molecuul worden overwogen wanneer de gegevens worden geanalyseerd. Deconvolueren van de impact van de sonde op de verworven afbeelding kan worden aangevuld met de juiste software. Ontwikkeling van theoretische modellen om te vergelijken experimentele resultaat kan ook de zeer nuttig.
In deze paper, AFM beelden van een bacteriële rosse photoreceptor, RpBphP3 (P3), worden gepresenteerd (figuur 3). Hoewel de beschrijvingen van de microscoop montage en de werking van de software zijn specifiek voor het specifieke instrument gehanteerde model, de micaen eiwit monstervoorbereidingsprocedures zijn algemeen en kan worden toegepast op elke AFM experiment.
Enkele kritische stappen van dit protocol worden gevolgd om het gewenste eiwit dekking op het mica oppervlak te verkrijgen. Ten eerste moet de verdunde proteïneoplossing voorzichtig gemengd voordat het wordt toegepast op het mica oppervlak (stap 4.3). Vanwege het hoge molecuulgewicht van P3, het deponeren oplossing vrij colloïdaal; derhalve P3 regelt de bodem van de buis over tijd waardoor de oplossing niet homogeen. Een zachte roer remedies deze kwestie. Ten tweede, wanneer het eiwit wordt toegepast, moet het oppervlak afgespoeld om eventuele losjes gebonden moleculen (stap 4,5-4,6) verwijderen. Als zwak gebonden P3 blijft op het oppervlak, zal de moleculen worden vrijgegeven in de oplossing wanneer de vloeistof giet men bufferoplossing en / of opgehaald door de AFM sonde tijdens het experiment. Beide gebeurtenissen belemmeren een succesvolle beeldvorming experiment. Alsde vloeistof-cel verontreinigd met P3 moet worden gedemonteerd en grondig worden gereinigd. Als de AFM probe pakt een molecule, dient kenmerkend worden vervangen of beeldkwaliteit opgeofferd. Tenslotte, de wijze van spoelen het eiwit monster kritisch voor het verkrijgen van uitstekende afbeeldingen. Mica is een niet-selectieve oppervlak P3; daarom moet de moleculen vindt willekeurig georiënteerd. Werkwijze volgens afspoelen beschreven in het protocol is een manier om te voorkomen dat het herschikken van de moleculen op het oppervlak in een enkele richting. De sleutel is om altijd het monster nat en houd de oppervlak hoek en letterlijk het besproeien oppervlak met buffer. Als het monster wordt gespoeld door dompelen, terwijl het parallel aan het bekken van een petrischaal, wordt de vervorming van P3 op het oppervlak met geweld stromingen van de bufferoplossing geminimaliseerd.
Alle onderdelen aan de vloeistof cel, sonde, scanner, en optische kop zijn zeer delicaat en moet met zorg worden behandeld. De springs dat de scanner en de optische kop bij elkaar te houden zijn zeer sterk. Het is noodzakelijk om een hand te houden op de scanner bij het monteren of demonteren van een van de stukken. Voor PF-QNM met ScanAsyst software, zoals beschreven in het protocol, is het essentieel de geautomatiseerde softwarebesturing van de Z-grens uit te schakelen en deze waarde ten minste 500 nm als de oorspronkelijke scan grootte 1 urn (stap 3.16) . Dit beschermt de scanner als het oppervlak ruw onverwacht is geworden of worden verontreinigd. Zodra een enkel beeld is verzameld en wordt bevestigd dat het belichte gebied glad is, kan de Z-limiet naar beneden handmatig worden aangepast aan hogere resolutie beelden te verkrijgen. Het is cruciaal om de Z-grens back passen aan ten minste 500 nm wanneer de scanner wordt verplaatst naar een nieuw gebied van het oppervlak of bij ingetrokken punt om welke reden.
Hoewel dit document is gericht op het gebruik PF-QNM hoogwaardige topografische beelden te verkrijgen, kan de werkwijze zelf een verschaffenbibliotheek van aanvullende informatie over de mechanische sterkte en flexibiliteit van oppervlaktestructuren. Deze functie kan leiden tot verdere inzichten over de functies door eenvoudig het juiste kanalen tijdens het experiment. 16,18 Met de juiste veranderingen in de concentratie van het storten oplossing en / of het oppervlak, kan deze methode algemeen gebruikt voor PF-QNM onderzoeken biologische macromoleculen door vloeistof-cell AFM. Met de geautomatiseerde behulp van software, kunnen studenten in het hoger-level wetenschap cursussen met geen ervaring met AFM een vloeistof-cel AFM experiment veel sneller te voltooien dan met de traditionele tikken-modus AFM. Studenten kunnen de basisprincipes van de AFM te ervaren en krijgen een voorproefje van het interdisciplinair onderzoek mogelijk gemaakt door deze krachtige techniek in een typisch 3-4 uur laboratorium sectie tijdsdruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Het NSF-MRI-programma (CHE: 1229103) is erkend voor de financiering van de aankoop van nieuwe controle-elektronica, software, vloeibare cellen, en andere apparatuur die nodig is om een dual AFM / STM monteren. Wij erkennen de gedeelde faciliteiten aan de Universiteit van Chicago NSF-MRSEC programma (DMR-0820054) voor hulp bij het AFM instrumentatie, opleiding en beeldvorming, en voor het instrument tijd ter beschikking gesteld door het Materials Research Facilities Network (DMR-0820054). Wij danken in het bijzonder Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller, en prof Ka Yee Lee voor het verwelkomen van onze studenten voor de financiering van de NSF-MRI-voorstel dat de nodige instrumenten naar onze campus. Wij erkennen de financiering van een titel III STEM-subsidie (ID: P031C110157) toegekend aan Northeastern Illinois University die zomer onderzoek stipendia voor studenten en docenten, alsmede ondersteuning voor verbruiksartikelen. Tot slot, we erkennen Bruker-Nano, Inc voor voortgezet instrumentele steun en toestemming om reproduce een grafiek die het mechanisme van PeakForce QNM en het woord ScanAsyst om het automatische software beschrijven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
