Abstract
Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet eine Pyramidenspitze auf einem Ausleger angebracht ist, um die Kraftantwort der Oberfläche zu untersuchen. Die Auslenkungen der Spitze kann durch einen Laser und Detektor in Sektoren, die Topographiebild umgerechnet werden können gemessen werden, um ~ 10 pN. Amplitudenmodulation oder "Tapping Mode" AFM umfasst die Sonde so intermittierenden Kontakt mit der Oberfläche beim Oszillieren bei seiner Resonanzfrequenz, um ein Bild zu erzeugen. In Verbindung mit einer Fluidzelle verwendet, Tapping-Mode-AFM ermöglicht die Abbildung von biologischen Makromolekülen, wie Proteinen in physiologisch relevanten Bedingungen. Tapping-Mode AFM erfordert manuelle Abstimmung der Sonde und häufige Anpassungen aus einer Vielzahl von Scan-Parameter, die schwierig sein kann für unerfahrene Anwender. Um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, sind diese Anpassungen die meiste Zeit.
Peakforce Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM) erzeugt ein Bild durch die Messung einer Kraft Verantse Kurve für jeden Berührungspunkt mit der Probe. Mit ScanAsyst Software können PF-QNM automatisiert werden. Diese Software passt den Sollwert, Antriebsfrequenz, Abtastrate, Gewinne und andere wichtige Scan-Parameter automatisch für eine bestimmte Probe. Nicht nur, dass dieses Verfahren zum Schutz sowohl zerbrechlich Sonden und Proben, es reduziert die erforderliche Zeit, um Bilder mit hoher Auflösung zu erhalten. PF-QNM ist für AFM in Flüssigkeit kompatibel; Daher war es umfangreiche Anwendung zur Abbildung biologisch relevanten Materialien.
Die in diesem Papier vorgestellte Methode beschreibt die Anwendung von PF-QNM, um Bilder von einer bakteriellen Rotlicht-Photorezeptor, RpBphP3 (P3) zu erhalten, aus photo R. palustris in seinem Licht-adaptierten Zustand. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden einzelne Protein Dimere von P3 und Aggregate von Dimeren auf einer Glimmer-Oberfläche in Gegenwart eines bildgebenden Puffer beobachtet. Mit entsprechenden Anpassungen an die Oberfläche und / oder der Konzentration der Lösung, wobei dieses Verfahrenkann allgemein auch für andere biologisch relevante Makromoleküle und weichen Materialien angewendet werden.
Introduction
Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist ein sehr wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der strukturellen und mechanischen Eigenschaften von Oberflächen, dünne Filme und Einzelmoleküle seit seiner Erfindung im Jahr 1986 (Abbildung 1). 1-3 Verwendung einer flüssigkeits Zelle hat das Verfahren werden in einem physiologisch relevanten Umwelt besonders nützlich in Studien von biologischen Makromolekülen und sogar lebende Zellen. 4-10 Tapping-Mode-AFM ist traditionell für die Abbildung von weichen Materialien oder locker gebundenen Moleküle an die Oberfläche, da der Kontakt-Modus AFM verwendet worden ist in der Regel nicht geeignet aufgrund auf die Schäden, die durch die seitlichen Kräfte verursacht auf die Probe ausgeübt durch den Freischwinger. Tapping-Modus 11 AFM wesentlich reduziert diese Kräfte, indem er die Spitze weise die Oberfläche berühren und nicht in ständigem Kontakt. In diesem Modus wird der Ausleger an oder nahe seiner Resonanzfrequenz normal zu der Oberfläche in Schwingungen versetzt. Ähnlich wie bei Kontaktmodus AFM ist Topographie analdurch Auftragen der Bewegung der Z-Piezo als eine Funktion der xy-(Abstand) yzed.
Die Ausleger Dynamik bei oder nahe der Resonanz sehr instabil; daher sind sie sehr schwierig, außerhalb eines "steady-state" Situation zu automatisieren. Genauer gesagt, diese Dynamik hängen sowohl von der Probeneigenschaften und Scan-Umgebung. Für eine weiche Molekül auf eine Fest (er) Oberfläche adsorbiert, kann eine gut abgestimmte Rückkopplungsschleife für das Molekül zu Rückkopplungsschwingung für die Oberfläche führen. Betrieb in Fluid erschwert die Abstimmung des Auslegers. Änderungen der Temperatur oder Flüssigkeitsstände erfordern ständige Nachjustierung der Sollwert, Gewinne und andere Bildparameter. Diese Anpassungen sind in der Regel sehr zeitaufwendig und anspruchsvoll für die Nutzer.
Spitzenkraft Quantitative Nano Property Mapping (PF-QNM), wie Tapping Mode AFM, vermeidet lateralen Wechselwirkungen von intermittierend Kontaktieren der Probe (Abbildung 2). 12-15 </ Sup>, arbeitet jedoch PF-QNM in nicht-resonanten Modus und Frequenzen viel niedriger als Tapping-Mode-AFM. Dadurch entfällt die Abstimmung Herausforderungen Tapping-Mode-AFM, insbesondere durch das Vorhandensein der Flüssigkeit verstärkt. Mit PF-QNM werden Bilder, indem sie eine Kraft-Antwort-Kurve an jedem Kontaktpunkt gesammelt. Mit dem Zusatz von ScanAsyst Software können 15 Einstellung der Scan-Parameter automatisiert werden und ein hochauflösendes Bild in einer Angelegenheit von Minuten mit dem auch unerfahrene Benutzer erhalten. Sobald der Benutzer mehr mit dem AFM wird, können einige oder alle der automatisierten Parameter zu jeder Zeit, die die Bildqualität der Experimentator manuell ermöglicht die Feineinstellung deaktiviert. Seit seiner Gründung PF-QNM wurde angewandt, um Bakteriorhodopsin, ein Membranprotein und andere native Proteine auf der submolekularen Ebene abzubilden. 16-18 Für Bakteriorhodopsin, gibt es eine direkte Korrelation zwischen Proteinflexibilität und Röntgenkristallstrukturen. PF 12 -QNM ist verwendet worden, lebende Zellen mit einer hohen Auflösung zu untersuchen. 19,20 Darüber hinaus hat PF-QNM Daten aufgeklärt wichtige Verbindungen zwischen Struktur und Mechanik in der Erythrozytenmembran, die für die Zellintegrität und Funktion sind. 21.
Wir haben Rastersondenmikroskopie (SPM) Verfahren eingesetzt, darunter 22 AFM, 23, um die Struktur der Rotlicht-Photorezeptoren genannt Bakteriophytochrome (BphPs) zu studieren. 24,25 Sie bestehen aus einer Lichtsensormodul kovalent an eine Signal-Effektor-Modul verlinkten Histidin-Kinase (HK). 26 Die Lichterfassungsmodul enthält typischerweise einen Bilin-Chromophor, der bei der Absorption eines Photons strukturelle Umwandlung erfährt, mit einer Reihe von strukturellen Veränderungen Erreichen der Signal-Effektor-Modul und die zu einer globalen Transformation des gesamten Proteins . 24,27-29 Basierend auf dieser Transformation gibt es zwei unterschiedliche Lichtabsorptions sTates von BphPs, einem roten und dunkelrotem Licht absorbierenden Zustand, als Pr und Pfr bezeichnet. Pr ist thermisch stabil, dunkeladaptierten Zustand für die meisten BphPs. 28. Die molekularen Grundlagen der Pr / Pfr-Photo nicht vollständig aufgrund der begrenzten Strukturwissen dieser Proteine zu verstehen. Mit Ausnahme einer Struktur von D. durans, sind 30 alle veröffentlichten Röntgenkristallstrukturen dieser Proteine in der dunkeladaptierten Zustand und Effektor-Domäne fehlt. Die intakten BphPs sind zu groß, um wirksam durch Kernspinresonanz (NMR) untersucht werden und sind notorisch schwierig in ihrer intakten Form kristallisieren (insbesondere in der Licht adaptierten Zustand) für Röntgen-Kristallographie. BphPs wurden vor kurzem als Infrarot-Fluoreszenzproteinmarker entwickelt worden (IFP). 31. Strukturelle Charakterisierung dieser Proteine kann Hilfe in effektive IFP Design zu fördern. 32-36
Der Schwerpunkt dieses Artikels ist es, ein Verfahren für präsentierenAbbildung BphPs mit Flüssig-Zelle über AFM PF-QNM. Das Verfahren wird durch Untersuchungen der licht adaptierten Zustand des Bakteriophytochrom RpBphP3 (P3) aus dem Photosynthesebakterium R. nachgewiesen palustris. Das hier vorgestellte Verfahren AFM ist bequem und einfacher Ansatz zur Darstellung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen. Mit diesem Verfahren können strukturelle Einzelheiten der einzelnen Moleküle in einem kurzen Zeitraum, ähnlich einer oberen Ebene Wissenschaft natürlich Laborsitzung gesammelt werden. Über Messquerschnitte und Erfüllen weiteren eindimensionalen Analysen können experimentelle Daten, um nützliche Rechenmodelle verglichen werden. 37-42
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Protocol
1. Computer und Mikroskop Set Up
- Öffnen Sie das Ventil der N 2-Zylinder, und stellen Sie die Regler, um sicherzustellen, dass die Lufttisch schwimmt und Niveau.
- Schalten Sie den Computer, Controller und Faseroptik-Licht in dieser Reihenfolge.
- Stellen Sie den Scanner an AFM / LFM-Modus und in der Mitte der Kamera über der AFM Kopf.
- Offene Software. Wählen Experiment Kategorie "Nanomechanische Eigenschaften", "Quantitative Nano Mapping" unter Experiment-Gruppe und "Peakforce QNM in Fluid" unter Experiment. Klicken Sie auf Laden Experiment und dann einrichten.
- Fokussieren Sie die Kamera mit dem Ziel, den Z Oberfläche der Bühne zu sehen. Verwendung des groben oben / unten bewegen Piezos die Bühne etwa 1 mm unter der Oberfläche des AFM Kopföffnung.
2. Herstellung von Glimmer-Oberfläche
- Drücken eines Aufklebers auf das Gesicht eines sauberen Probenträgerplatte (15 mm Durchmesser, 0,8 mm dick). Schieben Sie einen Glimmer V-4Grade Platte (25 x 25 x 26 mm) auf die Klebe bis fest angeschlossen ist.
- Reiben ein Stück Tesafilm auf das Glimmer gewährleisten sie vollständig ohne Luftblasen eingehalten werden. Ziehen Sie das Band vor der Glimmer von einer Seite zur gleichmäßig spalten. Bei Bedarf wiederholen, um sicherzustellen, der Glimmer ist flach.
- Fassen Sie die Stützscheibe, sauber Glimmer Seite nach oben, mit einem Paar von Kreis Pinzette (Plattengreifer) und legen Sie den Scanner ein. Der Glimmer sollte unter dem Niveau des AFM Kopföffnung sein.
3. Flüssigkeitszelle Versammlung und Imaging von Glimmeroberfläche
- Spülen der Fluidzelle, O-Ring, Spritzenadapter, Schlauch-Adapter, und die Ausstoßschlauch in 100% Ethanol. Spülen Sie die Flüssigkeitszelle in DI-Wasser. Lassen Sie alle Teile Luft vollständig trocknen.
- Schieben Sie den Schlauchadapter in den Anschluss auf der sauberen Flüssigkeitszelle. O-Ring drücken Sie vorsichtig in die Mitte der Vertiefung Fluidzelle mit Flachkopf Pinzette.
- Drücken Sie die Feder leicht auf die Sonde Halteclip und drehen Sie es weg von der Groove für den Tipp.
- Fassen Sie die Sonde am langen Ende von der Spitze mit Flachkopf Pinzette. Die Sonde in die Nut mit der Spitze zur Mitte der Zelle. Schieben Sie den Frühling in und stellen Sie die Halteklammer über die Sonde, um sie (Abbildung 1B) zu sichern.
- Überprüfen Sie die Klemme an der AFM, um sicherzustellen, es ist vollständig eingefahren (Abbildung 1c).
- Legen Sie die Flüssigkeitszelle, O-Ring und die Sonde nach unten, oben auf dem Glimmer Probe. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle, um auf die Bolzen des AFM Ruhe. Senken Sie die Klammer zur Stabilisierung der Zellflüssigkeit auf der Bühne. Drücken Sie die Down-Schalter auf dem Mikroskop, bis eine visuelle Inspektion zeigt die O-Ring fest zwischen der Trägerscheibe und der Fluidzelle zusammengedrückt.
- Während Sie den Monitor, konzentrieren sich die Grobtrieb, um die Spitze der Fluidzelle auf dem Bildschirm sichtbar zu machen.
- Bewegen Sie den Mikroskop, bis es ein klares Bild von der Spitze über die X / Y-Stellknöpfe und die Z-Ziel. Die Spitze wird AppOhr wie eine metallische, goldene Dreieck. Bewegen der Spitze näher an die Probenoberfläche unter Verwendung der unten piezoHebel am Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf die Reflexion der Spitze. Verfolgen Sie die aktuellen Freischwinger in Beziehung zu seinen Überlegungen. In diesem Stadium sollten sie aneinander ausgerichtet werden, jedoch nicht vollständig überlappen.
- Befestigen Sie den Spritzenadapter in eine sterile 1 ml Spritze. Ein Ende des Ausstoßschlauch mit dem Spritzenadapter und das andere Ende des Schlauchs in den Behälter der Pufferlösung. Ziehen Sie die Kolben der Spritze.
- Befestigen Sie den Schlauch an den Schlauchadapter an der Fluidzelle. Drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit die mittlere Kammer vollständig ausfüllt. Prüfen Sie die Zelle, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen. Überprüfen, um zu sehen, gibt es keine Flüssigkeit auslaufen aus der Fluidzelle auf das Mikroskop. Legen Sie die Spritze auf einem festen Träger angehoben.
- Verwenden Sie die Kamera-Feed und die X / Y-Knöpfe Übersetzung, um den Laser auf dem Bildschirm (ein diffuser roter Punkt) zu lokalisieren. Mit dem Laser movement Bedienknöpfe, bewegen Sie den Laser auf die Spitze.
- Feineinstellung der Laser und Spiegel kontrolliert, bis das Summensignal auf dem Mikroskop angezeigt wird maximiert (Wert = 4 - 6).
- Stellen Sie den Winkel des Quadranten-Diode mit den Knöpfen an der linken hinteren Seite und der linken oberen Seite der Scankopf an die vertikalen und horizontalen Auslenkungen am Mikroskop so nahe wie möglich bei Null (± 0,1) angezeigt senken.
- In der Software, wählen Akquisitionsmöglichkeiten. Auf ein Minimum, wählen Höhe (Spur und Rück), Spitzenkraft Fehler und Deformation. Die anderen Optionen sind benutzerabhängig und kann auf der Grundlage der von der Experimentator gewünschten spezifischen Informationen angepasst werden.
- Wählen Sie "Linie" für RT Flugzeug Fit in jedem Aufnahmefenster. Wählen Sie "None" für die OT Flugzeug Fit in den hohen Fenstern. Stellen Sie die X und Y-Offset und Scanwinkel auf Null, wenn nicht bereits geschehen.
- Stellen Sie die Abtastrate auf 1 Hz, der Probe pro Zeile bis 256, die ScanAsyst Selbststeuerungeinzelne, und ScanAsyst Auto Z Grenze ab. Ändere die Z Grenze bis 500 nm aufweist. Stellen Sie Scangröße bis 1 um.
- Klicken einrasten. An diesem Punkt ist die Spitze der Oberfläche nähert. Während die Spitze nähern, beobachten Z Piezo Spannungsänderung in der unteren linken Ecke des Bildschirms. Wenn die Spitze außerhalb des Bereichs liegt, ziehen Sie die Spitze und Re-Ansatz. Wenn dies nicht erfolgreich ist, muss die Spitze, um einen erfolgreichen Ansatz umgestellt werden. Sobald die Spitze eingeschaltet ist, werden die Linien beginnen, sich auf jede der Erwerb Fenster, die ein Bild zu komponieren erscheint.
- Nehmen Sie Bilder von Glimmer mit 1 x 1 um und vergrößern sich langsam, um zu gewährleisten, dass die Glimmeroberfläche eben und sauber ist. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme das Speichern von Bildern, wie sie erscheinen. Vergrößern und bewegen sich um die Oberfläche nach Wunsch.
4. Proteinablagerung und Herstellung der Probe für Imaging
- Erhalten gereinigtes Protein Probe 38 und auf Eis zu halten. Wenn in einem Gefrierschrank gelagert, aufgetaut Probe aufEis für 5 min.
- Verdünnen das Protein zu 0,0010 mg / ml unter Verwendung von Kühl Bildgebung Pufferlösung. Die Abbildungspuffer verwendet hier 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl und 15 mM MgCl 2.
- Füllen Sie ein 4-Kammer (100 x 15 mm) Petrischale mit Kühl Bildgebung Pufferlösung. Füllen Sie jede Kammer mit mindestens 5 ml Lösung. Vorsichtig mischen die verdünnte Proteinlösung mit der Spitze auf Mikropipette befestigt.
- Anwenden 200 ul der verdünnten Proteinlösung auf der Oberfläche von Glimmer bereits vorbereitet. Nach 30 sec, holen die Protein / Glimmer-Oberfläche mit den kreisförmigen Pinzette (Plattengreifer). Halten Sie die Probe parallel zu dem Labortisch.
- Während die Probe hält, tauchen sofort die Probe in der im ersten Quadranten der Petrischale (Schritt 4.2) enthaltenen Pufferlösung, während sichergestellt wird, dass die Probe parallel zum Becken der Petrischale ist. Nach 1 sec, entfernen Sie die Probe.
- Weiter, um die Probe parallel zum Becken haltender Petrischale, wiederholen Sie Schritt 4.5 für die restlichen drei Quadranten.
- Legen Sie die Festplatte auf einem trockenen staubfreien Tuch zu tanken überschüssige Feuchtigkeit und übertragen Sie die Festplatte auf die Bühne des Mikroskops. Die eigentliche Oberfläche nicht berühren mit dem Tuch. Erlauben nicht die Probe zu trocknen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,16.
5. Imaging Proteine auf Glimmer-
- Klicken Sie auf Prüfparameter-Box auf der linken Seite des Bildschirms. Frühling Größe und Spitzenradius sollte basierend auf der Spitze eingesetzt eingestellt werden.
- Klicken einrasten. Ähnlich wie bei der bildgebenden Verfahren Glimmer (Schritt 3.17), beobachten die z-Piezo-Fenster, wie die Spitze Ansätze.
- Lassen Sie den Scanner, um Bild die gleiche Fläche für mindestens zwei aufeinander folgenden Durchgängen. Klicken Sie auf die kontinuierliche Aufnahme, jede gesammelt Bild zu speichern.
- Bewegen Sie den Scanner an einen neuen Region und / oder ändern Sie die Bildgröße nach Wunsch.
- Nach der automatisierten Software Einstellen des fertig istScan-Parameter für eine bestimmte Bildgröße, drehen Sie die Software aus.
- Manuell einstellen Scanrate, Z-Limit, die Anzahl der Zeilen und die Spannung, um die Feineinstellung des Fokus des Bildes. Wenn das Bild wird zu weit aus dem Fokus, drehen Software zurück auf die ursprüngliche Ausgangsposition zurück. Um die Auflösung eines Bildes beim Zoomen auf einem Protein zu erhöhen, verringern Sie die Scan-Rate und erhöhen die Anzahl der Linien proportional.
- Nach dem Versuch, reinigen Sie die Flüssigkeit-Zelle mit 100% Ethanol und spülen Sie mit DI H 2 O. Lassen Sie die Flüssigkeit Zelle vollständig trocken.
- Öffnen Sie die Daten Software, um Rohdaten-Bilder verarbeiten. Erste, glätten Sie das Bild durch Klicken auf die Flatten-Symbol. Wählen Sie Null-ter Ordnung und klicken Sie auf Ausführen. Je nach Bild kann eine Ebene passen notwendig sein, eine entsprechend flache Bild zu erhalten. In diesem Fall wählen Sie die Ebene fit Symbol und ziehen Sie eine Ebene einer flachen Bereich des Bildes mit dem Cursor. Klicken Sie auf Ausführen. Bei Bedarf wiederholen
- Select die Registerkarte Querschnitt, um die Dimensionen des Proteins messen. Ziehen Sie eine Linie mit dem Cursor bewegen Sie ihn über das Molekül oder Bereich analysiert werden. Wiederholen für mehrere Bereiche und die Software wird eine Überlagerung zu erzeugen. Exportieren Sie das Bild oder die verwendet werden, um Bild in einem Format kompatibel zu anderen Software-und Zeichenprogrammen erzeugen Daten.
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Representative Results
Vertreter AFM-Bilder von einem Photorezeptor-Protein, P3, in seinem Licht-adaptierten Zustand sind in den 3 und 4 dargestellt. Ein frisch geschnittenen Glimmer-Substrat (3A) ist eine geeignete, ebene Fläche für Protein-Adsorption. Sammeln eines Bildes saubere Glimmer als Negativkontrolle ist aus mehreren Gründen wichtig. Zunächst versichert es der Flüssigkeitszelle ist sauber und keine Reststoffe aus früheren Experimenten wird die Oberfläche verunreinigen. Zweitens prüft er die Qualität der Sonde. Wenn die Sonde ist verschmutzt oder verformt, wird diese in dem Bild als Streifen erscheinen oder präsentieren sich als Lärm. Schließlich bestätigt ein Bild sauber Glimmer kann die Sonde entsprechend für zukünftige Experimente abgestimmt werden.
Einzelphotorezeptor-Protein-Dimere können mit Peakforce QNM, wenn die Flächendeckung angemessen (3B, C) ist zu beachten. Pfeile signalisieren einzelnen Dimere; Das Sternchen bezeichnet eine Proteinaggregat. DieKonzentration der Proteinprobe, die Abscheidungszeit und der Ionenstärke der Abbildungspuffer Einfluss auf die Oberflächenbedeckung. 23 Für eine hohe Verteilung von einzelnen Molekülen, sehr verdünnte Lösungen mit kurzen Abscheidungszeiten erforderlich sind. Zum Beispiel, die Verdoppelung der Ablagerungszeit ergibt eine hohe Verteilung der noch größere Aggregate. Wenn die Proteinkonzentration auf 0,100 mg erhöht / ml, einen dünnen Film aus Photorezeptoren, wird ohne Änderung der Abscheidungszeit oder Puffer Ionenstärke beobachtet.
Verwendung einer Bildanalyse-Software können die Querschnitte der Proteine gemessen werden, nachdem das Bild abgeflacht (Figur 4). Die Querschnitte bereitzustellen xy-Daten mit den entsprechenden Höhenmessungen. Diese Messungen können verwendet werden, um strukturelle Details, Protein / Oberflächenwechselwirkungen, die mechanische Festigkeit usw. der XY-Daten durch die AFM-Sonde gefaltet werden kann; Jedoch kann dieser Effekt durch die Verwendung eines stärkeren Sonde minimiert werden. In der Tat, die choEis-Sonde ist eine heikle Balance zwischen akzeptabler Faltung und der Widerstand des belichteten Materials, um eine Beschädigung durch eine scharfe Sonde. Faltungsspitze kann auch aus dem Bild subtrahiert werden, falls notwendig, durch geeignete Software.
Diese Bilder können direkt auf bisher veröffentlichten Bildern verglichen, entnommen mit Tapping-Mode AFM werden. 20. Die gemessenen Dimensionen des P3 auf Glimmer mit Peakforce QNM sind innerhalb von 5% der mit Tapping-Mode AFM erhaltenen Werte.
Abbildung 1. Flüssige-Cell Atomic Force Microscopy. (A) Laser, Freischwinger, Sonde, und Oberflächenausrichtung. Die Sonde und Freischwinger sind in der Flüssigkeitszelle angebracht. (B) Flüssigzelle. Die Sonde, Ausleger und die Probe vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht. (C) Gesete Montage. Die Flüssigkeitszelle wird zu einem Mikrometer befestigt ist. Das Bild zeigt den optischen Kopf und Scanner in Beziehung zu der Flüssigkeitszelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Peakforce Quantitative Nanomechanische Eigenschaftenzuordnung Dies ist eine Illustration für einen kleinen Spitzenkraft (A)-Ansatz (B) Wechseln zu kontaktieren (C) Spitzenkraft (D) Haftung (E) zurückziehen.. Die Figur wurde reproduziert und mit Genehmigung angepasst. 15
Abbildung 3. Atomic Force Microscopy von P3 auf Glimmer. (A) Bild der sauberen Glimmer (1 x 1 um). (B) Bild (1 um x 1 um) von P3 auf Glimmer aufgetragen. Die Pfeile zeigen Beispiele der einzelnen Protein-Dimere. Das Sternchen bezeichnet ein Aggregat von Protein-Dimeren. (C) Bild (170 x 170 nm) von zwei Protein-Dimeren mit einem dreidimensionalen Einsatz eines einzigen Dimer. Die Einfügemarke bezeichnet, welches Protein-Dimer im Einschub vorhanden ist. Alle Bilder wurden in Gegenwart des Abbildungspuffer (Proteinkonzentration = 0,0010 mg / ml für die Abscheidung) übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Querschnittsanalyse von P3 auf Glimmer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
AFM ist ein Rastersondenmikroskopie Verfahren vollständig in der Lage Abbildung von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen in physiologisch relevanten Bedingungen. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie und NMR, eine Begrenzung der AFM ist ihre Unfähigkeit, die gleiche Auflösung, insbesondere die laterale Auflösung zu erzielen. Bei der Verwendung von AFM, ein Molekül auf einer Oberfläche zu analysieren, müssen die Auswirkungen der Oberfläche und der Sonde auf dem Bild des Moleküls auch bei der Daten analysiert werden. Entfalten der Auswirkungen der Sonde auf dem aufgenommenen Bild kann mit entsprechender Software durchgeführt werden. Entwicklung theoretischer Modelle zur experimentellen Ergebnissen vergleichen können sich als sehr nützlich.
In diesem Papier AFM-Bilder einer bakteriellen Rotlichtphotorezeptor RpBphP3 (P3), dargestellt (Abbildung 3). Während die Beschreibungen des Mikroskops Montage und Betrieb der Software speziell für das jeweilige Instrument Modell beschäftigt sind, der Glimmerund Protein-Probenvorbereitungsverfahren sind allgemein und kann zu jeder AFM-Experiment angewendet werden.
Einige kritische Schritte dieses Protokolls sind, um das gewünschte Protein Abdeckung auf der Glimmeroberfläche zu erhalten, gefolgt werden. Erstens müssen die verdünnten Proteinlösung vorsichtig gemischt, bevor es auf der Glimmeroberfläche (Schritt 4.3) angelegt wird. Aufgrund des hohen Molekulargewichts von P3 ist der Abscheidelösung ganz kolloidalen; Daher setzt P3 zu dem Boden des Rohrs im Laufe der Zeit so dass die Lösung nicht homogen. Ein sanfter Aufsehen behebt dieses Problem. Zweitens, wenn das Protein angewendet wird, muss die Oberfläche gespült werden, um jegliche lose gebundenen Molekülen (Schritt 4,5 bis 4,6) zu entfernen. Wenn lose gebunden P3 auf der Oberfläche bleibt, werden die Moleküle entweder in die Lösung freigesetzt werden, wenn der Flüssigkeitszelle mit Pufferlösung gefüllt und / oder durch die AFM-Sonde während des Experiments aufgenommen. Beide Veranstaltungen behindern eine erfolgreiche Imaging Experiment. Wenndie Flüssigkeitszelle wird mit P3 kontaminiert, muß es zerlegt und gereinigt werden. Wenn der AFM-Sonde nimmt ein Molekül, das in der Regel ausgetauscht werden muss oder die Bildqualität geopfert wird. Schließlich ist das Verfahren der Proteinprobe Spülen kritisch, um ausgezeichnete Bilder. Glimmer ist ein nicht-selektiver Oberfläche bis P3; Daher sollten die Moleküle gefunden werden, die zufällig ausgerichtet werden. Das Verfahren zum Spülen in dem Protokoll beschrieben ist ein Weg, um zu vermeiden Umordnen der Moleküle auf der Oberfläche in einer einzigen Ausrichtung. Der Schlüssel ist, um die Probe immer feucht zu halten und zu vermeiden, hält die Oberfläche in einem Winkel und buchstäblich Besprühen der Oberfläche mit Puffer. Wird die Probe durch Eintauchen, während Sie es in das Becken einer Petrischale parallel gespült wird die Verzerrung des P3 auf der Oberfläche durch Kraft Ströme der Pufferlösung minimiert.
Alle Teile auf die Flüssigkeitszelle, Sonde, Scanner und optische Kopf sind sehr empfindlich und müssen mit Vorsicht behandelt werden. Die springs, die den Scanner und optische Kopf zusammenhalten, sind sehr stark. Es ist zwingend notwendig, um eine Hand auf den Scanner zu halten, wenn die Montage oder die Verstellung eines der Stücke. Für PF-QNM mit ScanAsyst-Software, wie im Protokoll beschrieben, ist es wichtig, schalten Sie die automatische Software-Steuerung der Z-Grenze und setzen Sie diesen Wert auf mindestens 500 nm, wenn die Originalscangröße beträgt 1 um (Schritt 3.16) . Dies schützt den Scanner, wenn die Oberfläche hat sich unerwartet rauen oder hat sich verunreinigt. Nachdem ein Einzelbild erfasst wurden, und es wird bestätigt, dass die Bildfläche glatt ist, kann der Z-Grenze nach unten manuell eingestellt werden, um Bilder mit höherer Auflösung zu erzielen. Es ist entscheidend, um die Z-Grenze bis mindestens 500 nm nachzustellen, wenn der Scanner in einen neuen Bereich der Oberfläche bewegt wird, oder wenn die Spitze aus irgendeinem Grund zurückgezogen.
Während dieses Papier zur Verwendung von PF-QNM, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten topographischen fokussiert ist, kann die Methode selbst eine schaffenBibliothek von zusätzlichen Informationen über die mechanische Festigkeit und Flexibilität von Oberflächenstrukturen. Diese Funktion kann auf weitere Erkenntnisse über Funktionalität, indem Sie einfach die entsprechenden Kanäle während des Experiments 16,18 Mit entsprechenden Änderungen der Konzentration des Ablagelösung und / oder der Oberfläche führen. Kann diese Methode allgemein für die Verwendung von PF-QNM zu untersuchen sein biologischen Makromolekülen durch Flüssig-Zelle AFM. Mit dem automatisierten Hilfe von Software können die Schüler in der oberen Ebene der Wissenschaft Kurse ohne vorherige Erfahrung mit AFM eine flüssige Zell AFM-Experiment viel schneller abschließen als mit dem traditionellen Anzapfen-Mode-AFM. Die Schüler können die Grundlagen der AFM erleben und bekommen einen Vorgeschmack auf die interdisziplinäre Forschung gemacht durch diese leistungsfähige Technik möglich innerhalb einer typischen 3 - 4 Stunden Labor Abschnitt Zeitbindung.
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Acknowledgments
Die NSF-MRT-Programm (CHE: 1229103) ist für die Finanzierung des Kaufs von neuen Steuerelektronik, Software, Flüssigkeitszellen und andere Geräte benötigt, um eine Dual-AFM / STM zusammen anerkannt. Wir erkennen die gemeinsamen Einrichtungen an der Universität von Chicago NSF-MRSEC Programm (DMR-0820054) für die Unterstützung bei AFM Instrumentierung, Ausbildung und Bildgebung, und für Systemzeit von der Materialforschung Einrichtungen Network (DMR-0820054) zur Verfügung gestellt. Wir danken besonders Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, und Prof. Ka Yee Lee für vor die Finanzierung des NSF-MRT Vorschlag, dass die notwendige Messtechnik, um unsere Campus gebracht begrüßen unsere Studenten. Wir erkennen die Finanzierung aus einem Titel III STEM Grant (ID: P031C110157) Northeastern Illinois University verliehen, die Forschungsstipendien Sommer für Studierende und Lehr sowie Unterstützung für Verbrauchsmaterialien zur Verfügung gestellt. Schließlich erkennen wir Bruker-Nano, Inc. für die weitere instrumentale Unterstützung und für die Erlaubnis, reproduce ein Diagramm, das den Mechanismus der Peakforce QNM und das Wort ScanAsyst verwenden, um die automatische Software zu beschreiben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
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