Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Атомно-силовая микроскопия красных фонарей фоторецепторов Использование Mapping PeakForce Количественный Наномеханические недвижимости

Published: October 24, 2014 doi: 10.3791/52164
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 2
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Chemistry, Northeastern Illinois University

Abstract

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) использует кончик пирамидальную прикрепленный к консоли для исследования силы реакции поверхности. Отклонения от кончика может быть измерена до ~ 10 PN с помощью лазера и детектора секторной, которые могут быть преобразованы в изображение топографии. Амплитудной модуляции или "режим нажатием" АСМ включает в себя зонд, делая прерывистый контакт с поверхностью, колеблясь на своей резонансной частоте, чтобы произвести изображение. При использовании в сочетании с жидкостью камере, нажав режима АСМ позволяет томографии биологических макромолекул, таких как белки в физиологически соответствующих условиях. Нажатие режиме АСМ требуется ручной настройки зонда и частых корректировок множества параметров сканирования, которые могут быть сложными для неопытных пользователей. Для получения высококачественных изображений, эти корректировки наиболее трудоемким.

PeakForce Количественный Наномеханические Сопоставление свойств (PF-QNM) создает изображение путем измерения силы responсебе кривая для каждой точки контакта с образцом. С ScanAsyst программного обеспечения, PF-QNM могут быть автоматизированы. Это программное обеспечение регулирует уставки, частоты вращения, скорости сканирования, прирост, и другие важные параметры сканирования автоматически для данного образца. Мало того, что этот процесс защиты как хрупкие зондов и образцов, это значительно сокращает время, необходимое для получения изображений с высоким разрешением. PF-QNM совместим для АСМ изображений в жидкости; Поэтому, он имеет широкое применение для визуализации биологически соответствующие материалы.

Метод, представленный в этой статье описывается применение ПФ-QNM получать изображения бактериальной красных фонарей фоторецепторов, RpBphP3 (P3), от фотосинтеза R. болотный в свет адаптированы государства. С помощью этого метода, отдельные белковые димеры Р3 и агрегаты димеров были обнаружены на поверхности слюды в присутствии буфера визуализации. С соответствующими корректировками в поверхностные и / или концентрации раствора, этот методкак правило, может быть применено к другим биологически соответствующих макромолекул и мягких материалов.

Introduction

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) стал очень важным инструментом для исследования структурных и механических свойств поверхностей, тонких пленок и одиночных молекул с момента ее изобретения в 1986 году (Рисунок 1). 1-3 Использование жидкого-клетку, метод имеет становятся особенно полезно при исследовании биологических макромолекул, и даже живых клеток в физиологически соответствующей среде. 4-10 Нажатие режиме АСМ традиционно используется для визуализации мягких материалов или слабо связанные молекулы на поверхность, так как в контактном режиме АСМ, как правило, непригодны вследствие чтобы ущерб, причиненный боковых сил, действующих на образце кантилевера. 11 Нажатие режиме АСМ существенно снижает эти силы, имея верхушка периодически прикасайтесь к поверхности, а не находясь в постоянном контакте. В этом режиме кантилевер колебались в или около его резонансной частоты, нормальном к поверхности. Аналогично связаться-режим АСМ, топография аналyzed путем построения движение г-пьезо как функция ху (расстояние).

Динамика консольные может быть довольно нестабильным на или вблизи резонанса; Поэтому, они очень сложной для автоматизации пределами "стационарном" ситуации. В частности, эта динамика зависят как от свойств образца и среды сканирования. Для мягкой молекулы, адсорбированной на жесткий (ER) поверхности, хорошо настроенный контур обратной связи для молекулы может привести к обратной колебаний на поверхности. Работа в жидкости дальнейшего усложняет настройку консоли. Изменения в уровнях температуры или жидкости требуют постоянного корректировку уставки, прибыли и других показателей визуализации. Эти корректировки, как правило, очень много времени и сложной для пользователей.

Пиковое усилие Количественный Наномеханические Сопоставление свойств (PF-QNM), как кратковременное нажатие АСМ, позволяет избежать латеральных взаимодействий на периодически контактирование образца (рисунок 2). 12-15 </ SUP> Однако, ПФ-QNM работает в не-резонансном режиме и частотах, значительно меньших, чем нажав режиме АСМ. Это исключает проблемы настройки нажав режиме AFM, в частности, усугубляется при наличии жидкости. С PF-QNM, изображения собраны, взяв кривую силы в каждой точке контакта. С добавлением ScanAsyst программного обеспечения, 15 регулировка параметров сканирования могут быть автоматизированы и изображения с высоким разрешением получены в считанные минуты с помощью даже неопытным пользователям. После того, как пользователь становится больше знакомы с АСМ, некоторые или все из автоматизированных параметров может быть отключена в любой момент, который позволяет экспериментаторам, чтобы точно настроить качество изображения вручную. С момента своего создания, PF-QNM была применена для сопоставления бактериородопсин, мембранный белок, и другие родные белки в субмолекулярном уровне. 16-18 Для бактериородопсине, существует прямая корреляция между гибкостью белка и рентгеновской кристаллографии структур. 12 PF -QnM был использован для исследования живых клеток с высоким разрешением. 19,20 Кроме того, данные PF-QNM уже выяснены важные связи между структурой и механики в мембране эритроцитов, что имеют решающее значение для целостности и функции клеток. +21

Мы использовали сканирующей зондовой микроскопии методы (SPM), 22 в том числе AFM, 23 изучать структуру красных фонарей фоторецепторов названием bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Они состоят из светового модуля зондирования, ковалентно связанной с сигнализации-эффекторной модуля такой как гистидинкиназа (HK). 26 Световой модуль зондирования обычно содержит билин хромофора, которая подвергается структурной трансформации при поглощении фотона, с серией структурных изменений, достигающих модуль сигнализации-эффекторной и ведущих к глобальной трансформации всей белка . 24,27-29 На основе этой трансформации, есть два различных светопоглощающий сTates из BphPs, красной и дальней красной света поглощая государства, обозначается как Pr и ПФР. Pr термически стабилен, адаптируются к темноте состояние для большинства BphPs. 28 Молекулярные основы Pr / Pfr фотопреобразования не совсем понял ввиду ограниченности структурного знания этих белков. За исключением одной структуры из D. radiodurans, 30 все опубликованные рентгеноструктурного структуры этих белков являются в темно-адаптированы состоянии и не имеют домен эффектора. Интактные BphPs слишком велики, чтобы быть эффективно исследованы ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и, как известно, трудно кристаллизуются в их интактной форме (особенно в легкой приспособлены государства) для рентгеновской кристаллографии. BphPs недавно были разработаны как белковых маркеров инфракрасный люминесцентных (IFP ы). 31 Структурная характеристика этих белков может далее помощь в эффективной IFP дизайна. 32-36

В центре внимания этой статьи является представление процедурувизуализация BphPs использованием жидкого клеток AFM через PF-QNM. Метод свидетельствуют исследования, светового приспособлены состояния bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) от фотосинтетических бактерий Р. болотный. Процедура АСМ, представленные здесь, удобный и простой подход для визуализации белков, а также другие биологические макромолекулы. С помощью этого метода, конструктивные детали из отдельных молекул могут быть собраны в течение короткого периода времени, аналогичного к научно-лабораторного курса сеанса верхнего уровня. Через измерения сечений и комплектующих дальнейшие размерные анализы, экспериментальные данные можно сравнить с полезных вычислительных моделей. 37-42

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Компьютерные и микроскоп Настройка

  1. Откройте клапан N 2 цилиндра и отрегулируйте ручки для обеспечения воздушный стол является плавающей и уровень.
  2. Включите компьютер, контроллер, и волоконно-оптического света в этом порядке.
  3. Установите сканер к АСМ режиме / ЛЧМ и центрирования камеры над головой АСМ.
  4. Открытое программное обеспечение. Выберите категорию эксперимент "Наномеханические Свойства", "Количественный Наномеханические Mapping" под эксперимент группы, и "PeakForce QNM в жидкости" под эксперимент. Нажмите Load эксперимента, затем Setup.
  5. Сфокусируйтесь с помощью Z цели, чтобы увидеть поверхность стадии. Использование грубых вверх / вниз Пьезоэлементы перемещения этап примерно 1 мм ниже поверхности головки AFM отверстие.

2 Подготовка поверхности слюды

  1. Нажмите клейкую наклейку на поверхности чистой пробы поддержки диска (диаметром 15 мм, толщиной 0,8 мм). Нажмите слюды V-4сорт диск (25 х 25 х 26 мм) на клей, пока твердо не прилагается.
  2. Натрите кусок четко ленты на слюду, обеспечивающего он полностью придерживался без воздушных пузырьков. Потяните ленту слюды с одной стороны, чтобы равномерно расщеплять его. При необходимости повторите застраховать слюды является плоской.
  3. Ручка держателя экрана, чистый сторона слюды вверх, с парой кольцевых дисков (пинцетов захваты), и поместить на сканере. Слюда должна быть ниже уровня головки AFM отверстие.

Жидкость 3 Ассамблея сотовый и изображений поверхности слюды

  1. Промойте жидкости клетку, уплотнительное кольцо, шприц адаптер, адаптер для шланга, и шланг выброса в 100% этаноле. Промойте жидкости ячейку в дистиллированной водой. Пусть все части полностью высохнуть.
  2. Нажмите адаптер шланга в порт на чистой жидкости клетки. Аккуратно нажмите на уплотнительное кольцо в центре отступа ячейки жидкости с помощью плоской головкой пинцет.
  3. Нажмите пружину слегка на фиксирующей зонд зажимом и превратить его от Groovе за чаевые.
  4. Возьмитесь зонд на длинном конце от кончика с плоской головкой пинцета. Поместите зонд в канавке с наконечником, обращенным к центру ячейки. Нажмите весну в и отрегулируйте фиксатор клип на зонд, чтобы закрепить его (Рисунок 1В).
  5. Проверьте зажим на AFM, чтобы обеспечить его полностью убраны (Рисунок 1C).
  6. Поместите жидкость клеток, уплотнительное кольцо и исследовать направлен вниз, на верхней части образца слюды. Разрешить жидкость клеток, чтобы отдохнуть на шпильки АФМ. Опустите зажим для стабилизации жидкости ячейку на сцене. Нажмите вниз переключатель на микроскопе пока визуальный осмотр не показывает уплотнительное кольцо плотно сжатый между опорной диска и жидкости клетки.
  7. Во время просмотра монитор, сфокусировать грубой настройки ручку для визуализации верхнюю часть жидкости ячейки на экране.
  8. Перемещение микроскоп, пока не будет ясно, изображение кончика помощью X / Y ручки регулировки и Z цели. Кончик будет приложениеухо, как металлический, золотой треугольник. Перемещение наконечник ближе к поверхности образца с использованием вниз пьезо рычаг на микроскопом. Сосредоточьтесь на отражение кончика. Следите за фактической кантилевера в связи с его отражением. На этой стадии, они должны быть тесно связаны, но не полностью перекрываются.
  9. Подключите адаптер шприца в стерильный шприц 1 мл. Прикрепите один конец шланга выброса к адаптеру шприца, а другой конец шланга в емкость с буферным раствором. Полностью выдвиньте поршень шприца.
  10. Прикрепите шланг к шланга адаптера на жидкости клетки. Аккуратно нажмите на поршень, пока жидкость полностью не заполнит центр камеру. Проверьте ячейку застраховать нет пузырьков воздуха. Проверьте, чтобы увидеть, нет жидкости, разлив жидкости из ячейки на микроскопе. Поместите шприц на поднятой твердом носителе.
  11. Используйте канал камеры и ручки перевода X / Y, чтобы найти лазер на экране (диффузный красная точка). Используя лазерный движЛОР ручки управления, перемещать лазер на кончик.
  12. Точная настройка элементов управления лазерные и зеркальные пока суммарный сигнал отображается на микроскопе не развернуто (значение = 4 - 6).
  13. Отрегулируйте угол квадранта диода с помощью ручки на левой задней стороне и верхнюю левую часть головы сканирования снизить вертикальные и горизонтальные прогибы, отображаемые на микроскопом как можно ближе к нулю, насколько это возможно (± 0,1).
  14. В программном обеспечении, выбрать параметры сбора. Как минимум, выберите высоты (трассировки и обратного хода), пик ошибки силы, и деформации. Другие варианты зависят пользователя и может быть адаптирована на основе конкретной информации нужной экспериментатором.
  15. Выберите "линии" для РТ Plane Fit в каждом окне приобретения. Выберите "Нет" для OT Plane Fit в высоте окна. Установите X и Y смещение и угол сканирования до нуля, если это еще не сделано.
  16. Установите скорость сканирования до 1 Гц, образца на линии 256, авто управления ScanAsystиндивидуальному, и ScanAsyst авто Z предела еще раз. Изменение лимита Z до 500 нм. Установите размер сканирования до 1 мкм.
  17. Нажмите заниматься. В этот момент, наконечник к поверхности. В то время как верхушка приближается, наблюдать Z изменения пьезо напряжения в нижнем левом углу экрана. Если кончик идет за пределами диапазона, снять наконечник и повторного подхода. Если это не удается, верхушка, возможно, потребуется изменить для того, чтобы иметь успешный подход. После того, как кончик занимается, линии начнут появляться на каждом из окон сбора, которые составляют изображение.
  18. Возьмите образы слюды на 1 х 1 мкм и увеличения медленно, чтобы гарантировать, что поверхность слюды является чистой и ровной. Нажмите непрерывной съемки до сохранения изображений, как они появляются. Увеличение и передвигаться по поверхности по желанию.

4 белка Отложение и Получение образца для визуализации

  1. Получить очищенного образца белка 38 и держать на льду. Если хранить в морозильной камере, оттепель образец нальду в течение 5 мин.
  2. Развести белок 0,0010 мг / мл, используя в холодильнике буферным раствором изображений. Буфер изображений, используемый здесь, 15 мМ Трис-HCl (рН = 8,0), 150 мМ NaCl и 15 мМ MgCl2.
  3. Заполните 4 камеры (100 х 15 мм) чашки Петри с охлажденной буферного раствора изображений. Заполните каждую камеру по меньшей мере с 5 мл раствора. Аккуратно перемешайте разбавленный раствор белка с кончика, прикрепленной к микропипетки.
  4. Применить 200 мкл разбавленного раствора белка на поверхности слюды уже подготовленной. Через 30 сек, поднять белок / поверхности слюды с круговых пинцетом (дисковые захваты). Держите образец параллельно лабораторном столе.
  5. Удерживая образца, сразу же погружают в образец в буферном растворе, содержащейся в первом квадранте чашки Петри (этап 4.2), обеспечивая при этом образец параллельно бассейне чашке Петри. После 1 сек, удалить образец.
  6. Продолжая удерживать образец параллельно бассейнаиз чашки Петри, повторите шаг 4,5 для остальных трех квадрантах.
  7. Поместите диск на сухой пыли тряпочкой, чтобы впитать лишнюю влагу и передать диск на столик микроскопа. Не прикасайтесь к фактической поверхности с тканью. Не допускайте образец высохнуть.
  8. Повторите шаги 3,6 - 3,16.

5. визуализации Белки на Mica

  1. Нажмите параметров флажок на на левой стороне экрана. Размер весной и радиус наконечника должен быть установлен на основании используется наконечник.
  2. Нажмите заниматься. Как и в процессе формирования изображения слюда (шаг 3,17), наблюдать окно г-пьезо, как кончик подходов.
  3. На сканер и изображения и ту же область в течение по крайней мере двух последовательных проходов. Нажмите непрерывной съемки, чтобы сохранить каждое изображение собранной.
  4. Переместить сканер к новой области и / или изменить размер изображения по желанию.
  5. После автоматизированная программное обеспечение завершения настройкипараметры сканирования для конкретного размера изображения, повернуть программное обеспечение прочь.
  6. Ручная регулировка частоты сканирования, г предел, количество строк, и напряжение для того, чтобы точно настроить фокус изображения. Если изображение становится слишком далеко вне фокуса, включите программное обеспечение назад на вернуть исходный стартовую позицию. Чтобы увеличить разрешение изображения, а увеличение на белку, уменьшить скорость сканирования и увеличить количество линий пропорционально.
  7. После эксперимента очистки жидкости-ячейку с 100% этанолом и промывают деионизированной H 2 O. Дайте жидкости клеток, чтобы полностью высохнуть.
  8. Откройте программное обеспечение данных для обработки необработанных изображений данных. Во-первых, сведение изображения, нажав на значок сглаживаться. Выберите Ноль го порядка и нажмите выполнить. В зависимости от изображения, самолет форме могут быть необходимы, чтобы получить соответствующим образом плоское изображение. В этом случае, выберите значок подходят самолет и нарисовать самолет из плоского области изображения с помощью курсора. Нажмите выполнить. При необходимости повторите
  9. SelВкладка т.д. поперечное сечение, чтобы измерить размеры белка. Рисование линии с помощью курсора переместить его на молекулы или области, которые будут проанализированы. Повторите эти действия для различных областей науки и программное обеспечение будет генерировать накладку. Экспорт изображение или данные, используемые для создания изображения в формат, совместимый с другими программными и рисования программ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представительства АСМ изображения фоторецепторной белка, P3, благодаря малой приспособлены государства представлены на рисунках 3 и 4. Свеже-слюда субстрат (3А) является подходящим, плоская поверхность для адсорбции белка. Сбор изображение чистой слюды в качестве отрицательного контроля является важным по нескольким причинам. Во-первых, это страхует жидкость ячейка чисто и никакие остаточные материалы от предыдущих экспериментов не будет загрязнять поверхность. Во-вторых, он проверяет качество зонда. Если зонд загрязнен или деформироваться, это появится в изображения в качестве полосы или представить себя в виде шума. Наконец, чистая слюда изображение подтверждает зонд может быть соответствующим образом настроен для будущих экспериментов.

Один белок фоторецептора димеры можно наблюдать с помощью PeakForce QNM, если покрытие поверхности уместно (фигура 3В, С). Стрелки сигнализировать индивидуальные димеры; Звездочкой отмечены белка агрегат.Концентрация образца белка, время осаждения, и ионной силы буфера изображений воздействовать на покрытие поверхности. 23 Для высокой распределения отдельных молекул, очень разбавленные растворы с коротким временем осаждения требуются. Например, удвоение времени осаждения дает высокую распределение, даже более крупные агрегаты. Если концентрация белка увеличивается до 0,100 мг / мл, тонкая пленка фоторецепторов наблюдается без изменения времени осаждения или ионной силы буфера.

Использование ПО для анализа изображений, сечения из белков может быть измерена после образ уплощается (рисунок 4). Поперечные сечения обеспечивают XY-данные с соответствующими измерениями высоты. Эти измерения могут быть использованы, чтобы обеспечить структурные детали, белок / поверхностных взаимодействий, механическую прочность и т.п. ху данные могут быть извитых по АСМ зонда; Однако этот эффект можно свести к минимуму с помощью более острый зонд. В самом деле, чолед зонда тонкий баланс между приемлемым количеством свертки и сопротивления распечатанных материалов к повреждениям резким зонда. Подсказка свертки также может быть вычтена из изображения, если это необходимо, с помощью соответствующего программного обеспечения.

Эти снимки могут быть непосредственно по сравнению с ранее опубликованными изображений собранных с помощью нажатия в режиме АСМ. +20 Измеренные размеры P3 на слюде, использующие PeakForce QNM находятся в пределах 5% от значений, полученных с отводом режиме АСМ.

Рисунок 1
Рисунок 1 Liquid-Cell атомно-силовой микроскопии. (A) Лазерная, консольные, зонд, и выравнивания поверхности. Зонд и консольные прикреплены внутри жидкой клетки. (В) Жидкий клеток. Зонд, консольные, и образец полностью погружают в жидкость. (С) Комплэте сборки. Жидкость клеток прикреплен к микрометра. На снимке оптической головки и сканер в связи с жидкой клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2:. PeakForce Количественный наномеханических Сопоставление свойств Это иллюстрация для небольшого пика силу (А) подход (В) Перейти в контакт (С) Пиковое усилие (Н) Адгезия (Е) Отвод.. Эта цифра была воспроизведена и адаптировано с разрешения. +15

Рисунок 3 Рисунок 3 Атомно-силовая микроскопия Р3 на Mica. (A) Изображение чистой слюды (1 х 1 мкм). (B) изображения (1 мкм х 1 мкм) P3 применяется к слюды. Стрелки указывают примеры единичных димеров белка. Звездочка обозначает совокупность белковых димеров. (C) изображения (170 х 170 нм) из двух белковых димеров с трехмерной вставкой одного димера. Каретка обозначает белок, который присутствует димера на вставке. Все снимки были сделаны в присутствии буфера изображений (концентрация белка = 0,0010 мг / мл для осаждения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4 поперечного сечения Анализ P3 на Mica. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

АСМ является сканирующий зондовый метод микроскопии в полной мере способны визуализации белков и других биологических макромолекул в физиологически соответствующих условиях. По сравнению с рентгеновской кристаллографии и ЯМР, одно ограничение АСМ является его неспособность достичь того же разрешение, особенно бокового разрешения. При использовании АСМ для анализа молекулу на любой поверхности, влияние поверхности и зонд на изображении молекулы также необходимо учитывать при анализируются данные. Deconvoluting воздействия зонда на получившемся изображении могут быть завершены с соответствующим программным обеспечением. Разработка теоретических моделей для сравнения с экспериментальной исход может оказаться весьма полезным.

В этой статье, АСМ изображения бактериальной красных фонарей фоторецепторов, RpBphP3 (P3), представлены (рисунок 3). В то время как описания микроскопа сборки и эксплуатации программного обеспечения являются специфическими для конкретной модели прибора используется, слюдаи процедуры подготовки образца белка являются общими и могут быть применены к любому эксперименте AFM.

Необходимо соблюдать несколько важных шагов этого протокола для того, чтобы получить желаемый охват белка на поверхности слюды. Прежде всего, разбавленный раствор белка должно быть осторожно перемешивают до ее наносят на поверхность слюды (этап 4.3). В связи с высокой молекулярной массой Р3, осаждение решение довольно коллоидный; Поэтому, Р3 оседает на дно трубки с течением времени делает решение неоднородной. А нежные размешивать средства этой проблеме. Во-вторых, как только белок применяется, поверхность необходимо промыть, чтобы удалить любые слабо связанных молекул (шаг 4.5 - 4.6). Если слабо связаны Р3 остается на поверхности молекулы будет выпущен либо в растворе, когда жидкость клеток заполнена буферным раствором и / или подобраны АСМ зонда в ходе эксперимента. Оба эти события препятствовать успешный эксперимент изображений. Еслижидкость-клеток загрязняется P3, он должен быть разобран и тщательно очищены. Если АСМ зонда поднимает молекулу, то, как правило, должны быть заменены или качество изображения в жертву. И, наконец, способ промывки образец белка имеет решающее значение для получения превосходных изображений. Слюда неселективный поверхность Р3; Поэтому, молекулы должны быть найдены, чтобы быть ориентированы случайным образом. Способ промывки описано в протоколе является одним из способов, чтобы избежать перестановки молекул на поверхности в одной ориентации. Ключ должен всегда держать образец влажной и избегать проведения поверхность под углом и буквально распыления поверхность с буфером. Если образец промывают погружением, удерживая ее параллельно бассейне чашке Петри, искажение P3 на поверхности силой токов буферного раствора к минимуму.

Все части в жидкой клетки, зонда, сканер, и оптической головки очень чувствительны и должны быть обработаны с осторожностью. SprinGS, которые держат сканер и оптическую головку вместе очень сильны. Крайне важно, чтобы держать руку на сканер при сборке или разборке любой из частей. Для PF-QNM с ScanAsyst программного обеспечения, как описано в протоколе, важно, чтобы выключить автоматический контроль программного обеспечения в Z-предела и установить это значение, по крайней мере 500 нм, если оригинальный размер сканирования 1 мкм (шаг 3,16) . Это защищает сканер, если поверхность стала неожиданно грубо или был заражен. После того, как одно изображение было собрано и было подтверждено, что отображаемого область является гладкой, Z-предел может быть скорректирована вниз вручную, чтобы достичь более высокого разрешения изображения. Это имеет решающее значение для скорректировать Z-предел назад, по крайней мере 500 нм, когда сканер переехал в новое площади поверхности или если игла отводится по любой причине.

Хотя этот документ был ориентирован на использование PF-QNM получить высококачественные топографические изображения, сам метод может обеспечитьБиблиотека дополнительной информации о механической прочности и гибкости поверхностных структур. Эта функция может привести к более полное представление о функциональности, просто выбрав соответствующие каналы во время эксперимента. 16,18 С соответствующих изменений в концентрации раствора осаждения и / или поверхности, этот метод может быть вообще для использования PF-QNM исследовать биологические макромолекулы жидким клеток АСМ. С автоматизированной помощью программного обеспечения, студенты в факультетов, верхнего уровня, не имеющие опыта с АСМ может завершить эксперимент жидкость-клеток АСМ намного быстрее, чем при традиционной постукивание режиме АСМ. Студенты могут испытать основы АСМ и получить вкус междисциплинарных исследований стало возможным благодаря этой мощной техники в типичном 3 - 4 ч лаборатория разделе временного ограничения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Программа NSF-МРТ (CHE: 1229103) признается для финансирования покупки новых управляющей электроникой, программное обеспечение, жидких клеток, и другое оборудование, необходимое для сборки двойную AFM / STM. Мы признаем, общие удобства в университете программы Чикаго NSF-MRSEC (DMR-0820054) для помощи с АСМ-измерительных приборов, обучение и изображений, а также для приборам предоставляться научно-исследовательские центры сети материалов (DMR-0820054). Мы особенно благодарим доктора Qiti Го, д-р Джастин Jureller, и профессор Ка Йи Ли за приветствуя наших студентов до финансирования предложения NSF-МРТ, которая принесла все необходимое оборудование, чтобы наш кампус. Мы признаем, финансирование из STEM гранта Название III (ID: P031C110157) присуждена Северо-Восточного Иллинойского университета, который предоставил летние исследовательские стипендии для студентов и преподавателей, а также поддержку для расходных материалов. Наконец, мы признаем Bruker-Nano, Inc для продолжения инструментальной поддержки и разрешения по гeproduce график, показывающий механизм PeakForce QNM и использовать слово ScanAsyst описать автоматизированное программное обеспечение.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl Fisher Scientific O4997-100
NaCl Acros Organics 7647-14-5
MgCl2 Acros Organics 7791-18-6
Multimode 8 AFM Bruker-Nano 492-008-011 equipped with Nanoscope V controller and J scanner
Probe Bruker-Nano SNL-10, ScanAsyst-Fluid+
Tapping Mode Fluid Cell Bruker-Nano MTFML
Mica V-4 Grade SPI supplies 1150503 25 x 25 x .26 mm
Sample support disk nanoSurf BT02236
Petri dish Plasta-Medic, Inc. 100 mm x 15 mm 
micropipettors Denville Scientific XL 3000i
RpBphP3 Prepared according to cited references
Nanoscope software Bruker-Nano
Fiber Optic Light Digital Instruments Inc. F0-50
Pelco AFM Disc Gripper Ted Pella Inc 1668 12 mm
1 ml syringe McKesson 102-ST1C
Eppendorf tubes Denville Scientific C2171
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 Schrodinger, LLC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
  2. Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
  3. Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
  4. Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
  5. Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
  6. Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
  7. Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
  8. Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
  9. Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
  10. Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
  11. Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
  12. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
  13. Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
  14. Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
  15. Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
  16. Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
  17. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
  18. Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
  19. Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
  20. Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
  21. Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
  22. Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
  23. Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
  24. Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
  25. Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
  26. Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
  27. Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
  28. Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
  29. Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
  30. Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
  31. Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
  32. Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
  33. Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
  34. Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
  35. Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
  36. Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
  37. The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
  38. Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
  39. Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
  40. Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
  41. Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
  42. Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).

Tags

Физика выпуск 92 атомно-силовая микроскопия белок фоторецепторов химии поверхности нанонауки мягкие материалы макромолекулы AFM
Атомно-силовая микроскопия красных фонарей фоторецепторов Использование Mapping PeakForce Количественный Наномеханические недвижимости
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kroeger, M. E., Sorenson, B. A.,… More

Kroeger, M. E., Sorenson, B. A., Thomas, J. S., Stojković, E. A., Tsonchev, S., Nicholson, K. T. Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping. J. Vis. Exp. (92), e52164, doi:10.3791/52164 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter