Abstract
Atomkraftsmikroskop (AFM) använder en pyramidal spets fäst vid en konsol för att sondera den kraft svar på en yta. De avböjningar av spetsen kan mätas till ~ 10 pN av en laser och sektoriserat detektor, vilken kan omvandlas till bild topografi. Amplitudmodulering eller "knacka läge" AFM innebär sonden gör intermittent kontakt med ytan medan oscillerande vid sin resonansfrekvens för att producera en bild. Används tillsammans med en vätska cell, knacka-mode AFM möjliggör avbildning av biologiska makromolekyler såsom proteiner i fysiologiskt relevanta förhållanden. Tapping-mode AFM kräver manuell inställning av sonden och täta justeringar av en mängd skanning parametrar som kan utmanande för oerfarna användare. För att få bilder av hög kvalitet, dessa justeringar är de mest tidskrävande.
PeakForce Kvantitativ Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) producerar en bild genom att mäta en kraft response kurva för varje punkt i kontakt med provet. Med ScanAsyst programvara kan PF-QNM automatiseras. Denna programvara justerar börvärdet, drivfrekvens, svephastighet, vinster och andra viktiga inläsningsparametrarna automatiskt för ett givet prov. Inte bara denna process skydda både ömtåliga sonder och prover, avsevärt minskar den tid som krävs för att få högupplösta bilder. PF-QNM är kompatibel för AFM avbildning i vätska; Därför har den omfattande ansökan för avbildning biologiskt relevant material.
Den metod som presenteras i detta dokument beskriver tillämpningen av PF-QNM att få bilder av en bakteriell rödljusljusmätare, RpBphP3 (P3), från foto R. palustris i dess ljus-anpassad tillstånd. Med denna metod har enskilda protein dimerer av P3 och aggregat av dimerer observerats på en glimmer yta i närvaro av en avbildande buffert. Med lämpliga justeringar till ytan och / eller lösningskoncentration, denna metodkan allmänt tillämpas på andra biologiskt relevanta makromolekyler och mjuka material.
Introduction
Atomic force microscopy (AFM) har blivit ett mycket viktigt verktyg för undersökning av de strukturella och mekaniska egenskaperna hos ytor, tunna filmer, och enstaka molekyler sedan dess uppfinning i 1986 (figur 1). 1-3 Med användning av en flytande-cell, har metoden bli särskilt användbara i studier av biologiska makromolekyler och med levande celler i en fysiologiskt relevant miljö. 4-10 Gäng-mode AFM har traditionellt använts för avbildning av mjuka material eller löst bundna molekyler till ytan, eftersom kontakt-mode AFM är typiskt olämpliga på grund till skador som orsakats av de sidokrafter som utövas på prov av fribärande. 11 Tapping-mode AFM väsentligt minskar dessa krafter genom att ha spetsen intermittent röra ytan snarare än att vara i ständig kontakt. I det här läget är den fribärande oscilleras vid eller nära dess resonansfrekvens normal till ytan. Likaså att kontakta-mode AFM, är topografi analyzed genom plottning rörelsen av z-piezo som en funktion av xy (avstånd).
De fribärande dynamik kan vara ganska instabil vid eller nära resonans; därför är de mycket utmanande att automatisera utanför ett "steady-state" situation. Specifikt denna dynamik är beroende av båda egenskaperna prov och scanning miljö. För en mjuk molekyl adsorberat till en hård (er) yta, kan en väl avstämd återkopplingsslinga för molekylen leda till återkoppling pendling till ytan. Drift i vätskan ytterligare komplicerar tuning av konsolen. Förändringar i temperatur eller vätskenivåer kräver ständig justering av börvärde, vinster och andra bildparametrar. Dessa justeringar tenderar att vara mycket tidskrävande och utmanande för användarna.
Peak Force Kvantitativ Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM), som att knacka läge AFM, undviker sido interaktioner med intermittent kontakta provet (Figur 2). 12-15 </ Sup> Men PF-QNM verkar i icke-resonant mode och frekvenser mycket lägre än att knacka-mode AFM. Detta eliminerar avstämnings utmaningar tapping-mode AFM, i synnerhet de som förvärras av närvaron av fluidum. Med PF-QNM är bilderna samlas genom att ta en kraft svarskurva vid varje kontaktpunkt. Med tillägg av ScanAsyst programvara kan 15 justering av inläsningsparametrarna automatiseras och en högupplöst bild som erhållits i några minuter genom att även oerfarna användare. När användaren blir mer bekant med AFM, kan någon eller alla av de automatiserade parametrar avaktiveras när som helst, som medger experimentalist att finjustera bildkvalitet manuellt. Sedan starten har PF-QNM tillämpats för att kart bacteriorhodopsin, ett membranprotein, och andra naturliga proteiner på submolecular nivå. 16-18 För bacteriorhodopsin, det finns ett direkt samband mellan protein flexibilitet och röntgenkristallografiska strukturer. 12 PF -QNM har använts för att undersöka levande celler med hög upplösning. 19,20 Dessutom har PF-QNM uppgifter belysas viktiga samband mellan struktur och mekanik inom erytrocytmembranet som är avgörande för cellernas integritet och funktion. 21
Vi har anställt svepspetsmikroskopi (SPM) metoder, 22 inklusive AFM, 23 för att studera strukturen av röda ljus fotoreceptorer som kallas bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 De består av en ljussensormodul kovalent bunden till en signalering-effektor modul sådan som histidin kinas (HK). 26 Ljus avkänning modul innehåller normalt en Bilin kromofor som genomgår strukturomvandling vid absorption av en foton, med en rad strukturella förändringar som når signaler-effektor modul och leder till en global transformation av hela proteinet . 24,27-29 Utifrån denna förvandling, det finns två distinkta ljusabsorberande states av BphPs, en röd och långt rött ljusabsorberande tillstånd betecknas Pr och Pfr. Pr är termiskt stabil, dark-anpassad tillståndet för de flesta BphPs. 28 Den molekylära grunden för Pr / Pfr photoconversion är inte helt förstådd på grund av begränsad strukturell kunskap om dessa proteiner. Med undantag av en struktur från D. radiodurans, 30 alla publicerade röntgenkristallografiska strukturer av dessa proteiner är i mörkret anpassade tillstånd och saknar effektordomän. De intakta BphPs är för stora för att effektivt studeras med kärnmagnetisk resonans (NMR) och är notoriskt svåra att kristallisera i deras intakt form (i synnerhet i ljuset anpassat tillstånd) för röntgenkristallografi. BphPs har nyligen konstruerad som infraröd fluorescerande proteinmarkörer (IFP: s). 31 Strukturell karakterisering av dessa proteiner kan ytterligare stöd i effektiv IFP design. 32-36
Fokus i denna artikel är att presentera ett förfarande föravbildning av BphPs använder flytande-cells AFM via PF-QNM. Metoden demonstreras genom studier av den ljus anpassad topp bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) från den fotosyntetiska bakterien R. palustris. Förfarandet AFM presenteras här är bekvämt och okomplicerad metod för avbildning av proteiner och andra biologiska makromolekyler. Med denna metod kan strukturella detaljer i enskilda molekyler samlas i en kort tid, liknande en övre nivå vetenskap kurs laboration. Genom att mäta tvärsnitt och utföra ytterligare dimension analyser, kan experimentella data jämföras användbara beräkningsmodeller. 37-42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Dator och Mikroskop Konfigurera
- Öppna ventilen av N 2 cylindern och justera vreden för att säkerställa luftbordet är flytande och nivå.
- Slå på datorn, controller, och fiberoptisk ljus i denna ordning.
- Ställ in skannern till AFM / LFM läge och centrera kameran över AFM huvudet.
- Öppen programvara. Välj experiment kategorin "Nanomechanical Egenskaper", "Quantitative Nanomechanical Mapping" under experimentgrupp och "PeakForce QNM in Fluid" under experimentet. Klicka på Load Experiment och sedan Inställningar.
- Fokusera kameran med Z målet att se ytan på scenen. Använda grova upp / ner piezos flytta scenen ca 1 mm under ytan av AFM huvudet öppningen.
2 Beredning av Mica Surface
- Tryck på en klistermärke på ytan av ett provstöd disken ren (15 mm i diameter, 0,8 mm tjock). Skjut en glimmer V-4grade disk (25 x 25 x 26 mm) på limmet tills ordentligt fastsatt.
- Gnid en bit genomskinlig tejp på glimmer säkerställer den är helt följs utan några luftbubblor. Dra tejpen bort glimmer från en sida till jämnt klyva den. Upprepa om nödvändigt för att försäkra glimmer är platt.
- Ta tag i stödskivan, ren glimmer uppåt, med ett par cirkulära pincett (skiv gripare), och placera på skannern. Den glimmer bör vara under nivån för AFM huvudet öppningen.
3 Fluid Cell Montering och avbildning av Mica Surface
- Skölj vätskan cellen, O-ring, sprutadapter, slangadapter, och utstötnings slangen i 100% etanol. Skölj vätskan cell i DI-vatten. Låt alla delar lufttorka helt.
- Skjut slangadaptern i porten på ren vätska cellen. Tryck försiktigt O-ringen i mitten indrag av vätskan cellen med hjälp av flat rubriken pincett.
- Tryck fjädern lätt på sond hållarklämman och vrid bort från Groove för tipset.
- Ta tag i sonden på den långa änden bort från spetsen med platta rubriken pincett. Placera sonden i spåret med spetsen vänd mot mitten av cellen. Tryck in våren i och justera hållarklämman över sonden för att säkra den (Figur 1B).
- Kontrollera klämman på AFM för att se till att den är helt indragen (Figur 1C).
- Placera vätskecell, O-ring och sond nedåt, ovanpå glimmer provet. Låt vätskan cellen att vila på pinnbultarna i AFM. Sänk klämman att stabilisera vätske cellen på scenen. Tryck på ned-omkopplaren på mikroskopet tills en visuell inspektion visar att O-ringen ordentligt komprimerad mellan stödskivan och vätske cellen.
- När du tittar på bildskärmen, fokusera på grovjusteringsvredet för att visualisera toppen av vätskecellen på skärmen.
- Flytta mikroskopet tills det finns en klar bild av spetsen med hjälp av X / Y justeringsvred och Z målet. Tipset kommer appenörat som en metallisk, gyllene triangeln. Flytta spetsen närmare provytan med nedåt piezo spaken på mikroskopet. Fokus på reflektion av spetsen. Håll reda på den verkliga fribärande i förhållande till dess reflektion. I detta skede bör de kopplas samman, men inte helt överlappande.
- Sätt sprutan adaptern till en steril 1 ml spruta. Fäst ena änden av utkastslangen till sprutan adaptern och placera den andra änden av slangen i behållaren på buffertlösningen. Dra ut kolven i sprutan.
- Fäst slangen på slangadaptern på vätske cellen. Tryck försiktigt in kolven tills vätskan fyller ut hela mittkammaren. Kontrollera att cellen försäkra det inte finns några luftbubblor. Kontrollera att det inte finns någon vätska rinner ut från vätske cellen på mikroskop. Placera sprutan på en upphöjd fast underlag.
- Använd kameran foder och X / Y översättnings rattar för att lokalisera laser på skärmen (en diffus röd prick). Använda laser movement vreden, flytta laser på spetsen.
- Finjustera laser och spegelkontroller tills summan signalen visas på mikroskopet är maximerad (värde = 4-6).
- Justera vinkeln på kvadranten diod med vreden på vänster baksida och den övre vänstra sidan av skanningshuvudet för att sänka de vertikala och horisontella nedtryckning visas på mikroskopet så nära noll som möjligt (± 0,1).
- I programmet väljer du förvärvsalternativ. På ett minimum, välj höjd (spår och återgång), toppkraft fel, och deformation. De andra alternativen är användarberoende och kan skräddarsys utifrån den specifika information som önskas av experimentalist.
- Välj "line" för RT Plane Fit i varje förvärvsfönstret. Välj "none" för OT Plane Fit i höjd fönster. Ställ in X och Y offset och skanningsvinkeln till noll, om det inte redan gjort.
- Ställ in skanningshastighet på 1 Hz, provet per linje till 256, den ScanAsyst auto kontrolltill individ, och ScanAsyst auto Z gräns för off. Ändra Z gräns till 500 nm. Ange skanningsstorlek till 1 pm.
- Klicka engagera. Vid denna punkt närmar sig spetsen ytan. Medan spetsen närmar sig, observera Z piezo spänningsändring i det nedre vänstra hörnet av skärmen. Om spetsen går utanför intervallet, dra spetsen och åter förhållningssätt. Om detta inte lyckas, kan spetsen behöva ändras för att få en lyckad strategi. När spetsen är aktiverad, kommer raderna börjar visas på var och en av de förvärvs fönster som kommer att komponera en bild.
- Ta bilder av glimmer på 1 x 1 um och zooma in långsamt så att glimmer ytan är ren och plan. Klicka kontinuerlig avskiljning för att spara bilder så som de visas. Zooma in och flytta runt på ytan som önskas.
4. Protein Deposition och Beredning av prov för Imaging
- Skaffa renat protein prov 38 och hålla på is. Vid förvaring i en frys, tina prov påis under 5 min.
- Späd proteinet till 0,0010 mg / ml med användning av kylda avbildning buffertlösning. Avbildnings buffert som användes här är 15 mM Tris-HCl (pH = 8,0), 150 mM NaCl och 15 mM MgCl2.
- Fyll en 4 kammare (100 x 15 mm) petriskål med kylda bildbuffertlösning. Fyll varje kammare med åtminstone 5 ml lösning. Blanda försiktigt den utspädda proteinlösningen med spetsen bifogas mikropipett.
- Apply 200 pl av den utspädda proteinlösningen till ytan av glimmer redan förberett. Efter 30 sekunder, plocka upp protein / glimmer yta med de cirkulära pincett (skiv gripare). Håll provet parallellt med laboratoriebänk.
- Håll provet omedelbart doppa provet i buffertlösningen som finns i den första kvadranten i petriskålen (steg 4.2) och samtidigt säkerställa att provet är parallell med bassängen i petriskål. Efter 1 sekund, ta provet.
- Att fortsätta hålla provet parallellt med bassängenpetriskålens, upprepa steg 4.5 för de återstående tre kvadranter.
- Placera skivan på en torr dammfri trasa för att suga upp fukt och överföra disken på scenen i mikroskop. Rör inte själva med trasan. Låt inte torkas provet.
- Upprepa steg från 3,6 till 3,16.
5. Bild Proteiner på Mica
- Klicka på kryssparametrar rutan på den vänstra sidan av skärmen. Våren storlek och spetsradie bör fastställas baserat på spetsen som används.
- Klicka engagera. I likhet med glimmer avbildningsprocessen (steg 3.17), observera z-piezo fönster som spetsen närmar sig.
- Låt skannern till bilden i samma område under minst två på varandra följande passager. Klicka kontinuerlig avskiljning för att spara varje bild in.
- Flytta scannern till en ny region och / eller ändra bildstorleken enligt önskemål.
- Efter den automatiserade programvaran har justering avscanningsparametrar för en viss bildstorlek, stänga av programvaran av.
- Manuellt justera avsökningshastighet, z gräns, antal linjer, och spänning i syfte att finjustera fokusering av bilden. Om bilden blir för långt ur fokus, slå programvara igen för att återgå till startpositionen. För att öka upplösningen på en bild när du zoomar in på ett protein, minska skanningshastighet och öka antalet linjer proportionellt.
- Efter experimentet, rengör det vätske cell med 100% etanol och skölj med DI H2O Låt vätskan cellen att fullständigt torr.
- Öppna data programvara för att bearbeta rådata bilder. Först platta till bilden genom att klicka på ikonen Lägg samman. Välj Zero e ordningen och klicka verkställa. Beroende på bilden, kanske ett plan passning behövas för att få en tillräckligt platt bild. I så fall väljer passningen ikonen planet och rita ett plan av ett platt område i bilden med markören. Klicka exekvera. Upprepa vid behov
- Select fliken tvärsektion för att mäta dimensionerna hos proteinet. Rita en linje med markören flyttas den över molekylen eller område som ska analyseras. Upprepa för flera områden och programmet kommer att generera en överlagring. Exportera bild eller de uppgifter som använts för att generera bilden i ett format som är kompatibelt med andra program och ritprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa AFM-bilder av en fotoreceptor-protein, P3, i dess ljus-anpassat tillstånd presenteras i Figurerna 3 och 4. En färsk klyvs glimmer substrat (Figur 3A) är en lämplig, plan yta för protein adsorption. Samla en bild av ren glimmer som en negativ kontroll är viktig av flera skäl. Först, försäkrar den vätske cellen ren och inga restmaterial från tidigare experiment förorenar ytan. För det andra, testar det kvaliteten av sonden. Om sonden är smutsig eller deformerat, kommer detta att visas i bilden som ränder eller framställa sig som brus. Slutligen bekräftar en ren glimmerbild sonden kan lämpligen ögonen öppna för framtida experiment.
Enkelfotoreceptorprotein dimerer kan observeras med användning PeakForce QNM om ytan täckning är lämplig (Figur 3B, C). Pilar signalerar enskilda dimerer; asterisken betecknar en proteinaggregat. DenKoncentrationen av proteinprovet, avsättningstiden och jonstyrkan av avbildnings buffert påverka yttäckning. 23 För en hög distribution av enstaka molekyler, mycket utspädda lösningar med korta deponeringstider krävs. Till exempel, en fördubbling av avsättningstiden ger en hög distribution av ännu större aggregat. Om proteinkoncentrationen ökas till 0,100 mg / ml, en tunn film av fotoreceptorer observeras utan att modifiera avsättningstiden eller buffert jonstyrka.
Använda bildanalys programvara, kan de tvärsektioner av proteinerna mätas efter att bilden är tillplattad (Figur 4). De tvärsnitt ger xy-uppgifter med motsvarande mått höjd. Dessa mätningar kan användas för att ge strukturella detaljer, interaktioner protein / yta, mekanisk hållfasthet, etc. xy-data kan invecklade av AFM sonden; Emellertid kan denna effekt minimeras genom att använda en skarpare sond. Faktum är att chois av sond är en delikat balans mellan en acceptabel mängd av faltning och motståndet hos det bildförsedda materialet till skada genom en skarp sond. Tips faltning kan också räknas bort från bilden, om nödvändigt, genom att använda lämplig mjukvara.
Dessa bilder kan direkt jämföras med tidigare publicerade bilder som samlats med hjälp av gäng-mode AFM. 20 De uppmätta dimensioner P3 på glimmer använder PeakForce QNM ligger inom 5% av värden erhållna med knacka-mode AFM.
Figur 1 Vätske Cell Atomic Force Microscopy. (A) Laser, fribärande, sond och ytan inriktning. Sonden och fribärande sitter på insidan av flytande cellen. (B) Flytande cell. Sonden, fribärande och prov är helt nedsänkt i vätskan. (C) Komplete aggregatet. Den flytande cell är ansluten till en mikrometer. Bilden visar det optiska huvudet och skanner i förhållande till vätske cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. PeakForce Kvantitativ Nanomechanical Property Mapping Detta är en illustration för en liten toppkraft (A) Approach (B) Gå till kontakt (C) Peak Force (D) Vidhäftning (E) Kör.. Figuren reproducerades och anpassats med tillstånd. 15
Figur 3 Atomic Force Microscopy i P3 på Mica. (A) Bild av ren glimmer (1 x 1 mikrometer). (B) Bild (1 mm x 1 mikrometer) i P3 används på glimmer. Pilarna anger exempel på enstaka protein dimerer. Asterisken betecknar ett aggregat av protein dimerer. (C) Bild (170 x 170 nm) av två protein dimerer med en tre-dimensionell nedfällning av en enda dimer. Den cirkumflex betecknar vilket protein dimer finns i infällda. Alla bilder är tagna i närvaro av bildbufferten (proteinkoncentration = 0,0010 mg / ml för deponering). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 tvärsnitts Analys av P3 på Mica. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM är en svepspetsmikroskopi metoden helt kapabel att avbilda proteiner och andra biologiska makromolekyler i fysiologiskt relevanta förhållanden. I jämförelse med röntgenkristallografi och NMR, är en begränsning av AFM dess oförmåga att uppnå samma upplösning, särskilt upplösning sidled. Vid användning av AFM för att analysera en molekyl på alla ytor, måste effekterna av ytan och sonden på bilden av molekylen också beaktas när data analyseras. Deconvoluting av sonden påverkan på det förvärvade bilden kan kompletteras med lämplig mjukvara. Att utveckla teoretiska modeller för att jämföra med experimentella resultat kan också visa sig vara ganska bra.
I detta papper, AFM-bilder av en bakteriell rödljusljusmätare, RpBphP3 (P3), presenteras (Figur 3). Även beskrivningarna av mikroskopenheten och programvaran drift är specifika för den speciella instrumentmodell som används, glimmeroch proteinprov förberedelser är generella och kan tillämpas på alla AFM experiment.
Några viktiga steg i detta protokoll måste följas för att erhålla det önskade proteinet täckningen på glimmer ytan. För det första måste den utspädda proteinlösningen vara blandades försiktigt innan det appliceras på glimmer ytan (steg 4,3). På grund av den höga molekylvikten hos P3, är avsättningslösningen ganska kolloidal; därför, sedimenterar P3 till botten av röret med tiden vilket gör lösningen icke homogen. En mild stir åtgärder i denna fråga. För det andra, när proteinet används, måste ytan sköljas för att avlägsna eventuella löst bundna molekyler (steg från 4,5 till 4,6). Om löst bundet P3 förblir på ytan, kommer molekylerna antingen släppas in i lösningen, när den flytande cellen fylls med buffertlösning och / eller tas upp av AFM sonden under experimentet. Båda dessa händelser hindrar en framgångsrik bildexperiment. Omvätske cellen blir förorenad med P3, måste den plockas isär och rengöras grundligt. Om AFM sonden plockar upp en molekyl, vanligtvis måste den bytas ut eller bildkvalitet offras. Slutligen är ett förfarande för sköljning av proteinprovet kritisk för erhållande av utmärkta bilder. Mica är en icke-selektiv yta till P3; Därför bör molekylerna tas fram för att vara orienterade slumpmässigt. Metoden för sköljning beskrivs i protokollet är ett sätt att undvika att omgruppera de molekyler på ytan i en enda orientering. Det viktiga är att alltid hålla provet våta och undvika att hålla ytan i vinkel och bokstavligen spraya ytan med buffert. Om provet sköljs genom doppning, medan du håller den parallellt med bassängen i en petriskål, är den snedvridning av P3 på ytan genom kraftströmmar av buffertlösningen minimeras.
Alla delar till flytande cellen, sond, scanner, och optiskt huvud är mycket känslig och måste hanteras varsamt. Den springs som håller skannern och optiska huvudet tillsammans är mycket starka. Det är absolut nödvändigt att hålla en hand på skannern vid montering eller dissembling någon av delarna. För PF-QNM med ScanAsyst programvara som beskrivs i protokollet, är det viktigt att stänga av program för automatiserad kontroll av Z-limit och ställa detta värde på minst 500 nm om den ursprungliga skanningsstorleken är 1 pm (steg 3.16) . Detta skyddar skannern om ytan har blivit oväntat grov eller har blivit förorenat. När en bild har samlats in och det bekräftas att det avbildade området är slät, kan Z-gränsen justeras nedåt manuellt för att uppnå högre upplösning. Det är viktigt att justera Z-gränsen tillbaka till åtminstone 500 nm när skannern flyttas till ett nytt område på ytan eller om spetsen dras tillbaka av någon anledning.
Även om denna uppsats har fokuserat på att använda PF-QNM att få topografiska bilder av hög kvalitet, kan själva metoden ger enbibliotek med ytterligare information om mekanisk hållfasthet och flexibilitet ytstrukturer. Denna funktion kan leda till ytterligare insikter om funktionalitet genom att välja lämpliga kanaler under experimentet. 16,18 Med lämpliga förändringar i koncentrationen av avsättningslösningen och / eller ytan, kan denna metod vara generella för att använda PF-QNM att undersöka biologiska makromolekyler av vätskecell AFM. Med automatiserad hjälp av programvara kan elever i övre nivå vetenskapliga kurser med någon tidigare erfarenhet av AFM slutföra en vätskecell AFM experiment mycket snabbare än med den traditionella tapping-mode AFM. Eleverna kan uppleva grunderna i AFM och få en smak av den tvärvetenskapliga forskning som möjliggjorts genom denna kraftfulla teknik inom en typisk 3-4 tim laboratoriesektionen tidspress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NSF-MRI-programmet (CHE: 1.229.103) är känd för att finansiera inköp av nya styrelektronik, programvara, flytande celler och annan utrustning som behövs för att montera en dubbel AFM / STM. Vi erkänner de delade resurser på The University of Chicago NSF-MRSEC programmet (DMR-0.820.054) för hjälp med AFM instrumentering, utbildning och bildhantering, samt för instrumenttiden görs tillgänglig av Materials Research Faciliteter Network (DMR-0.820.054). Vi tackar särskilt Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller, och professor Ka Yee Lee för att välkomna våra elever inför finansieringen av NSF-MRI förslag som förde den nödvändiga instrument till vårt campus. Vi erkänner finansiering från en avdelning III STEM bidrag (ID: P031C110157) delas Northeastern Illinois University som gav sommarforskningsstipendier för studenter och lärare samt stöd för förbrukningsmaterial. Slutligen erkänner vi Bruker-Nano, Inc. för fortsatt instrumentellt stöd och om tillstånd att reproduce en plot som visar mekanismen för PeakForce QNM och att använda ordet ScanAsyst att beskriva automatiserad programvara.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , Schrodinger, LLC. Forthcoming.
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
