Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Isolering og udtagelse af murint Aorta; Et alsidigt Teknik I undersøgelsen af ​​kardiovaskulær sygdom

Published: November 24, 2014 doi: 10.3791/52172

Introduction

Aorta spiller en central rolle i den kardiovaskulære funktion forsyne kroppen med iltet blod og lignende til andre dele af kroppen, er modtagelige for sygdomme. Almindelige aorta sygdomme omfatter åreforkalkning og aneurisme, som er resultatet af genetiske og miljømæssige faktorer, herunder kost, rygning og stillesiddende livsstil 1. Aterosklerose er aflejringen af et calcium- og lipid-baserede plak til aortavæggen typisk findes hos patienter med kronisk hyperlipidæmi 2. Aneurismer er karakteriseret ved nedbrydning af de strukturelle komponenter i aorta og udtynding af karvæggen, efterfulgt af en forøget diameter som i sidste ende kan føre til brud 3.

Dyremodeller er vigtige værktøjer anvendt til at undersøge mekanismen af ​​sygdom og effektiviteten af ​​potentielle behandlinger. Almindelige anvendte dyremodeller i kardiovaskulær forskning specifikt forskning undersøger vaskulære og metaboliske forstyrrelseromfatter genetisk modificerede mus til at ændre lipidniveauer såsom apolipoprotein E genet knockout og lavdensitetslipoprotein receptorgen knockout-mus 4. De fleste metoder til at evaluere mekanismer for sygdom og effekten af ​​behandlingen vil omfatte isolering og udskæring af aorta.

Når aorta er lokaliseret og isoleret, kan morfometriske analyse bestemmes, såsom tilstedeværelsen af aneurisme, typisk defineret som en stigning i diameter på 5 mere end 50%. Efter nødvendigt situ analysen er færdig, kan aorta udskæres til yderligere analyse. En udskåret aorta kan lynfrosset at foretage molekylære undersøgelser såsom protein og / eller genekspression assays eller fastgøres ved hjælp af 4% paraformaldehyd og senere indlejret, snittet og farvet til histologisk analyse. Histologisk analyse af aorta kan påvise almindelige funktioner i aorta sygdom, såsom strukturel nedbrydning, plaque dannelse, og infiltration af leukocytter <sup> 6,7. Derudover kan en udskåret aorta anvendes til at isolere primære cellelinjer, herunder endotelceller og glatte muskelceller, som efterfølgende kan anvendes til en række forskellige in vitro-undersøgelser 7.

I øjeblikket er der ikke andre metoder til at levere denne grundige karakterisering af aorta sygdom samt give forskerne redskaber til yderligere at studere hjertekarsygdomme. Afbildningsmodaliteter såsom magnetisk resonans, computertomografi og ultrasonografi er de nærmeste metoder til morfologisk evaluering aorta, men dette er vanskeligt i små dyr og opnå en enhed med passende teknologi er dyrt 8. Immortaliserede cellelinjer kan købes til at undersøge potentielle mekanismer for sygdom og effektiviteten af terapier, men kunstige karakter af disse celler er begrænsende i at studere virkningerne på cellen livscyklus og apoptose 9.

Det overordnede mål meddette manuskript er at demonstrere den sterile isolation og udtagelse af murine aorta i undersøgelsen af ​​hjertekarsygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Cincinnati og i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, revideret 1996).

1. Forberedelse af Mouse

  1. Aflive ved at udsætte dyret for en supraterapeutisk dosis af bedøvelsesmiddel, isofluran indåndes til virkning. Kontroller primær dødshjælp via tå pinch som en skadelig stimulus. Sekundær fremgangsmåde til eutanasi membran skæring, vil forekomme i en kommende trin. Alternative metoder kan anvendes ydes eutanasi opnås.
  2. Sanitizie den ydre overflade af musen ved sprøjtning pelsen langs den abdominale region, hvor de første snit vil blive foretaget med 70% ethanol til punktet af fugt, således at pelsen er våd med ethanol og eventuelle løse / tørre hår ikke indtaster regionen.
  3. Læg musen på en surgisk bord i liggende stilling med øvre og nedre lemmer forlænget udad.
  4. Sikker vedhæng til bestyrelsen ved hjælp af kirurgisk tape.

2. Isolering af hjerte og aorta

  1. Efter korrekt positionering af mus pincet til at lokalisere og isolere abdominal hud lige ringere xiphoideus proces af brystbenet.
  2. Opret spænding ved at løfte huden lige op og bruge en saks til at fjerne overfladiske hud, udsætter den overlegne del af bughinden og ringere del af brysthulen.
  3. Indtast bughulen ved at løfte formet som et sværd proces og gøre laterale indsnit bare ringere end den proces, langs de subcostal margener.
  4. Dissekere op i brysthulen, som går gennem membranen, og sørg for ikke at lacerate hjertet eller større blodkar.
  5. Forlæng de laterale indsnit foretaget i trin 2.3 kranialt at fjerne den forreste del af brystkassen. Hvisnødvendigt fri hjertet fra den forreste brystvæggen ved stump dissektion.
  6. Rengør brysthulen af ​​uvedkommende blod og væske ved hjælp af steril gaze til at absorbere materiale. Når området er mere synlige, fjerne lungerne til bedre at udsætte hjerte og aorta.

3. Perfusion of Heart og Aorta

BEMÆRK: For at opnå blod via hjertepunktur, så gør det lige før dette trin.

  1. Fyld en 10 cc sprøjte med 10 ml sterilt iskold 1x phosphatbufferopløsning (PBS), og fastgør en 25 gauge nål til sprøjten.
  2. Sæt forsigtigt nålen ind i venstre ventrikel af hjertet.
  3. Skær det højre atrium for at afhjælpe trykopbygning fra perfusion. Perfundere indholdet af sprøjten i musen over 2-3 min.
  4. Brug steril gaze på åbningen i højre atrium for at absorbere perfusion fluid.

4. Isolering og Excision af aorta

  1. Ved afslutningen af ​​PErfusion, brug steril gaze til at absorbere eventuel resterende væske uklarhed synsfeltet i brysthulen.
  2. Udsætte gastrointestinale indhold ved at skære kaudalt gennem bugvæggen, udvidelse snittet til det suprapubiske område. Forlæng snittet videre mod de nedre lemmer bilateralt at skabe hudlapper, som kan holdt nede eller fjernede.
  3. Fjern lapper i lever, bugspytkirtel, mave, milt og indvolde til bedre visualisere aorta. Vær forsigtig, når dissekere nær perirenalt region, som aorta er overfladisk på de grene af nyrearterierne.
    BEMÆRK: Udfør dette trin i en præcis og matriculate måde som mave-tarmkanalen er rig med bakterier, hvilket øger tilbøjeligheden til forurening.
  4. Skyl med 1x PBS og fjerne al væske ved absorption med en steril gaze.
  5. Brug sterile microscissors og microforceps, adskille aorta fra rygsøjlen dorsalt og spiserøret ventralt.Det er bedst at anvende stump dissektion og udnytte et dissektionsmikroskop for dette.
    BEMÆRK: I isolere aorta, starter kaudalt ved bækkenforgreningen og flytte kranialt rengøring og adskillelse af aorta fra den dorsale overflade af hulrummet eller starte kranialt på halspulsåren og brachiocephale arterier dissekere kaudalt. Enten metode er hensigtsmæssig, og er op til forskerne komfort.
  6. Fjern perivaskulær fedtvæv med fint microscissors være sikker på ikke at fjerne en del af aortavæggen. Dette er afgørende for at minimere risikoen for fibroblast forurening ved dyrkning aorta glatte muskelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved afslutningen af proceduren, vil der være en intakt aorta stammer fra hjertet, faldende i thorax og bughule, med nyrearterierne stadig er fastgjort (figur 1A). Herfra aorta afbildes in situ at kvantificere morfometriske ændringer, som er diagnostisk i studiet af abdominale aortaaneurismer (figur 1B og 1C). Efterfølgende kan aorta fjernes, fikseres og farves for at se på histologiske ændringer. En generel og fælles plet af aorta er hematoxylin og eosinfarve (figur 2A og 2B). Derudover kan den strukturelle integritet af aorta kvalitativt kvantificeres ved hjælp Verhoff van Geison farvning at se på elastin bånd (figur 2C og 2D). I stedet for at opnå en histologisk analyse, investigator kan blinke fryse aorta til efterfølgende protein og ribonukleinsyre EXPREfission. Den sidste mulighed for investigator er at bruge aorta for at opnå celleisolering primære. Disse celler kan dyrkes i kultur (figur 3A) og anvendes til en række af in vitro undersøgelser, herunder undersøgelser levedygtighed (figur 3B) og protein lokalisering (figur 3C).

Figur 1
Figur 1. In situ repræsentative billeder af murine aorta. (A) afbildning af normal mus anatomi efter isolering af aorta herunder hjertet og nyrerne. (B) Forstørret billede af en normal intakt murint abdominal aorta. (C) Forstørret billede af en syg abdominal aorta med en aneurisme i den suprarenale region. Klik her for at se en større udgave af ther figur.

Figur 2
Figur 2. Histologisk analyse af murine aorta. (A) repræsentativt billede af en normal hematoxylin og eosinfarve af en sund suprarenal aorta ved 20X forstørrelse. (B) repræsentativt billede af en aneurismal suprarenal aorta med intramuralt thrombus efter hematoxylin og eosinfarve ved 20X forstørrelse. (C) repræsentativt billede af en Verhoff van Geison pletten, fremhæver de elastin bånd af en normal suprarenal aorta ved 10X forstørrelse. (D) Repræsentant billede af en Verhoff van Geison pletten fremhæve de elastin bånd af en suprarenale aorta udvikle sygdom bemærket af udtynding og striating af elastin bands og fortykkelse af adventitiale lag. Venligst click her for et større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Primære aorta myocytter dyrket fra aorta. (A) repræsentativt billede af primære aorta myocytter i kultur på 20X forstørrelse opnået fra den abdominale aorta. (B) repræsentativt billede af primære aorta myocytter under en trypanblåteksklusion assay efter en 500 um behandling af H 2 O 2 ved 20X forstørrelse opnået fra den abdominale aorta. (C) Repræsentant billede af en immunhistokemisk farvning for alpha actin i ubearbejdet isolere aorta glatte muskelceller fra den abdominale aorta. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne har ingen bekræftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% ethanol Fisher 07-678-001
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Surgical tape 3M 1527-1
Sterile gauze Dukal Corporations 1312
25 gauge needle BD 305122
10 ml syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), 28-292 (2014).
  2. Ross, R., Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 193 (4258), 1094-1100 (1976).
  3. Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79 (2), 176-180 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
  5. Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142 (12), 1291-1299 (1995).
  6. Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5 (3), 229-233 (1991).
  7. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  8. Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88 (6), 550-551 (2001).
  9. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289 (2013).
  10. Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45 (1), 192-198 (2007).

Tags

Medicine kardiovaskulære aorta murine isolation kirurgi excision anatomi
Isolering og udtagelse af murint Aorta; Et alsidigt Teknik I undersøgelsen af ​​kardiovaskulær sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., More

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (93), e52172, doi:10.3791/52172 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter