Isolement et Excision de murin Aorte; Une technique polyvalente dans l'étude des maladies cardiovasculaires

Introduction

L'aorte joue un rôle pivot dans la fonction cardiovasculaire fournissant le corps avec le sang oxygéné et d'autres parties semblables à de l'organisme, est sensible à la maladie. Maladies aortiques communs incluent l'athérosclérose et anévrisme, qui sont les résultats de facteurs génétiques et environnementaux, y compris l'alimentation, le tabagisme et la sédentarité ^1. L'athérosclérose est le dépôt de calcium et une plaque à base de lipides sur la paroi aortique typiquement trouvés chez des patients atteints d'hyperlipidémie chronique ^2. Les anévrismes sont caractérisés par une dégradation des composants structuraux de l'aorte et l'amincissement de la paroi du vaisseau, suivie d'une augmentation de diamètre qui peut finalement conduire à la rupture ^3.

Les modèles animaux sont des outils importants utilisés pour étudier le mécanisme de la maladie et l'efficacité des traitements potentiels. Modèles animaux couramment utilisés en recherche cardiovasculaire, la recherche spécifiquement enquête vasculaires et métaboliquesinclure des souris génétiquement modifiées pour modifier les taux de lipides tels que le knock-out de gène de l'apolipoprotéine E et de lipoprotéines de faible densité des souris knock-out du gène du récepteur ^4. La majorité des méthodes pour évaluer les mécanismes de la maladie et l'efficacité de la thérapie comprendrait l'isolement et l'excision de l'aorte.

Une fois que l'aorte est localisé et isolé, l'analyse morphométrique peut être déterminée, comme la présence de l'anévrisme, généralement définie comme une augmentation supérieure à 50% dans ⁵ diamètre. Après nécessaire analyse in situ est terminée, l'aorte peut être excisé pour une analyse ultérieure. Une aorte excisée peut être surgelé de mener des études moléculaires tels que les protéines et / ou des essais d'expression génique ou fixe en utilisant 4% de paraformaldehyde, puis incorporé, en coupe et colorées pour l'analyse histologique. L'analyse histologique de l'aorte peut démontrer des caractéristiques communes de la maladie aortique tels que la dégradation structurelle, la formation de plaque, et l'infiltration de leucocytes <sup> 6,7. En outre, une aorte excisée peut être utilisé pour isoler des lignées de cellules primaires y compris des cellules endotheliales et des muscles lisses qui peuvent ensuite être utilisés pour une variété d'études in vitro ^7.

Actuellement, il n'y a pas d'autres méthodes pour fournir cette caractérisation en profondeur de la maladie aortique ainsi que de fournir aux chercheurs des outils d'étudier plus avant les maladies cardiovasculaires. Les modalités d'imagerie telles que l'imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et l'échographie sont les plus proches des méthodes pour évaluer morphologiquement l'aorte, mais ce est difficile chez les petits animaux et d'obtenir un dispositif avec la technologie adéquate est cher ^8. Les lignées cellulaires immortalisées peuvent être achetés pour étudier les mécanismes potentiels de la maladie et l'efficacité des thérapies, mais le caractère artificiel de ces cellules limitent à étudier les effets sur le cycle de vie cellulaire et l'apoptose ^neuf.

L'objectif global dece manuscrit est de démontrer l'isolement stérile et l'excision de l'aorte murin dans l'enquête sur les maladies cardiovasculaires.

Protocol

Toutes les procédures d'animaux ont été effectués avec l'approbation du soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université de Cincinnati et en conformité avec le Guide de soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996).

1. Préparation de la souris

1. Euthanasier en exposant l'animal à une dose d'anesthésique suprathérapeutique, isoflurane inhalé à effet. Vérifiez l'euthanasie primaire par pincement de l'orteil comme un stimulus nociceptif. Méthode secondaire de l'euthanasie, la coupe de la membrane, se produira dans une étape prochaine. D'autres méthodes peuvent être utilisées euthanasie accordé est obtenu.
2. Sanitizie la surface externe de la souris par pulvérisation de la fourrure le long de la région abdominale, où les réductions initiales seront faites, avec 70% d'éthanol au point d'humidité, de sorte que la fourrure est mouillé avec de l'éthanol et des poils / sec ne entrent pas la région.
3. Placez la souris sur une surgique conseil en décubitus dorsal avec des appendices supérieures et inférieures étendu vers l'extérieur.
4. Appendices sécurisés au conseil l'aide de ruban chirurgical.

2. Isolement du Cœur et de l'aorte

1. Après un bon positionnement de la souris, utiliser une pince pour localiser et isoler la peau abdominale juste inférieure à la pointe du sternum du sternum.
2. Créer des tensions en soulevant la peau vers le haut et utiliser des ciseaux pour enlever la peau superficielle, exposant la partie supérieure du péritoine et de la partie inférieure de la cavité thoracique.
3. Entrez la cavité péritonéale en soulevant le processus de xiphoïde et faire des incisions latérales juste inférieurs au processus le long des marges sous-costale.
4. Disséquer dans la cavité thoracique, en passant par le diaphragme, en étant sûr de ne pas déchirer le coeur ou des gros vaisseaux sanguins.
5. Étendre les incisions latérales faites à l'étape 2.3 crânienne pour enlever la partie antérieure de la cage thoracique. Sinécessaire, libérer le cœur de la paroi thoracique antérieure utilisant dissection.
6. Nettoyez la cavité thoracique de sang étrangère et fluide en utilisant la gaze stérile pour absorber la matière. Une fois que la zone est plus visible, retirez les poumons afin de mieux exposer le coeur et l'aorte.

3. perfusion du cœur et de l'aorte

NOTE: Pour obtenir le sang par ponction cardiaque, le faire juste avant cette étape.

1. Remplir une seringue de 10 cc avec 10 ml de solution de tampon de phosphate de glace stérile 1x froid (PBS), et fixer une aiguille de calibre 25 à la seringue.
2. Insérez délicatement l'aiguille dans le ventricule gauche du cœur.
3. Couper l'oreillette droite pour atténuer l'accumulation de la pression de perfusion. Perfuser le contenu de la seringue dans la souris sur 2-3 min.
4. Utilisation de la gaze stérile à l'ouverture dans l'oreillette droite à absorber le fluide de perfusion.

4. Isolement et Excision de l'aorte

1. À la fin de perfusion, utiliser une compresse stérile pour absorber tout liquide restant brouiller le champ de vision dans la cavité thoracique.
2. Exposer le contenu gastro-intestinaux en coupant caudalement travers la paroi abdominale, étendant l'incision à la zone sus-pubienne. Elargir l'incision de plus vers les membres inférieurs bilatérale pour créer lambeaux de peau qui peut être maintenu au sol ou excisées.
3. Retirez les lobes du foie, du pancréas, de l'estomac, la rate, les intestins et de mieux visualiser l'aorte. Faites attention lorsque vous disséquer près de la région péri-rénale, que l'aorte est superficielle aux branches des artères rénales.
   REMARQUE: Effectuez cette étape dans un précis et immatriculer manière que le tractus gastro-intestinal est riche avec des bactéries qui augmente la propension à la contamination.
4. Rincer la zone avec PBS 1x et enlever tout le liquide par absorption avec une gaze stérile.
5. Utilisation microciseaux et microforceps stériles, séparer l'aorte de la face dorsale de la colonne vertébrale et l'œsophage ventrale.Il est préférable d'utiliser dissection et en utilisant un microscope de dissection pour cela.
   NOTE: En isolant l'aorte, commencer caudale à la bifurcation iliaque et déplacer crânialement nettoyage et la séparation de l'aorte de la surface dorsale de la cavité crânienne ou commencer à les carotides et les artères de brachiocéphaliques dissection caudale. Chaque méthode est appropriée et à la chercheurs confort.
6. Retirez le tissu adipeux périvasculaire utilisant microciseaux fines en étant sûr de ne pas enlever une partie de la paroi aortique. Cela est essentiel pour minimiser le risque de contamination lors de la mise en culture de fibroblastes de cellules musculaires lisses aortiques.

Representative Results

Après achèvement de la procédure, il y aura une aorte intacte provenant du cœur, diminuant dans les cavités thoracique et abdominale avec les artères rénales encore attachées (figure 1A). De là, l'aorte peut être imagé in situ pour quantifier les changements morphométriques qui sont diagnostic dans l'étude des anévrismes aortiques abdominaux (Figure 1B et 1C). Par la suite, l'aorte peut être retiré, fixées et colorées d'examiner les changements histologiques. Une tache générale et commune de l'aorte est l'hématoxyline et l'éosine (figure 2A et 2B). En outre, l'intégrité structurelle de l'aorte peut être quantifiée en utilisant qualitativement Verhoff van Geison coloration de regarder les bandes d'élastine (figure 2C et 2D). Au lieu d'obtenir une analyse histologique, l'enquêteur peut clignoter geler l'aorte pour la protéine ultérieure et EXPRE de l'acide ribonucléiquession. La dernière option pour le chercheur est d'utiliser l'aorte pour obtenir l'isolement cellulaire primaire. Ces cellules peuvent être cultivées en culture (figure 3A) et utilisés pour une variété d'études in vitro, y compris des études de viabilité (figure 3B) et la localisation des protéines (figure 3C).

Figure 1. En images représentatives in situ de l'aorte murin. (A) Représentation de l'anatomie de la souris normale après l'isolement de l'aorte y compris le cœur et les reins. (B) image d'une aorte abdominale murin intacte normale agrandie. (C) image d'une aorte abdominale malade agrandie avec un anévrisme dans la surrénale région. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de eest la figure.

Figure 2. L'analyse histologique de l'aorte murin. (A) d'image représentant d'un hématoxyline et éosine normale d'une aorte surrénale sain à 20X. (B) de l'image représentant d'une aorte surrénale anévrisme avec thrombus intra-muros après hématoxyline et éosine à 20X. (C) d'image représentant d'un Verhoff van Geison tache, soulignant les bandes d'élastine d'une aorte surrénale normale à un grossissement de 10X. (D) d'image représentant d'une tache Verhoff van Geison soulignant les bandes d'élastine d'une aorte développer une maladie surrénale noté par l'amincissement et striant de bandes d'élastine et épaississement de la couche adventice. Se il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. myocytes aortiques primaires cultivées de l'aorte. (A) d'image représentant des myocytes aortiques primaires en culture à 20X obtenu à partir de l'aorte abdominale. (B) d'image représentant des myocytes aortiques primaires lors d'un bleu Trypan exclusion test après un traitement de 500 M de H ₂ O ₂ à 20X obtenu à partir de l'aorte abdominale. (C) d'image représentant d'une tache d'immunohistochimie pour l'alpha actine dans les cellules musculaires primaires lisses aortiques isolés de l'aorte abdominale. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical tape	3M	1527-1
Sterile gauze	Dukal Corporations	1312
25 gauge needle	BD	305122
10 ml syringe	BD	309604