Isolasjon og Eksisjon av murine Aorta; En allsidig teknikk i Study of Cardiovascular Disease

Introduction

Aorta spiller en sentral rolle i kardiovaskulær funksjon å forsyne kroppen med oksygenrikt blod og lignende til andre deler av kroppen, er mottakelig for sykdom. Vanlige aorta sykdommer inkluderer aterosklerose og aneurisme, som er resultatet av genetiske og miljømessige faktorer, inkludert kosthold, røyking og stillesittende livsstil ^en. Aterosklerose er avsetningen av et kalsium- og lipid-basert plakk til aortaveggen vanligvis finnes hos pasienter med kronisk hyperlipidemi ^2. Aneurismer er kjennetegnet ved nedbrytning av strukturelle komponenter i aorta og tynning av karveggen, etterfulgt av en økt diameter, som kan til slutt føre til brudd ^tre.

Dyremodeller er viktige verktøy som brukes for å studere mekanismen for sykdommen og effekten av mulige behandlinger. Vanlige dyremodellene i kardiovaskulær forskning, spesielt forskning undersøke vaskulære og metabolske forstyrrelseromfatter genmodifiserte mus å endre lipid nivåer som apolipoprotein E genet knockout og lav tetthet lipoprotein reseptorgenet knockout mus ^fire. De fleste av fremgangsmåter for å evaluere mekanismer for sykdoms og effekt av behandling ville omfatte isolering og fjerning av aorta.

Når aorta er lokalisert og isolert, kan morfometrisk analyse bestemmes, slik som tilstedeværelse av aneurisme, vanligvis definert som en som er større enn 50% økning i diameter ^5. Etter nødvendig in situ analysen er fullført, kan aorta bli spaltet ut for videre analyse. Et utskåret aorta kan flash frosset å gjennomføre molekylære studier som protein og / eller genuttrykk analyser eller festes med 4% paraformaldehyde og senere innebygd, seksjonert og farget for histologisk analyse. Histologisk analyse av aorta kan demonstrere de vanligste funksjonene i aorta sykdom som strukturell degradering, plakk dannelse, og infiltrasjon av leukocytter <sup> 6,7. I tillegg kan et utskåret aorta brukes til å isolere primære cellelinjer inkludert endotelceller og glatte muskelceller som senere kan brukes for en rekke in vitro-studier ^7.

For tiden er det ingen andre metoder for å gi dette grundig karakterisering av aortic sykdom samt gir forskere med verktøy for å studere hjerte-og karsykdommer. Avbildningsmodaliteter så som magnetisk resonansavbildning, computertomografi og ultrasonografi er de nærmeste metoder for å evaluere morfologisk aorta, men dette er vanskelig i små dyr, og å skaffe en enhet med tilstrekkelig teknologi er dyre ^8. Udødeligcellelinjer kan kjøpes for å undersøke mulige mekanismer for sykdom og effekt av behandling, men den kunstige naturen av disse cellene er begrensende i å studere effekter på celle livssyklus og apoptose ^9.

Det overordnede måletdette manuskriptet er å vise den sterile isolasjon og fjerning av murine aorta i etterforskningen av hjerte- og karsykdommer.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Cincinnati og i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health (NIH publikasjon nr 85-23, revidert 1996).

1. Klar Mouse

1. Avlive ved å utsette dyret til en supraterapautisk dose av bedøvelse, isofluran inhalert til effekt. Verifisere primære dødshjelp via tå klype som en skadelig stimulus. Sekundær metode for aktiv dødshjelp, pessar skjæring, vil forekomme i en kommende trinn. Alternative fremgangsmåter kan benyttes gis eutanasi oppnås.
2. Sanitizie den ytre overflaten av musen ved å spraye pelsen langs mageregionen, hvor de første kuttene vil bli gjort, med 70% etanol til poenget med fuktighet slik at pelsen er våt med etanol og eventuelle løse / tørre hår ikke inn regionen.
3. Lå muse ut på en surBiological bord i liggende stilling med øvre og nedre vedheng utvidet utover.
4. Sikre vedheng til styret ved hjelp av kirurgisk tape.

2. Isolering av hjertet og aorta

1. Etter riktig posisjonering av musen, bruke pinsett for å lokalisere og isolere abdominal hud bare dårligere til xiphoid prosessen med brystbenet.
2. Skape spenning ved å løfte huden rett opp og bruke saks for å fjerne overfladiske hud, utsette den overlegne del av bukhinnen og mindreverdig del av brysthulen.
3. Skriv inn bukhulen ved å løfte xiphoid prosessen og gjøre side snitt bare dårligere til prosessen langs subcostal marginer.
4. Dissekere opp i brysthulen, går gjennom membranen, være sikker på ikke å lage rift i hjertet eller noen store blodkar.
5. Utvide den laterale snittene som er gjort i trinn 2.3 kranialt for å fjerne fremre delen av brystkasse. Omnødvendig, frigjøre hjertet fra den fremre brystveggen ved hjelp av stump disseksjon.
6. Rengjør brysthulen av overflødig blod og væske ved hjelp av steril kompress å absorbere materiale. Når området er mer synlig, fjerner lungene å bedre utsette hjertet og aorta.

3. Perfusjons for Hjerte- og Aorta

MERK: For å få blod via hjertestans punktering, gjør du det rett før dette trinnet.

1. Fyll en 10 cc sprøyte med 10 ml sterilt iskald 1x fosfatbufferløsning (PBS), og legge ved en 25 gauge nål til sprøyten.
2. Forsiktig stikk nålen inn i venstre hjertekammer av hjertet.
3. Skjær høyre atrium å lindre press buildup fra perfusjon. Perfuse innholdet i sprøyten inn i mus over 2 - 3 min.
4. Bruke steril kompress ved åpningen i høyre atrium å absorbere perfusjonsvæsken.

4. Isolasjon og Eksisjon av Aorta

1. Ved ferdigstillelse av perfusion, bruker sterilt gasbind for å absorbere eventuelle gjenværende væske clouding synsfeltet i brysthulen.
2. Utsett gastrointestinale innholdet ved å kutte caudally gjennom bukveggen, utvide snittet til suprapubisk området. Forlenge snittet videre mot underekstremitetene bilateralt å skape hud flaps som kan låste ned eller skåret.
3. Fjern de fliker av lever, bukspyttkjertel, mage, milt, tarmer og for bedre å visualisere aorta. Vær forsiktig når du dissekere nær perirenal regionen, som aorta er overfladisk på grenene av nyrearteriene.
   MERK: Utfør dette trinnet i en presis og innskrive måte som mage-tarmkanalen er rik med bakterier som øker tilbøyelighet for forurensning.
4. Skyll området med 1x PBS og fjerne all væske ved absorpsjon med en steril kompress.
5. Ved hjelp av sterile microscissors og microforceps, skille aorta fra ryggraden dorsally og spiserøret ventralt.Det er best å bruke stump disseksjon, og å benytte en disseksjon mikroskop for dette.
   MERK: I isolere aorta, starter caudally på hoftedelinger og flytte kranialt rengjøring og skille aorta fra framsiden av hulrommet eller starte kranialt på halspulsårene og brachiocephalic arterier dissekere caudally. Begge metodene er hensiktsmessig og er opp til forskere komfort.
6. Ta av perivaskulær fettvev hjelp av gode microscissors være sikker på ikke å fjerne en del av aorta. Dette er viktig for å minimalisere potensialet for fibroblast kontaminering ved dyrkning av aorta glattmuskelceller.

Representative Results

Ved gjennomføring av fremgangsmåten, vil det være et intakt aorta som stammer fra hjertet, og går inn i torakale og abdominale hulrom med nyrearteriene fortsatt festet (figur 1A). Herfra kan aorta avbildes in situ å kvantifisere morfometriske endringer som er diagnostisk i studiet av abdominale aortaaneurismer (Figur 1B og 1C). Deretter kan aorta fjernes, fiksert og farget for å se på histologiske forandringer. En generell og felles flekk av aorta er hematoxylin og eosin farging (figur 2A og 2B). I tillegg kan den strukturelle integriteten av aorta bli kvalitativt kvantifiseres ved hjelp av Verhoff van Geison farging for å se på elastin bånd (figur 2C og 2D). I stedet for å få en histologisk analyse, etterforskeren kan blinke fryse aorta for påfølgende protein og ribonukleinsyre EXPREssion. Det siste alternativet for etterforskeren er å bruke aorta å skaffe primære celle isolasjon. Disse cellene kan bli dyrket i kultur (figur 3A) og brukes til en rekke in vitro-studier, inkludert levedyktighet studier (figur 3B) og protein lokalisering (figur 3C).

Figur 1. In situ representative bilder av murine aorta. (A) Avbildning av normal mus anatomi etter isolering av aorta, inkludert hjerte og nyrer. (B) Forstørret bilde av en normal intakte murine abdominale aorta. (C) Forstørret bilde av en sykelig abdominal aorta med en aneurisme i suprarenal region. Klikk her for å se en større versjon av ther figur.

Figur 2. Histologisk analyse av muse aorta. (A) Representant bilde av en normal hematoxylin og eosin flekken av en sunn suprarenal aorta på 20X forstørrelse. (B) Representant bilde av en aneurismal suprarenal aorta med egenutført trombe etter hematoxylin og eosin flekken på 20X forstørrelse. (C) Representant bilde av en Verhoff van Geison flekken, fremhever elastin band av en normal suprarenal aorta på 10X forstørrelse. (D) Representant bilde av en Verhoff van Geison flekken utheving elastin band av en suprarenal aorta utvikle sykdom bemerket av tynning og striating av elastin band og jevning av adventitia lag. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Primære aorta myocytes dyrket fra aorta. (A) Representant bilde av primære aorta myocytes i kultur på 20X forstørrelse hentet fra abdominal aorta. (B) Representant bilde av primære aorta myocytes under en Trypan blå utelukkelse analysen etter en 500 mikrometer behandling av H ₂ O ₂ ved 20X forstørrelse hentet fra abdominal aorta. (C) Representant bilde av en immunhistokjemi flekken for alpha aktin i primær isolere aorta glatte muskelceller fra abdominal aorta. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical tape	3M	1527-1
Sterile gauze	Dukal Corporations	1312
25 gauge needle	BD	305122
10 ml syringe	BD	309604