Isolamento e excisão de Murino Aorta; A técnica versátil no Estudo de Doenças Cardiovasculares

Introduction

A aorta desempenha um papel crucial na função cardiovascular fornecendo o corpo com sangue oxigenado e outros semelhantes para partes do corpo, é susceptível à doença. Doenças da aorta comuns incluem aterosclerose e aneurisma, que são o resultado de fatores genéticos e ambientais, incluindo dieta, tabagismo e sedentarismo ^1. A aterosclerose é a deposição de cálcio e uma placa à base de lípidos para a parede da aorta, tipicamente encontrados em pacientes com hiperlipidemia crónica ^2. Os aneurismas são caracterizadas por degradação de componentes estruturais da aorta e adelgaçamento da parede do vaso, seguido por um aumento do diâmetro que poderia levar à ruptura ^3.

Os modelos animais são importantes instrumentos para estudar o mecanismo da doença e da eficácia de tratamentos potenciais. Modelos animais comuns utilizados na investigação cardiovascular, pesquisar especificamente investigar distúrbios vasculares e metabólicosincluem camundongos geneticamente modificados para alterar os níveis de lipídios, como knockout gene apolipoproteína E e lipoproteína de baixa densidade camundongos knockout gene receptor ^4. A maioria dos métodos para avaliar os mecanismos de doenças e a eficácia da terapia incluem o isolamento e a excisão da aorta.

Uma vez que a aorta é localizado e isolado, a análise morfométrica pode ser determinada, tal como a presença de aneurisma, tipicamente definido como um aumento superior a 50% no diâmetro de ^5. Depois necessário análise in situ é completa, a aorta pode ser excisado para análise posterior. Um aorta pode ser excisado flash congelados para conduzir estudos moleculares, tais como proteínas e / ou ensaios de expressão de gene ou fixo utilizando 4% de paraformaldeído e depois incorporado, seccionados e corados para análise histológica. A análise histológica da aorta pode demonstrar características comuns de doenças da aorta, como a degradação estrutural, a formação de placa, e infiltração de leucócitos <sup> 6,7. Além disso, uma aorta excisado pode ser utilizado para isolar as linhas de células primárias, incluindo células do músculo liso e endoteliais que podem posteriormente ser utilizados para uma variedade de estudos in vitro ^7.

Atualmente, não existem outros métodos para fornecer essa caracterização aprofundada das doenças da aorta, bem como fornecer aos pesquisadores ferramentas para estudar mais a doença cardiovascular. Modalidades de imagem, como ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultra-sonografia são os métodos mais próximos para avaliar morfologicamente a aorta, no entanto isso é difícil em pequenos animais e na obtenção de um dispositivo com tecnologia adequada é caro ^8. As linhas celulares imortalizadas pode ser comprado a investigar potenciais mecanismos da doença e da eficácia de terapias, no entanto, a natureza artificial destas células são limitantes no estudo dos efeitos sobre o ciclo de vida celular e apoptose ^9.

O objetivo geral doeste manuscrito é demonstrar a excisão e isolamento estéril da aorta de murino para a investigação de doenças cardiovasculares.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Cuidado e Uso Comitê da Universidade de Cincinnati animal Institucional e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996).

1. Preparar o mouse

1. Eutanásia por exposição do animal a uma dose supraterapêutica de anestésico, isoflurano inalado para o efeito. Verifique eutanásia principal via toe pitada como um estímulo nocivo. Método secundário da eutanásia, o corte de diafragma, irá ocorrer em uma próxima etapa. Métodos alternativos podem ser concedidos a eutanásia utilizado é obtido.
2. Sanitizie a superfície externa do rato por pulverização da pele ao longo da região abdominal, onde serão feitas as reduções iniciais, com etanol a 70% para o ponto de humidade de modo a que a pele é molhado com etanol e todos os cabelos secos soltas / não entram a região.
3. Coloque o mouse em uma surplaca cirúrgica em decúbito dorsal, com apêndices superiores e inferiores estendidos para fora.
4. Apêndices seguros ao Conselho, utilizando fita cirúrgica.

2. Isolamento do Coração e Aorta

1. Após o posicionamento adequado do mouse, utilize uma pinça para localizar e isolar a pele abdominal inferior apenas ao processo xifóide do esterno.
2. Criar tensão levantando a pele para cima e usar uma tesoura para remover a pele superficial, expondo a porção superior do peritônio e porção inferior da cavidade torácica.
3. Entrar na cavidade peritoneal, levantando o apêndice xifóide e fazer incisões laterais apenas inferior ao processo ao longo das margens subcostal.
4. Dissecar-se para dentro da cavidade torácica, passando pelo diafragma, sendo certo não lacerar o coração ou qualquer um dos principais vasos sanguíneos.
5. Estenda as incisões laterais feitas na etapa 2.3 cranial para remover a porção anterior da caixa torácica. Senecessário, libertar o coração da parede anterior do tórax usando dissecção romba.
6. Limpe a caixa torácica do sangue alheio e fluido, utilizando gaze estéril para absorver material. Uma vez que a área é mais visível, remoção dos pulmões para expor melhor o coração e aorta.

3. Perfusão de Coração e Aorta

NOTA: Para obter o sangue através de punção cardíaca, fazê-lo imediatamente antes desta etapa.

1. Encher uma seringa de 10 cc com 10 ml de gelo estéril solução tampão de fosfato frio 1x (PBS), e anexar uma agulha de calibre 25 para a seringa.
2. Inserir a agulha suavemente para o ventrículo esquerdo do coração.
3. Corte o átrio direito para aliviar o acúmulo de pressão de perfusão. Perfundir os conteúdos da seringa para dentro do rato de 2 - 3 minutos.
4. Use gaze estéril na abertura no átrio direito para absorver líquido de perfusão.

4. Isolamento e Excisão da Aorta

1. Após a conclusão da perfusion, utilizar gaze estéril para absorver qualquer fluido remanescente turvação do campo de visão dentro da cavidade torácica.
2. Expor os conteúdos gastrointestinais caudalmente cortando através da parede abdominal, que se estende da incisão para a região suprapúbica. Estender a incisão mais para os membros inferiores bilateralmente para criar retalhos de pele, que pode ser fixado para baixo ou excisadas.
3. Retire os lobos do fígado, pâncreas, estômago, baço e intestino para visualizar melhor a aorta. Tome cuidado ao dissecar perto da região perirrenal, como a aorta é superficial com os ramos das artérias renais.
   NOTA: Execute esta etapa em um preciso e matricular forma como o trato gastrointestinal é rica em bactérias, o que aumenta a propensão para a contaminação.
4. Lavar a área com 1x PBS e remover todo o fluido por absorção com uma gaze estéril.
5. Usando microtesouras e micropinças estéreis, separe a aorta do dorsal da coluna e do esôfago ventrally.É melhor utilizar a dissecção romba e utilizando um microscópio de dissecção para este.
   NOTA: Ao isolar a aorta, iniciar caudalmente na bifurcação ilíaca e mover-se cranialmente limpeza e separação da aorta a partir da superfície dorsal da cavidade cranial ou iniciar as carótidas e braquiocefálicos dissecação caudalmente. Qualquer método é apropriado e é até o conforto pesquisadores.
6. Remover o tecido adiposo perivascular usando microtesouras finas sendo certo não para remover uma porção da parede da aorta. Isto é essencial para minimizar o potencial de contaminação por fibroblastos quando a cultura de células musculares lisas da aorta.

Representative Results

Após a conclusão do processo, haverá uma aorta intacta proveniente do coração, descendo para as cavidades torácica e abdominal, com as artérias renais ainda ligado (Figura 1A). A partir daqui, a aorta pode ser visualizado in situ para quantificar as alterações morfométricas que são de diagnóstico no estudo de aneurismas da aorta abdominal (Figura 1B e 1C). Subsequentemente, a aorta pode ser removidas, fixadas e coradas para olhar para mudanças histológicas. A mancha geral e comum da aorta é a hematoxilina e eosina (Figura 2A e 2B). Além disso, a integridade estrutural da aorta pode ser qualitativamente quantificado utilizando a coloração de van Verhoff Geison olhar para as bandas elásticas (Figura 2C e 2D). Em vez de se obter uma análise histológica, o investigador pode piscar congelar a aorta para a proteína subseqüente e expre ácido ribonucléicossion. A última opção para o investigador é usar a aorta para obter o isolamento de células primárias. Estas células podem ser cultivadas em cultura (Figura 3A) e utilizados para uma variedade de estudos in vitro, incluindo estudos de viabilidade (Figura 3B) e localização de proteínas (Figura 3C).

Figura 1. Em imagens representativas in situ de aorta murino. (A) Representação da anatomia normal de ratinho após o isolamento da aorta incluindo o coração e os rins. (B) imagem ampliada de uma aorta abdominal de murino normal intacta. (C) de uma aorta abdominal doente ampliada com um aneurisma no suprarrenal região. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.

Figura 2. A análise histológica da aorta murino. (A) Imagem representativa de um HE mancha normal de uma aorta supra-renal saudável com ampliação de 20x. (B) Imagem representativa de um aneurisma da aorta supra-renal com trombo intramural após HE mancha com ampliação de 20x. (C) Imagem representativa de um Verhoff van Geison mancha, com destaque para as bandas de elastina de uma aorta supra-renal normal no aumento de 10x. (D) Imagem representativa de uma mancha Verhoff van Geison destacando as bandas elásticas de uma aorta desenvolver doença supra-renal observado pelo afinamento e striating de bandas de elastina e espessamento da camada adventícia. Por favor, click aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. miócitos aórticas cultivadas de aorta primários. (A) Imagem representativa de miócitos da aorta primárias em cultura, a ampliação de 20X obtidas a partir da aorta abdominal. (B) Imagem representativa de miócitos da aorta primária durante um ensaio de exclusão com azul de tripano após um tratamento de 500 uM de H ₂ O ₂ a ampliação de 20X obtidas a partir de da aorta abdominal. (C) Imagem representativa de uma mancha de imuno-histoquímica para a actina alfa em células musculares lisas da aorta isolados primários da aorta abdominal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical tape	3M	1527-1
Sterile gauze	Dukal Corporations	1312
25 gauge needle	BD	305122
10 ml syringe	BD	309604