Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Isolering och Excision av murina Aorta; En Mångsidig Teknik studien av kardiovaskulär sjukdom

Published: November 24, 2014 doi: 10.3791/52172

Introduction

Aortan spelar en central roll i kardiovaskulär funktion förse kroppen med syresatt blod och liknande till andra delar av kroppen, är mottagliga för sjukdomen. Vanliga aorta sjukdomar inkluderar åderförkalkning och aneurysm, vilket är resultatet av genetiska och miljömässiga faktorer, inklusive kost, rökning och stillasittande livsstil 1. Åderförkalkning är nedfallet av en kalcium- och lipidbaserat plack till aortaväggen normalt återfinns hos patienter med kronisk hyperlipidemi 2. Aneurysm kännetecknas av nedbrytning av de strukturella komponenterna i aorta och gallring av kärlväggen, följt av en ökad diameter som på sikt kan leda till bristning 3.

Djurmodeller är viktiga verktyg för att studera mekanismen för sjukdomen och effekt av potentiella behandlingar. Vanliga djurmodeller som används i kardiovaskulär forskning, särskilt forskning undersöker vaskulära och metabola sjukdomaromfattar genetiskt modifierade möss för att förändra lipidnivåer såsom apolipoprotein E-genen knockout och LDL-receptorgenen knockoutmöss 4. Majoriteten av metoder för att utvärdera sjukdomsmekanismer och effekt av terapi skulle inkludera isolering och excision av aorta.

När aortan är lokaliserad och isoleras, kan morfometrisk analys bestämmas, såsom förekomsten av aneurysm, typiskt definieras som en ökning i diameter 5 större än 50%. Efter behov på plats analysen är klar, kan aorta excideras för vidare analys. En exciderade aorta kan snabbfrystes att utföra molekylära studier såsom protein och / eller genuttryck-analyser eller fixeras med 4% paraformaldehyd och senare inbäddad, snittades och färgades för histologisk analys. Histologisk analys av aorta kan visa gemensamma drag i aortasjukdom såsom strukturell nedbrytning, plackbildning, och infiltration av leukocyter <sup> 6,7. Dessutom kan en utskuren aorta användas för att isolera primära cellinjer inkluderande endoteliala och glatta muskelceller som sedan kan användas för en mängd olika in vitro-studier 7.

För närvarande finns det inga andra metoder för att tillhandahålla denna djupgående karakterisering av aortasjukdom samt ge forskare med verktyg för att ytterligare studera hjärt-kärlsjukdom. Avbildningsmetoder såsom magnetisk resonanstomografi, datortomografi och ultraljud är de närmaste metoder för att morfologiskt utvärdera aorta, men detta är svårt i små djur och få en enhet med tillräckligt teknik är dyrt 8. Odödliggjorda cellinjer kan köpas för att undersöka potentiella sjukdomsmekanismer och effektivitet, men den konstgjorda karaktären av dessa celler är begränsande att studera effekterna på cell livscykel och apoptos 9.

Det övergripande målet fördetta manuskript är att demonstrera den sterila isolering och excision av den murina aorta i undersökningen av hjärt-kärlsjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes med godkännande av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Cincinnati och i enlighet med vägledningen för vård och användning av försöksdjur från National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, Revised 1996).

1. Förbereda Mouse

  1. Euthanize genom att exponera djuret till en supraterapeutisk dos dos av narkosmedel, isofluran inandning till effekt. Verifiera primära dödshjälp via tå nypa som en skadlig stimulus. Sekundär metod dödshjälp, membranskärning, kommer att ske i en kommande steg. Alternativa metoder kan användas beviljas dödshjälp erhålls.
  2. Sanitizie den yttre ytan av musen genom att spraya pälsen längs buken regionen, där de inledande nedskärningarna kommer att göras, med 70% etanol till den grad av fukt, så att pälsen är våt av etanol och eventuella lösa / torra hår inte in regionen.
  3. Placera musen på en surgiska styrelsen i ryggläge med övre och nedre bihang utvidgas utåt.
  4. Säkert bihang till styrelsen använder kirurgtejp.

2. Isolering av hjärtat och Aorta

  1. Efter korrekt positionering av mus använder pincett för att lokalisera och isolera bukhuden bara underlägsen xiphoid processen av bröstbenet.
  2. Skapa spänning genom att lyfta huden rakt upp och använda sax för att ta bort ytliga huden, utsätta den överlägsna del av bukhinnan och sämre delen av brösthålan.
  3. Ange bukhålan genom att lyfta xiphoid processen och göra sido snitt bara sämre för processen längs subcostal marginaler.
  4. Dissekera upp i brösthålan, går igenom membranet, är säker på att inte SARGA hjärtat eller några större blodkärl.
  5. Förläng de laterala snitt görs i steg 2,3 kranialt för att avlägsna den främre delen av bröstkorgen. Omnödvändigt, att befria hjärtat från den främre bröstväggen med hjälp dissektion.
  6. Rengör brösthålan av främmande blod och vätska genom steril gasbinda för att absorbera material. När området är mer synliga, ta bort lungorna för att bättre exponera hjärtat och stora kroppspulsådern.

3. Perfusion av hjärta och Aorta

OBS: För att få blod via hjärtpunktering, göra det precis innan det här steget.

  1. Fyll en 10 cc spruta med 10 ml steril iskall 1x fosfatbuffertlösning (PBS), och bifoga en 25 gauge nål på sprutan.
  2. Försiktigt in nålen i vänster kammare i hjärtat.
  3. Skär höger förmak att lindra tryckuppbyggnad från perfusion. Perfundera innehållet i sprutan i musen över 2-3 min.
  4. Använd steril gasbinda vid öppningen i höger förmak för att absorbera perfusionsfluidum.

4. Isolering och Excision av aorta

  1. Vid slutförandet av perfusion, använd steril gasbinda för att absorbera eventuell kvarvarande vätska grumling synfältet inom brösthålan.
  2. Exponera de gastrointestinala innehållet genom att skära kaudalt genom bukväggen, utvidga snittet till suprapubic området. Utöka snittet ytterligare mot de nedre extremiteterna bilateralt för att skapa hud klaffar som kan nålas ner eller utskurna.
  3. Avlägsna loberna i levern, bukspottkörteln, magen, mjälte och tarmar att bättre visualisera aorta. Var försiktig när dissekera nära perirenalt regionen, eftersom aorta är ytlig på grenarna i njurartärerna.
    OBS: Utför detta steg på ett exakt och immatrikulera sätt magtarmkanalen är rikt med bakterier som ökar benägenheten för kontamination.
  4. Skölj området med 1x PBS och ta bort all vätska genom absorption med en steril gasbinda.
  5. Använda sterila microscissors och microforceps, separera aorta från ryggraden dorsalt och matstrupen ventralt.Det är bäst att använda trubbig dissektion och utnyttjande av ett dissektionsmikroskop för detta.
    OBS: Vid isolering aortan, börja kaudalt vid höftbifurkationen och flytta kranialt rengöring och separering av aorta från den dorsala ytan av kaviteten eller starta kranialt vid karotidema och brachiocephalic artärer dissekera kaudalt. Båda metoderna är lämpliga och är upp till forskare komfort.
  6. Avlägsna perivaskulära fettvävnad med fina microscissors vara säker på att inte ta bort en del av aortaväggen. Detta är nödvändigt för att minimera risken för förorening fibroblast vid odling aorta glatta muskelceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter avslutad förfarandet, kommer det att finnas en intakt aorta ursprung från hjärtat, fallande i bröst- och bukhålans med njurartärerna fortfarande sitter (Figur 1A). Härifrån kan aorta avbildas på plats för att kvantifiera morfometriska förändringar som är diagnostiska i studien av bukaortaaneurysm (Figur 1B och 1C). Därefter kan aortan avlägsnas, fixeras och färgas för att titta på histologiska förändringar. En generell och gemensam fläck av aortan är det hematoxylin och eosin fläck (Figur 2A och 2B). Dessutom kan den strukturella integriteten av aorta skall kvalitativt kvantifieras med hjälp Verhoff van Geison färgning för att titta på elastin banden (fig 2C och 2D). Istället för att få en histologisk analys, utredaren kan blinka frysa aorta för efterföljande protein och ribonukleinsyra expression. Det sista alternativet för utredaren är att använda kroppspulsådern för att erhålla primära cellisolering. Dessa celler kan odlas i kultur (figur 3A) och används för en mängd av in vitro-studier, inkluderande livsduglighetsstudier (figur 3B) och proteinlokalisering (figur 3C).

Figur 1
Figur 1. In situ representativa bilder av murin aorta. (A) Visning av normal mus anatomi efter isoleringen av aorta inklusive hjärta och njurar. (B) Förstorad bild av en normal intakt murin bukaortan. (C) Förstorad bild av en sjuk abdominellt aorta med en aneurysm i den suprarenala region. Klicka här för att se en större version av thär siffran.

Figur 2
Figur 2. Histologisk analys av murina aorta. (A) representant bild av en normal hematoxylin och eosin fläck av en hälsosam suprarenala aorta vid 20X förstoring. (B) representant bild av en aneurismal suprarenala aorta med intramural tromb efter hematoxylin och eosin fläck vid 20X förstoring. (C) representant bild av en Verhoff van Geison fläck, belyser de elastin band av en normal suprarenala aorta vid 10X förstoring. (D) representant bild av en Verhoff van Geison fläck belyser elastin band av en suprarenala aorta utveckla sjukdomen noterades av gallring och striating av elastin band och förtjockning av den adventitiala skiktet. Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Primära aorta myocyter odlas från aorta. (A) Representativa bild av primära aortiska myocyter i odling vid 20X förstoring erhålls från bukaortan. (B) Representativa bild av primära aorta myocyter under en exklusion med trypanblått efter en 500 uM behandling av H 2 O 2 vid 20X förstoring erhållen från bukaortan. (C) representant bild av en immunohistokemi fläck för alfa aktin i primära isolat aorta glatta muskelceller från bukaortan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Författarna har inga bekräftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Med-Vet International #RXISO-250
70% ethanol Fisher 07-678-001
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P5368-10PAK
Surgical tape 3M 1527-1
Sterile gauze Dukal Corporations 1312
25 gauge needle BD 305122
10 ml syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), 28-292 (2014).
  2. Ross, R., Harker, L. Hyperlipidemia and atherosclerosis. Science. 193 (4258), 1094-1100 (1976).
  3. Clouse, W. D., et al. Acute aortic dissection: population-based incidence compared with degenerative aortic aneurysm rupture. Mayo Clin Proc. 79 (2), 176-180 (2004).
  4. Daugherty, A., Cassis, L. A. Mouse models of abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).
  5. Pleumeekers, H. J., et al. Aneurysms of the abdominal aorta in older adults. The Rotterdam Study. Am J Epidemiol. 142 (12), 1291-1299 (1995).
  6. Brophy, C. M., Reilly, J. M., Smit, G. J., Tilson, M. D. The role of inflammation in nonspecific abdominal aortic aneurysm disease. Ann Vasc Surg. 5 (3), 229-233 (1991).
  7. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  8. Weiss, R. G. Imaging the murine cardiovascular system with magnetic resonance. Circ Res. 88 (6), 550-551 (2001).
  9. Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. J Vis Exp. (79), 50289 (2013).
  10. Wassef, M., Upchurch, G. R. Jr, Kuivaniemi, H., Thompson, R. W., Tilson, M. D. 3rd Challenges and opportunities in abdominal aortic aneurysm research. J Vasc Surg. 45 (1), 192-198 (2007).

Tags

Medicin Cardiovascular aorta mus isolering kirurgi excision anatomi
Isolering och Excision av murina Aorta; En Mångsidig Teknik studien av kardiovaskulär sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., More

Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (93), e52172, doi:10.3791/52172 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter